全 文 ：·1320． 中草黄ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9,El
一种具有胰蛋白酶抑制活性的半夏蛋白的纯化与
N端氨基酸序列分析
王厚伟
(山东中医药大学药学院，山东济南250355)
摘 要：目的 分离纯化具有胰蛋白酶抑制活性的半夏蛋白，分析其对胰蛋白酶的抑制活性、抑制机制与N端氨基
酸序列。方法 采用以胰蛋白酶为配体的亲和色谱和SephadexG一50凝胶过滤法，从半夏蛋白粗提液的40％
(NH．)：S0．沉淀中分离纯化活性半夏蛋白，采用12％SDS—PAGE鉴定其纯度，并估算其相对分子质量；采用Ed．
man降解法分析其N一端氨基酸序列。结果纯化的活性半夏蛋白经SDS--PAGE检测呈现单一条带，相对分子质
量为1．4×10‘I比活力为1059．012U／mg，活力回收率为24．40％I对胰蛋白酶的质量抑制比为1，4．72，抑制常
数(Ki)为7．17×101mol／L；其N端前6个氨基酸残基顺序为DPVVDG。结论该活性半夏蛋白是一种丝氨酸蛋
白酶抑制剂，为胰蛋白酶的竞争性抑制剂。
关键词：半夏蛋白；胰蛋白酶抑制剂；分离纯化IN端氨基酸序列
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)07—1320—04
Purificationofaproteinw thtrypsin—inhibitingact v tyfromRhizomaPinelliae
andanalysisoftsN—terminalaminoacidsequence
WANGHou—wei
(CollegeofPharmacy，ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China)
Abstract：ObjectiveTopurifya RhizomaPinelliaeprotein，determineitsinh bitingactivityand
mechanismtotrypsin，andanalyzeitsN—terminalaminoacidsequence．MethodsActiveRhizoma
Pinelliaeproteinwaspurifiedfromthe40％(NH‘)2SO‘sedimentofthecrudeextractedproteinfrom
RhizomaPinelliaebyffinitychromatographyoftrypsin--SepharoseCL4B ndgelfiltrationofSephadex
G-50；12％ofSDS—PAGEwasusedfordeterminingthepurityofthepurifiedRhizomaPinelliaeprotein
andestimatingitsmolecularweight；N—terminalaminoacidsequenceofactiveRhizomaPinelliaeprotein
wasanalyzedbyE mandegradation．ResultsThepurifiedactiveRhizomaPinelliaeproteinshowedasin—
glebandonSDS—PAGEgel，whichestimatedmolecularweightwasabout1．4×104，itsspecificactivitywas
1059．012U／mg，andtheyieldwasabout24．40％；TheN—terminalsequenceoftheprecedings xamino
acidresiduesofactiveRhizomaPinelliaeproteinwasDPVVDG：ThequalitynhibitingratioofactiveRhi—
zoznaPinelliaeproteintotrypsinwas1 l 4．72，andtheKivalue，thein ibitionconstantwasabout7．17×
10一mol／L．ConclusionActiveRhizomaPinelliaeproteiniSakindofserineproteaseinhibitor，acom—
petiveinhibitortOtrypsin．
Keywords：RhizomaP nelliaeprotein；trypsininhib tor；isolationandpur fication；N—terminalamino
acidsequence
半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternate
(Thunb．)Breit．的块茎，含有生物碱、有机酸、蛋白
等成分，在中医l临床上可单独或配伍使用，用于多种
疾病的治疗，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结，消
肿止痛的功效，对多种肿瘤细胞的增殖也具有抑制
作用[1’2]。胰蛋白酶抑制剂广泛存在于动、植物及微
生物体内，是一种主要对丝氨酸蛋白酶系的多种蛋
白水解酶活性具有抑制作用的小分子蛋白质。胰蛋
白酶抑制剂可与蛋白酶的活性部位和变构部位结
合，抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的
酶，它在一系列的生理病理过程中起着关键性的调
控作用，是机体免疫系统的重要组成部分。因此本实
验采用以胰蛋白酶为配体的亲和色谱法从生半夏中
分离纯化得到一种具有胰蛋白酶抑制活性的半夏蛋
白，并对其抑制活性与N端氨基酸序列进行分析。
1材料与试剂
ABl491A型氨基酸测序仪(PE公司)，FD一
1D一50外挂式冻干机(上海)。
收稿日期：2008—02—29
基金项目：山东省教育厅资助项且(J06L17)，山东省优秀中青年科学家奖励基金资助项目(2007BSBl4087)I山东省中药理论与技术创
新团队资助项目
作者简介：王厚伟(1973一)，山东日照人，讲师，主要研究方向中药生物工程。Tel：(0531)82613129E—mail：houweiw@163．com
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1321·
半夏鲜品购自山东省菏泽市，经本校鉴定为半
夏P．ternate．(Thunb．)Breit．的块茎。胰蛋白酶与
底物N—benzoyl—dl—arginine—P—nitroaniline(hy—
drochloride)(BAPNA)均为Sigma公司产品；蛋白
质相对分子质量标准、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、
TEMED、Tris碱、牛血清白蛋白(BSA)均为Bio-
Rad公司产品；CNBr—activatedSepharoseCL一4B、
DEAESepharoseCL一6B、Sephadex一50均为
Phamarcia公司产品；其余试剂均为国产分析纯。
2方法与结果
2．1 活性半夏蛋白的提取与分离：称取新鲜半夏块
茎100g，洗净，加入10×提取缓冲液(o．05mol／L，
pH8．0，Tris—HCI)匀浆，8000r／min离心10min，
漂除上层固体脂类物质，收集上清液，冷冻干燥，得
半夏总蛋白冻干粉。冻干粉重新溶入适量提取缓冲
液中，采用分步盐析法，逐步加入质量浓度为40％、
60％、80％(NH‘)2S04，4℃静置2h，8000r／min
离心10min，收集各级沉淀，于4℃蒸馏水透析36
h(透析袋截留相对分子质量范围≥6000)，其间更
换透析液9次，8000r／min离心10min，上清液冷
冻干燥，称定质量。
以BAPNA为底物，参照文献报道[3]略有改进，
测定胰蛋白酶活性和胰蛋白酶抑制剂的活性。适量
样品溶入0．80mLTris—HCI(O．05mol／L，pH8．0)
缓冲液中，加入0．10mg／mL牛胰蛋白酶0．20mL，
37℃保温5min，加入1mmol／LBAPNA溶液
2．50mL，37℃反应5min，立即加入0．5mL质量
浓度为33％醋酸溶液终止反应。以不加抑制剂的试
样为对照，测定410nm处的吸光度(AⅢ)值。酶活
性单位定义为：在实验条件下，使AⅢ。达到0．1所
需的酶量为1个BAPNA单位。抑制剂活性单位定
义为：在相同条件下，降低1个酶活性单位所需的抑
制剂的量。蛋白的测定采用Folin一酚试剂法[4]，以牛
血清白蛋白(BSA)作为对照。
半夏总蛋白的各级(NH。)：SO。沉淀结果见表
1，可见总回收率为96．49％，活性半夏蛋白主要集
中于质量浓度为40％(NH。)。S0。沉淀中，比活力
是总蛋白的1．83倍，活力回收率为62．38％，沉淀
量为123．67mg，占总蛋白的34．13％；质量浓度
60％(NH．)。SO。的沉淀量最大，占总蛋白的
56．62％，含有部分活性半夏蛋白，比活力仅为总蛋
白的50％；质量浓度80％(NH．)：SO．的沉淀量最
小，检测不到活性半夏蛋白。
2．2活性半夏蛋白的纯化
2．2．1亲和色谱分离：参照Pharmacia产品说明书
(PharmaciaBiotechCNBr．．activatedSepharoseCL．．
寰1 (NH．)。so．盐析法分离活性半夏蛋白粗蛋白
及抑制活力检测
Table1 IsolationofactiveRMzomaPinelliaeprotein
incrudeproteinbysaltfractionation
with(NH．)2So．anddetermination
ofitsInhibitingactivity
4BInstructions，1998)，将适量胰蛋白酶与CNBr—
activatedSepharoseCL一4B偶联，制备亲和载体。以
质量浓度为40％(NH。)：So。沉淀作为活性半夏蛋
白粗品，称取20mg，溶于200mLTris—HCI平衡缓
冲液(o．05mol／L，pH8．0)中，12000r／rain离心
10min，取上清液，上亲和色谱柱，分别用含1mol／
LNaCl的平衡缓冲液、蒸馏水和pH2．4的HCl酸
化水洗柱，收集酸化水洗脱峰，并迅速滴加2．0
mol／LTris溶液中和，合并多次重复上样的洗脱峰
用于下一步纯化，见图1。可见活性半夏蛋白粗品经
亲和色谱分离，形成2个蛋白峰(A：∞。)，P1为盐洗
脱峰，未检测到活性半夏蛋白，P2为亲和吸附的活
性峰。
0．4
0．3
0．2
O．1
O．O
U IU：ZU30 40 ，U
管号(3mL／管)
图1胰蛋白酶一Sepharose4B亲和色谱图谱
Fig．IAffinitychromatogramontypsin—Sepharose4B
2．2．2凝胶过滤纯化：P2组分经Tris溶液中和
后，上SephadexG一50色谱柱，以0．05mol／LTris—
HCI缓冲液(pH8．O)洗脱，见图2。可见P2组分经
SephadexG一50分离后，形成4个蛋白峰，p1和p2
为活性半夏蛋白峰，活性主要集中于10～16号试管。
2．2．3SDS—PAGE检测[5]：分离胶浓度为12％，采
用考马斯亮蓝R一250染色。经12％SDS—PAGE纯
度检测，SephadexG一50分离的活性组分仅10～12
号试管(p1峰的前半部分)显示较为单一的蛋白条
万方数据
·1322· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
O．10
O．08
O．06
吨
0．04
O．02
0．00
0 5 1015ZUZ，30)3404550
管号(3mL／管)
图2 SephadexG·50凝胶过滤图谱
Fig．2ChromatogramofSephadexG一50gelfiltration
带，估算纯度达90％以上。收集、合并多次重复上样
的10～12号试管洗脱液，得纯化的活性半夏蛋白，
见图3。可见活性半夏蛋白粗品蛋白条带复杂，经亲
和色谱可去除大部分杂蛋白，仅保留两条明显主带。
再经凝胶滤过，获得较为均一的活性半夏蛋白主带，
其表观相对分子质量约为14000。
各纯化步骤的活性回收见表2。经亲和色谱分
离后比活提高了3．45倍，再经SephadexG一50分
离，得到均一组分，活性回收率为24．40％，活性半
夏蛋白纯化倍数为6．02倍。
2．3 活性半夏蛋白对胰蛋白酶抑制曲线：以0．05
mol／LTris—HCl(pH8．O)缓冲液配制10pg／mL活
l一40％(NH‘)2s0‘沉淀2一亲和色谱3一分子量标记
4一凝胶过滤
l一40％(NH‘)SO‘sediment2-affini ychromatograph
3-molecularmarker4-gelfiltration
图3活性半夏蛋白的SDS—PAGE
Fig．3SDS—PAGEofactiveR觚zomaPinelliaeprotein
裹2活性半夏蛋白的分离纯化过程
Table2 IsolationandpurificationofactiveRhizoma
Pinelliaeprotein
纯化步骤
总蛋白
／mg
总活力 比活力 活力回收
／u ／(U·mg一1)宰／％
性半夏蛋白溶液，依次稀释为5．00、2．50、1．25、
0．625弘g／mL，测定对胰蛋白酶的抑制活性，制备相
应的抑制曲线。结果表明活性半夏蛋白在O～4弘g
与胰蛋白酶的相对活性之间呈现良好的线性关系，
线性方程为Y=一23．265X+98．659(R2=
0．9988)，由此可以计算出饱和20pg的胰蛋白酶
所需活性半夏蛋白的量为4．24P-g(BAPNA作为
底物)，活性半夏蛋白对胰蛋白酶的质量抑制比为
1。4．72，摩尔抑制比为1t 2．82(胰蛋白酶的相对
分子质量为2．34×104)。
2．4抑制动力学实验：BAPNA底物浓度分别为
0．4、0．6、0．8、1．0mmol／L，测定胰蛋白酶反应速
度。根据Lineveaver—Burk作图法，在胰蛋白酶的反
应初速度范围内，进行活性半夏蛋白的抑制动力学
实验，确定抑制类型和抑制常数。由图4可见，活性
半夏蛋白为竞争性抑制类型；根据胰蛋白酶与
BAPNA反应的线性方程Y一2．6973X+1．3655
计算出K。值为1．98×10～mol／L，由0．52pg活
性半夏蛋白抑制胰蛋白酶与BAPNA反应的线性方
程Y=6．1667X+1．3575计算出K。7=4．54×
10～mol／L，已知反应液活性半夏蛋白的浓度为
9．29×10一mol／L，根据公式K。7=K。(1+[13／
Ki)，计算得出抑制常数Ki=7．18×10_6mol／L；同
理，根据0．15Pg活性半夏蛋白抑制胰蛋白酶与
BAPNA反应的线性方程Y一3．6043X+1．3255，
计算出抑制常数Ki=7．17×10一mol／L。Ki<<
K。，说明抑制剂和酶亲和力大于酶和底物的亲和
力。因而，活性半夏蛋白是一种抑制活力很强的抑制剂。
A
围4活性半夏蛋白抑制动力学图
Fig．4InhibitorydynamicsofactiveRhizoma
Pinelliaeprotein
2．5活性半夏蛋白的N一端氨基酸序列分析与同源
性比较：活性半夏蛋白纯品经SDS—PAGE电泳、转
膜后，测定N端氨基酸序列，见图5。根据测序结果，
可依次读出活性半夏蛋白的N一端前6个氨基酸残
基顺序为：1-DPVVDG一6。
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9,El·1323·
残基2
t／rain
图5活性半夏蛋白的N末端氨基酸序列分析的
HPLC图谱
Fig．5HPLCChromatogramS fNterminalaminoacid
sequenceofactiveRhizomaPinelliaeprotein
经NCBI的Blast程序检测，活性半夏蛋白的N
端前6个氨基酸序列与慈菇蛋白酶抑制剂A、B完
全相同，只有第6个氨基酸残基存在差异，前者为甘
氨酸残基，后者为丝氨酸残基，二者的同源性高达
80％以上，见表3。
表3 5种蛋白酶抑制剂N端氨基酸序列和同源性比较
Table3 NTerminalaminoacidsequence
offivekindsofproteaseinhibitors
andcomparisonoftheirhomology
编号 名 称 N端氨基酸序列 同源性
半夏胰赁曰鳙柙利刑
BAA02972．1篇嚣奉BAA02973．1淼
1818181A甍蔓萋宁酶
那利刑A
蘸菇蛋白醴
1208229A
抑制剂B
1DPVVDG6 5／6(83．33％)
25DPVvDS30
5／6(83．33％)
25DPWDS30
5／6(83．33％)
1DPVVDS6 5／6(83．33％)
1DPVVDS6
5／6(83．33％)
3讨论
活性半夏蛋白的N端前6个氨基酸残基顺序
与慈菇丝氨酸蛋白酶抑制剂的N端序列高度同源，
同源性达83％以上；活性半夏蛋白对胰蛋白酶活性
具有强烈的抑制作用，与胰蛋白酶之问有很强的亲
和力(Ki<丝氨酸蛋白酶抑制剂，根据Lineveaver—Burk作图，
其抑制机制为胰蛋白酶的竞争性抑制剂。机体的多
种消化酶为丝氨酸蛋白酶，这类酶的活性一旦受到
抑制，常常引起腹胀、呕吐、水泻等症状，与生半夏不
良反应的临床症状相似。由此推断，活性半夏蛋白为
半夏的毒性成分之一，也是一种降逆止呕的药效成
分。因为，适当的抑制消化酶活性，可以适度调理和
改善机体的消化功能，减轻消化酶对消化道病变部
位的进一步消化损伤。
以半夏总蛋白的40％(NH．)zSO．沉淀作为活
性半夏蛋白粗品，获得基本纯化的活性半夏蛋白，活
性回收率可达24．40％，但以总蛋白计算，活性回收
率仅为15．26％。20mg40％(NH．)：SO．沉淀的抑
制活力为3516．2U，略高于按总蛋白的总活力计
算得出的活力单位(3505．62U)，这可能是样品称
量和活性测定操作的误差。另外，半夏总蛋白的
60％(NH．)。S0。沉淀中也含有活性半夏蛋白，推测
该部分活性很可能与40％(NH．)：SO。沉淀的活性
成分一致，但也可能是与之不同的物质，鉴于该步沉
淀的RPTI活性较低(比活力仅为总蛋白的0．50
倍)，故未作进一步分离分析。
多种半夏蛋白的精氨酸或赖氨酸残基可与胰蛋
酶疏水性口袋底部的天冬氨酸残基结合，可以降
低以胰蛋白酶为配体的亲和色谱的特异性和分辨
率。鉴于活性半夏蛋白与胰蛋白酶之间的亲和力远
远大于其他蛋白底物(Ki<高浓度的盐溶液(1mol／LNaCl)洗柱，可以洗掉大
部分非特异性结合的杂蛋白，然后用酸水洗脱吸附
的活性半夏蛋白组分，能够显著提高以胰蛋白酶为
配体的亲和色谱法分离活性半夏蛋白的分辨率。
SephadexG一50生成的p1和p2活性峰没有分开，
仅p1峰前半部分，即10～12号试管的合并组分经
SDS—PAGE检测显示基本均一的条带，将纯化的活
性半夏蛋白组分进一步电泳后转膜，剪下主带测序，
以保证活性半夏蛋白的纯度。
丝氨酸蛋白酶抑制剂在临床应用中显示了良好
前景。但是，以亲和色谱为主从生半夏中分离纯化活
性半夏蛋白的方法难以实现产业化生产。课题组将
进一步根据活性半夏蛋白的N端氨基酸序列设计
兼并引物，从鲜品半夏中克隆出其成熟肽的cDNA
序列，完成活性半夏蛋白基因工程表达生产与更加
深入的结构和功能分析。
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万方数据
一种具有胰蛋白酶抑制活性的半夏蛋白的纯化与N端氨基酸序
列分析
作者： 王厚伟， WANG Hou-wei
作者单位： 山东中医药大学药学院,山东,济南,250355
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(9)

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