全 文 ：图 4 　诱导球茎及球茎生长
Fig. 4 　Corms induction and growth
3 　讨论与结论
311 　愈伤组织诱导 :一般认为诱导愈伤组织成败关
键在于培养的条件。本实验通过考察 3 种不同培养
基的影响 ,确定 MS 为适合番红花愈伤组织诱导的
培养基 ,其结果与陈书安等的报道一致[4 ] 。植物生
长调节剂是诱导愈伤组织极为重要的因素 ,不同质
量浓度激素配比的 MS 培养基中 ,MS + 2. 0 mg/ L
NAA + 0. 5 mg/ L 62BA 培养基适合诱导愈伤组织 ,
而且诱导率也高于 MS 培养基。光照条件下愈伤组
织生长缓慢 ,且褐化很严重 ,暗培养诱导速度较快 ,
不易褐化 ,说明光照不利于番红花愈伤组织诱导 ,而
暗培养有利于愈伤组织脱分化。
312 　丛生芽的诱导 :组织培养中的器官发生包括外
植体直接分化成器官的直接发生方式和外植体先脱
分化形成愈伤组织再分化成器官的间接发生方式。
脱分化过程从细胞分裂的启动开始 ,经过分裂形成拟
分生组织或分生组织中心 ,随后形成器官原基。器官
原基的形成受外界因素和体内生理生化因素的调节。
器官分化对生长调节剂的需要是必不可少的 ,所以对
生长调节剂的研究也是人们进行组织培养工作时关
注的焦点之一。本试验采用不同质量浓度配比的 62
BA 和 NAA 诱导丛生芽 ,在适宜的条件下 ,脱分化后
的愈伤组织能够再分化 ,诱导出丛生芽。
313 　球茎诱导 :在诱导球茎时 ,所需时间较长 ,球茎
生长很缓慢 ,诱导技术有待于进一步深入研究。
参考文献 :
[ 1 ] 　江苏中医学院1 中药大词典 (下册) [ M ]1 上海 :上海人民出
版社 , 19771
[ 2 ] 　王康才 , 徐德然 , 唐晓清 , 等 1 中药材种养关键技术丛书
[ M ]1 南京 :江苏科学技术出版社 , 20021
[ 3 ] 　Hyouta H , Mat sushima H , Sano K1 Scanning elect ron mi2
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ma and style2like st ructures [J ]1 Plant Sci , 1988 , 58 : 932
1021
[ 4 ] 　陈书安 , 王晓东 , 赵　兵 , 等1 藏红花球茎愈伤组织快速诱
导的研究 [J ]1 中国药学杂志 , 2003 , 38 : 25422561
三七及栽培土壤中烯酰吗啉残留降解动态研究
张文斌1 ,冯光泉1 ,2 3 ,曾鸿超1 ,刘云艺1 ,武中翠1 ,周家明1 3
(11 文山三七研究院 ,云南 文山 　663000 ; 21 文山三七科技创新中心有限公司 ,云南 文山 　663000)
摘 　要 :目的 　确立了烯酰吗啉在三七及其栽培土壤中的一种分析方法。方法 　三七和土壤样品用丙酮提取 ,正
己烷和醋酸乙酯液液萃取 ,用固相萃取法 (弗罗里硅土小柱) 净化 ,然后用液相色谱检测。结果 　烯酰吗啉在三七
块根内的半衰期为 6. 2 d ,在三七茎叶内的半衰期为 3. 9 d ,在土壤中的半衰期为 5. 0 d ;在三七生长过程中 ,按常规
剂量施用烯酰吗啉农药 6 次 ,间隔期 25 d 以上 ,最后一次施药距采挖时间 30 d 以上 ,三七植株中烯酰吗啉的残留
量低于日本肯定列表对三七中烯酰吗啉残留限量标准 ( ≤0. 1 mg/ kg) ,栽培土壤中烯酰吗啉的残留量小于 0. 02
mg/ kg。结论 　在三七上规范喷施烯酰吗啉可溶性粉剂 ,烯酰吗啉在三七植株和土壤中的降解较快 ,三七质量安
全 ,不会对土壤环境造成污染。
关键词 :三七 ;烯酰吗啉 ;降解
中图分类号 :R28216 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2009) 05 0809 04
　　烯酰吗啉 (dimethomorph) 商品名安克、Acrobat、
WL 127294、CME151 等 ,化学名称为 42[32(42氯苯基)2 32(3 ,42二甲氧基苯基)丙烯酰基 ]吗啉 , Z 与 E两种构型的比一般为 4 ∶1。CAS号为 11048827025 ,分子式为
·908·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
3 收稿日期 :2008206229　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :云南省科技攻关项目 (2005N G07)
作者简介 :张文斌 (1974 —) ,男 ,苗族 ,云南文山人 ,助理研究员 ,理学学士 ,主要从事中药材栽培环境和质量检测分析研究工作 ,获省级
科技进步奖 1 项 ,州级科技进步奖 4 项。3 通讯作者　冯光泉
C21 H22 ClNO4 ,相对分子质量为 387. 9。
烯酰吗啉能阻止孢子形成 ,对霜霉属、疫霉属病菌
有特效 ,可用于防治黄瓜霜霉病、番茄晚疫病、马铃薯
晚疫病、甜椒疫病等[1 ] ;对防治三七霜霉病和疫病效果
显著 ,是目前三七上常用农药之一 ,也是日本肯定列表
针对三七列入的限量农药之一。本实验开展烯酰吗啉
在三七植株和土壤中的降解过程和最终残留研究 ,为
三七生产过程中的施药安全提供科学依据。
1 　材料与方法
111 　供试材料 :烯酰吗啉原药 ,济南普兰德生物科
技有限公司生产 ,农药登记证号 :L S20053364 ,生产
批准证号 HN P370912D3073 , 产品标准证号 Q/
Q H K10822005 ;供试对象为二年生三七 ;试验地点
在砚山郊址文山州三七研究所试验基地。
112 　田间试验设计
11211 　烯酰吗啉在三七块根、茎叶及土壤中的残留
消解试验 :根据供试农药试验处理设置为 3 次重复 ,
1 个空白对照 ,每小区为 1 空 ,每空 3. 24 m2 ,试验共
有 4 空。在三年生三七采挖前 1 个月 ,将烯酰吗啉
兑水稀释成常规使用浓度 (计算为 0. 85 g/ 小区) 喷
洒到三七植株上 ;于施药后 1 h 和 1、3、5、7、15、20 d
在每小区内随机采集三七茎叶、块根和表层 0～10
cm 的土壤样品 ,做残留量测定。
11212 　烯酰吗啉在三七上的最终残留试验 :将供试
的烯酰吗啉原药设置两个使用质量浓度 ,分别为 C
处理 (1. 00 g/ 小区) 、D 处理 (1. 25 g/ 小区) ,每处理
3 次重复 ,每小区为 1/ 2 空 ,每空 1. 62 m2 ,试验共有
7 个小区 ,1 个空白对照。最后一次施药距离采挖
30 d。在距离采挖前 3、5、7、15、20 d 分别采集三七
茎叶、块根和表层 0～10 cm 的土壤样品一次 ,进行
残留量测定。采集的三七茎叶、块根和土壤样品若
不能立即分析 ,需于零下 20 ℃冰柜中保存。
113 　残留分析
11311 　仪器设备 :高效液相色谱仪 ,色谱柱 (250
mm ×4. 6 mm)柱填充剂为十八烷基甲硅烷基化硅
胶 (粒径 5μm) ;色谱工作站 ,高速组织捣碎机 ,超纯
水机 ,预处理小柱 ,常规玻璃仪器等。
11312 　试剂 :99. 0 %烯酰吗啉对照品 (货号 RBDR2
C12710000 ,德国生产 ,购自上海楚柏实验室设备有
限公司) ,丙酮、醋酸乙酯、氯化钠、无水硫酸钠等分
析纯试剂 ,甲醇色谱纯 ,去离子水。
11313 　样品提取及净化[2 ]
1)提取 :现采 (或零下 20 ℃冰柜中保存)鲜三七
样搅碎混合均匀后准确称取 20. 0 g 于 150 mL 的磨
口三角瓶 ,加入 50 mL 丙酮 ,超声提取 15 min ,用涂
布 1 cm 厚硅藻土的滤纸抽滤于磨口减压浓缩器中。
取出滤纸上的残留物 ,再加入 25 mL 丙酮 ,超声提
取 15 min 后 ,按上述同样操作 ,合并滤液于减压浓
缩器中 ,40 ℃以下浓缩至约 20 mL 。将其移入预先
注入 50 mL 10 %氯化钠溶液的 300 mL 分液漏斗
中。用 50 mL 醋酸乙酯2正己烷 (1 ∶1) 混合溶液洗
涤上述减压浓缩器的茄型瓶 ,合并洗液于上述分液
漏斗中。用振荡器激烈振荡 5 min 后 ,静置 ,醋酸乙
酯和正己烷层移入 300 mL 三角瓶中。水层中加入
25 mL 醋酸乙酯2正己烷 (1 ∶1) 混合溶液 ,按上述同
样操作。合并醋酸乙酯和正己烷层于上述三角瓶
中。加入适量无水硫酸钠 ,不时振荡、混合 ,放置 15
min 后 ,滤入磨口减压浓缩器中。再用 20 mL 醋酸
乙酯2正己烷 (1 ∶1)混合溶液洗涤上述三角瓶 ,以此
洗涤液洗涤滤纸上的残留 ,重复操作 2 次。合并两
洗涤液于上述减压浓缩器中 ,40 ℃以下除去醋酸乙
酯和正己烷。残留物中加入 10 mL 丙酮2正己烷
(3 ∶17)混合溶液溶解。
2)净化 :在内径 15 mm、长 300 mm 色谱管中注
入 5 g 悬浮在正己烷中的柱色谱用合成硅酸镁 ,其
上面再装入约 5 g 无水硫酸钠 ,放出正己烷至柱上
端留有少量正己烷。柱中注入提取所得的溶液后 ,
注入 90 mL 丙酮2正己烷 (3 ∶17) 混合溶液 ,弃去流
出液。再注入 100 mL 丙酮2正己烷 (3 ∶7) 混合溶
液 ,收集流出液于磨口减压浓缩器中 ,40 ℃以下除
去丙酮和正己烷。残留物中加入 1. 5 mL 甲醇溶
解 ,加水定容至 5 mL 。在十八烷基甲硅烷基化硅胶
小柱 (360 mg)中注入 10 mL 乙醇 ,弃去流出液。再
注入 10 mL 水 ,弃去流出液。柱中注入上步所得的
5 mL 溶液 ,加入 15 mL 水2乙醇 (7 ∶3)混合溶液 ,弃
去流出液。注入 10 mL 乙腈2水 (1 ∶1)混合溶液 ,收
集流出液于磨口减压浓缩器中 ,40 ℃以下除去乙腈
和水。残留物中加入水2乙醇 (1 ∶1) 混合溶液溶解。
准确至 5 mL 待测。
3)土壤样品的处理 :取现采 (或零下 20 ℃冰柜
保存)土壤样品 20. 0 g ,用 50 mL 丙酮提取 ,正己烷
和醋酸乙酯液液萃取 ,用固相萃取法 (弗罗里硅土小
柱)净化[3 ] 。浓缩残留物中加入水2乙醇 (1 ∶1) 混合
溶液溶解。准确至 5 mL 待测。
11314 　色谱条件 :流动相为水2甲醇 (1 ∶4) ;柱温 :
40 ℃;检测器 :波长 250 nm ;体积流量 : 0. 8 mL/
min ,烯酰吗啉 ( E 体) 约 6. 5 min 流出 ,烯酰吗啉 ( Z
体) 7. 5 min 流出 (图 1) 。
·018· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
图 1 　对照品( A) 、三七( B) 、土壤样品( C)色谱图
Fig. 1 　Chromatogram of reference substance ( A) , P1 notoginseng ( B) , and soil sample ( C)
11315 　标准曲线 :精密称取 10 mg 烯酰吗啉对照
品 ,用乙醇溶解 ,逐级稀释 ,配制成烯酰吗啉 ( E 体)
0. 05、0. 1、0. 2、0. 25、0. 5μg/ mL ,烯酰吗啉 ( Z) 体
0. 2、0. 4、0. 8、1. 0、2. 0μg/ mL 的标准系列 ,按色谱
条件进样 ,烯酰吗啉 ( E 体) 在 0. 05～0. 5μg/ mL 质
量浓度 ,烯酰吗啉 ( Z 体) 0. 2～2. 0μg/ mL 线性关系
良好 ,回归方程分别为烯酰吗啉 ( E 体) : Y = 1 937 .
6 X + 1 518 . 9 , r = 0 . 999 8 ;烯酰吗啉 ( Z 体) : Y =
1 938 X + 338 . 1 , r = 0 . 999 3。
11316 　加样回收率试验 :取已知质量浓度的同一三
七样品供试液 3 份 ,每份 10 mL 分别添加 0. 5μg/
mL 的烯酰吗啉标准液 5. 0、10. 0 和 20. 0 mL ,各取
10μL 进样 ,得平均回收率 97. 6 % ,RSD 为 2. 93 %。
11317 　精密度试验 :取同一三七样品 ,制备供试品
溶液 ,取 10μL 连续进样 6 次 ,色谱峰面积 RSD 为
1. 19 %。
11318 　重现性试验 :取同一三七样品 6 份 ,制备供
试品溶液 ,各取 10 μL 进样分析 ,色谱峰面积的
RSD 为 0. 97 %。
11319 　稳定性试验 :取同一三七样品 ,制备供试品
溶液 ,取 10μL 分别于 1、2、4、8、16、24 h 进样 ,色谱
峰面积 RSD 为 1. 53 %。
2 　结果与分析
211 　烯酰吗啉在三七块根、茎叶及土壤中的降解规
律探讨 :从图 2 和表 1 可以看出 ,烯酰吗啉在土壤和
茎叶中 1～5 d 消解速度较快 ;而三七作为根部吸
收 ,第 5 天达最高值 ,5 d 后开始降解。根据消解方
程 Ct = Coe - kt ( Ct 为时间 t 时的农药残留量 , Co 为
施药后的原始沉积量 , k 为消解系数 , t 为施药时
间 ) ,其在三七、茎叶及土壤中的消解方程及半衰期
如下 : Ct = 0. 621 1e - 0. 111 6t , r2 = 0. 896 1 , t 1/ 2 = 6. 2 ;
Ct = 0. 661 8e - 0. 175 7 t , r2 = 0. 940 7 , t 1/ 2 = 3. 9 , Ct =
0. 592 8e - 0. 138 5t , r2 = 0. 915 4 , t1/ 2 = 5. 0。
图 2 　三七块根、茎叶及土壤中烯酰吗啉残留折线图
Fig. 2 　Curves of roots , stems , and leaves of P1 no2
toginseng and dimethomorph residue in soil
表 1 　三七块根、茎叶及土壤中烯酰吗啉残留量
Table 1 　Roots , stems , and leaves of P. notoginseng
and dimethomorph residue in soil
采样时间/ d 烯酰吗啉块根/ (mg ·kg - 1 ) 茎叶/ (mg ·kg - 1 ) 土壤/ (mg ·kg - 1 )
1/ 24 0. 171 2 0. 755 1 0. 615 8
1 0. 195 3 0. 642 1 0. 565 2
3 0. 264 1 0. 363 4 0. 436 5
5 0. 319 6 0. 241 6 0. 283 2
7 0. 278 5 0. 135 9 0. 145 3
15 0. 169 2 0. 058 4 0. 089 6
20 0. 052 1 痕量 痕量
2. 2 　烯酰吗啉在三七、茎叶及土壤中的最终残留结
果 :按两个常规浓度施药 6 次后采样检测 ,从表 2 看
出 ,使用量为 0. 617 g/ m2 (1 000 倍液) 时 ,三七块
根、茎叶及土壤中烯酰吗啉残留分别为 0. 076、
0. 012和 0. 011 mg/ kg ;当使用 0. 771 g/ m2 (1 000
倍液) 时 ,其烯酰吗啉残留分别为 0. 089、0. 028 和
0. 015 mg/ kg。
表 2 　三七块根、茎叶及土壤中烯酰吗啉残留量
Table 2 　Roots , stems , and leaves of P. notoginseng and dimethomorph residue in soil
最后一次施药后
采样时间
施 0. 617 g/ m2 (1 000 倍液)残留量/ (mg ·kg - 1 )
三七 茎叶 　土壤
施 0. 771 g/ m2 (1 000 倍液)残留量/ (mg ·kg - 1 )
三七 茎叶 土壤
1 h 0. 243 0. 293 0. 265 0. 284 0. 353 0. 271
1 d 0. 271 0. 263 0. 237 0. 292 0. 287 0. 243
3 d 0. 325 0. 241 0. 158 0. 356 0. 259 0. 162
5 d 0. 238 0. 105 0. 119 0. 249 0. 129 0. 128
7 d 0. 167 0. 086 0. 067 0. 213 0. 108 0. 072
15 d 0. 113 0. 033 0. 012 0. 175 0. 076 0. 019
20 d 0. 076 0. 012 0. 011 0. 089 0. 028 0. 015
·118·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
3 　结论
3. 1 　三七上喷施烯酰吗啉可溶性粉剂 ,其在三七块
根内的半衰期为 6. 2 d ,茎叶内的半衰期为 3. 9 d、在
土壤中的半衰期为 5. 0 d ,尤其在三七植株和土壤中
的降解较快。
3. 2 　三七生长过程中 ,按常规浓度和频次施用烯酰
吗啉 ,最后一次施药距采挖时间 25 d 以上 ,其在三
七及茎叶中烯酰吗啉残留量小于日本肯定列表规定
三七中烯酰吗啉限量 ( ≤0. 1 mg/ kg) ,在土壤中的
残留量为低于 0. 02 mg/ kg。
按三七传统栽培方法 ,为节约成本和降低农药
残留 ,在三七采挖前一月左右 ,不再施用农药 ,就烯
酰吗啉而言 ,只要控制好用药剂量和间隔期 ,既可有
效防治三七病害 ,又可保证三七质量安全。
参考文献 :
[ 1 ] 　宋春国 , 于建垒 , 李瑞娟 , 等1 烯酰吗啉在黄瓜中的残留消
解动态 [J ]1 中国蔬菜 , 2006 , 11 : 282291
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方法研究 [J ]1 农药科学与管理 , 2006 , 27 (1) : 7291
含羞草中 6 种黄酮苷的 RP2HPLC测定
朱建鑫1 ,2 ,袁 　珂1 3
(1. 浙江林学院 天然药物研发中心 ,浙江 临安 　311300 ;2. 河南中医学院药学院 ,河南 郑州 　450008)
摘 　要 :目的 　建立 RP2HPLC 法同时测定含羞草中 6 种黄酮苷的量。方法 　采用高效液相色谱法 ,色谱柱为 Wa2
ters XBridge C18柱 (250 mm ×4. 6 mm , 5μm) ,流动相 :甲醇 (A)21 %冰醋酸水溶液 (B) (25 ∶75) ,体积流量 0. 8
mL/ min ,柱温 25 ℃,检测波长 340 mm。结果 　6 个成分均能达到基线分离 ,异荭草苷 ( Ⅰ) 、荭草苷 ( Ⅱ) 、5 ,7 ,3′,
4′2四羟基282C2[α2L2鼠李糖2(1 →2) ]2β2D2葡萄糖苷 ( Ⅲ) 、牡荆苷 ( Ⅳ) 、异牡荆苷 ( Ⅴ) 、5 ,7 ,3′,4′2四羟基282C2[β2D2
芹糖2(1 →4) ]2β2D2葡萄糖苷 ( Ⅵ) 的线性范围分别为 0. 260～1. 300 μg ( r = 0. 999 9) , 0. 490～2. 450 μg ( r =
0. 999 9) ,0. 700～3. 500μg ( r = 0 . 999 9) ,0. 276～1. 380μg ( r = 0. 999 8) ,0. 266～1. 330μg ( r = 0. 999 9) ,
0. 750～3. 750μg ( r = 0. 999 7) ;平均回收率分别为 98. 6 % ( RSD = 2. 31 %) ,98. 2 % ( RSD = 2. 04 %) ,96. 4 %
( RSD = 1. 85 %) ,96. 9 % (RSD = 1. 47 %) ,97. 3 % (RSD = 2. 19 %) ,97. 5 % (RSD = 1. 76 %) 。结论 　本研究所建立
的方法操作简便、结果可靠 ,为该类药材的入药及资源的质量评价提供了实验依据。
关键词 :含羞草 ;黄酮苷 ;RP2HPLC
中图分类号 :R28216 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2009) 05 0812 03
　　含羞草为豆科 (Leguminosae) 含羞草属植物含
羞草 M i mosa p u dica L . 的全草[1 ] 。原产于热带美
洲 ,现广泛分布于世界热带地区 ,我国主要分布在华
南、华东、西南等地的山坡丛林、湿地、路旁 ,植物资
源丰富。含羞草具有清热利尿、化痰止咳、安神止痛
之功效 ,临床多用于急性肝炎、肺结核咳血及带状疱
疹等症[2 ] 。在前期研究中 ,已从含羞草全草中分离
得到了黄酮苷类、酚类等化合物[3～7 ] 。在上述研究
的基础上建立了含羞草中 6 种黄酮苷的 HPL C 测
定方法 ,并对采自不同地区的含羞草叶及茎进行了
定量测定分析 ,为有效控制含羞草的质量及进一步
开发利用含羞草资源提供了参考依据。
1 　仪器、试剂与材料
Waters 2695 高效液相色谱仪 , Waters 2996
PAD 检测器 ; Empower 色谱工作站 ; AB2652S 分析
天平 (瑞士 Mettler Toledo 公司) ,Millipore 超纯水
机 (法国 Millipore 公司) ,甲醇、乙腈为色谱纯试剂 ,
水为超纯水 ,其他试剂均为分析纯。
5 ,7 ,3′,4′2四羟基282C2[α2L2鼠李糖2(1 →2) ]2β2
D2葡萄糖苷、5 ,7 ,3′,4′2四羟基282C2[β2D2芹糖2(1 →
4) ]2β2D2葡萄糖苷、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆
苷 6 种对照品均由本实验室分离得到 ,通过1 H2NMR
和13 C2NMR、MS测定[3～7 ] ,并与相关文献报道对比确
证了结构 ,且通过 HPLC峰面积归一化法标定质量分
数均在 98 %以上。含羞草样品于 2007 年 8 月分别采
自三亚、南宁、广州及福州不同地区 ,由海南大学药用
·218· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
3 收稿日期 :2008208204　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :浙江省森林培育重中之重学科开放基金资助项目 (200607)
作者简介 :朱建鑫 (1984 —) ,男 ,硕士 ,主要从事中药化学成分研究。3 通讯作者　袁　珂　Tel : (0571) 63743607 　E2mail :yuan_ke001 @163. com