全 文 ：HPLC法测定杜仲雄花和杜仲雄花茶中京尼平苷酸、绿原酸和京尼平苷
李 钦1 ,杜红岩2 ,杜兰英2 ,赫锦锦1 ,段经华2
①
(1. 河南大学中药研究所 ,河南 开封 475004 ; 2. 中国林业科学研究院经济林研究开发中心 ,河南 郑州 450003)
摘 要 :目的 建立同时测定杜仲雄花及其制剂杜仲雄花茶中京尼平苷酸、绿原酸和京尼平苷的方法。方法 采
用反相高效液相色谱法。色谱条件为迪马公司 Diamonsil TM C18色谱柱 (150 mm ×416 mm , 5μm) ,甲醇2水2冰醋酸
(15 ∶85 ∶115)为流动相 ,体积流量为 1 mL/ min ,柱温为 25～27 ℃,检测波长为 237 nm ,灵敏度为 01100 0 AU FS。
结果 京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷进样量与色谱峰面积线性关系良好。结论 该方法简便、准确 ,可用于杜仲
雄花及杜仲雄花茶中京尼平苷酸、绿原酸及京尼平苷的测定。
关键词 :杜仲雄花 ;杜仲雄花茶 ;京尼平苷 ;绿原酸 ;京尼平苷酸 ;高效液相色谱
中图分类号 :R286102 文献标识码 :A 文章编号 :025322670 (2009) 0120071202
杜仲 Eucom mi a uimoi des Oliv. 为杜仲科杜仲
属植物 ,传统以皮入药。杜仲皮含有京尼平苷酸、绿
原酸、京尼平苷等活性成分[1 ] 。杜仲叶已收载于《中
国药典》2005 年版一部 ,其中也含有上述 3 种有效
成分[ 2 ,3 ] 。杜仲雄花中也富含与叶、皮类似的有效
成分[ 4 ,5 ] 。京尼平苷酸、京尼平苷属环烯醚萜类 ,具
有抗肿瘤活性 ;绿原酸为苯丙素类 ,具有抗菌活
性[2 ] 。京尼平苷酸有降压作用 ,是杜仲降压的主要
成分之一[6 ] 。杜仲为雌雄异株树种 ,雌雄株各半。
杜仲雄花簇生于当年生枝条基部 ,容易采集[7 ] 。杜
仲广泛分布在我国亚热带至温带的 26 个省 (区、
市) ,目前国内杜仲栽培资源约 35 万公顷 ,杜仲雄花
资源十分丰富。采用优良无性系和果园化栽培技
术 ,杜仲雄花鲜花产量可达 2 500 kg/ hm2 以上。以
杜仲雄花为原料加工成的杜仲雄花茶已获得国家发
明专利[8 ] 。为更好的控制杜仲雄花及杜仲雄花茶的
质量 ,本实验建立 RP2HPL C 法同时测定杜仲雄花
及其制剂杜仲雄花茶中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平
苷的方法 ,有助于杜仲雄花质量控制和开发[9 ] 。
1 仪器与试药
Shimadzu L C - 10A T 高效液相色谱仪 , Shi2
madzu SPD - 10A 紫外检测器 ;浙大智达 N2000 色
谱工作站 ; UV - 1600 紫外可见分光光度扫描仪 ;
TP300 超声波清洗仪。
流动相用甲醇为色谱纯 ,水为超纯水 ,其他试剂
均为分析纯。京尼平苷、绿原酸、京尼平苷酸对照品
由日本养命酒株式会社中央研究院 Deyama 先生赠
送 ,经归一化法测定质量分数分别为 9816 %、
9912 %、9819 %。杜仲雄花采自河南省灵宝市中国
林业科学院经济林研究中心杜仲研究基地 ,杜仲雄
花茶由灵宝市天地科技生态有限公司提供 ,杜仲雄
花、杜仲雄花茶经河南大学药学院张保国教授鉴定
均为杜仲科植物杜仲 E. ui moi des Oliv. 的雄花和
雄花加工成的茶。
2 方法与结果
211 色谱条件 :迪马公司 Diamonsil TM C18 色谱柱
(150 mm ×416 mm , 5μm) ,甲醇2水2冰醋酸 (15 ∶
85 ∶115)为流动相 ,体积流量为 1 mL/ min ,柱温为
25～27 ℃,检测波长为 237 nm ,灵敏度为 011000
AU FS。
212 混合对照品溶液的制备 :精密称取京尼平苷酸
对照品 4150 mg、绿原酸对照品 3195 mg ,京尼平苷
对照品 3125 mg 置同一 25 mL 量瓶中 ,用甲醇溶解
并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得。
213 供试品溶液的制备 :分别准确称取干燥杜仲雄
花及杜仲雄花茶粗粉各 0125 g ,分别置 25 mL 量瓶
中 ,加 50 %甲醇溶液至刻度 ,浸泡 l h ,超声处理 (功
率 250 W ,频率 33 k Hz) 30 min ,放冷 ,加 50 %甲醇
至刻度 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤液 ,即得。
214 线性关系考察 :分别精密吸取混合对照品溶液
1、2、5、10、15、20μL 进样 ,测定其峰面积。分别以
进样量为横坐标 ,色谱峰面积为纵坐标 ,进行线性回
归 ,得回归方程。京尼平苷酸 : Y = 210 ×106 X +
28 181 , r = 01999 9 ,线性范围 : 0118～3160μg ;绿
原酸 : Y = 410 ×106 X - 256 794 , r = 01999 9 ,线性
范围 :0116～3116μg ;京尼平苷 : Y = 210 ×106 X +
·17·中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
①收稿日期 :2008205209
基金项目 :国家十五科技支撑项目 (2006BAD18B0303) ;国家林业局重点攻关项目 (2006261)
作者简介 :李 钦 (1965 —) ,男 ,河南中牟人 ,河南大学中药研究所所长 ,教授 ,博士 ,硕士生导师 ,长期从事中药质量评价和中药炮制工艺的
教学和科研工作 ,在该领域已发表论文 40 余篇 ,出版本专业论著 4 部 ,获省部级奖 4 项。
Tel : (0378) 3880589 E2mail :liqin @henu. edu. cn
54 368 , r = 01999 7 ,线性范围 : 0113～2160 g。结
果表明 ,京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷进样量与色
谱峰面积线性关系良好。
215 精密度试验 :准确吸取含京尼平苷酸 0118
mg/ mL ,绿原酸 0116 mg/ mL 、京尼平苷 0113 mg/
mL 的混合对照品溶液 20μL ,重复进样 5 次 ,测定
京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷面积 ,计算 RSD ,结
果京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷峰面积积分值的
RSD 分别为 1146 %、1158 %、1189 %。
216 稳定性试验 : 分别称取杜仲雄花 (批号
070416) 粗粉及杜仲雄花茶 (批号 070420) 粗粉各 5
份 ,每份约 015 g ,制备供试品溶液 ,分别于制备后的
0、2、4、6、8 h 进样测定 ,计算得杜仲雄花中京尼平
苷酸、绿原酸、京尼平苷质量分数的 RSD 分别为
1123 %、1118 %、1140 %。杜仲雄花茶中京尼平苷
酸、绿原酸、京尼平苷质量分数的 RSD 分别为
1128 %、1136 %、1154 %。结果表明杜仲雄花及杜仲
雄花茶溶液中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷在 8 h
内稳定。
217 重现性试验 :分别取杜仲雄花 (批号 070416)
及杜仲雄花茶 (批号 070420) 粉碎成粗粉 ,分别取粗
粉 0125 g ,各 5 份 ,制备供试品溶液 ,进样测定 ,计算
得杜仲雄花中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷质量分
数的 RSD 分别为 1157 %、1167 %、1185 % ,杜仲雄
花茶中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷质量分数的
RSD 分别为 1139 %、1160 %、1178 %。
218 回收率试验 : 分别称取杜仲雄花 (批号
070416)及杜仲雄花茶 (批号 070420) 粗粉约 0113
g ,各 6 份 ,每份分别加入含京尼平苷酸 0118 mg/
mL ,绿原酸 0116 mg/ mL ,京尼平苷 0113 mg/ mL
的混合对照品溶液 8 mL ,制备供试品溶液 ,进样测
定 ,计算回收率 ,结果杜仲雄花中京尼平苷酸、绿原
酸、京尼平苷的平均回收率分别为 9813 %、9718 %、
9810 % , RSD 分别为 1134 %、1150 %、1172 %。杜
仲雄花茶中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷的平均回
收率分别为 9712 %、9714 %、9717 % , RSD 分别为
1140 %、2102 %、1138 %。
219 样品测定 :精密吸取杜仲雄花供试品溶液、杜
仲雄花茶供试品溶液、混合对照品溶液各 20μL ,注
入液相色谱仪中 ,绘制液相色谱图 ,见图 1。可以看
出 ,京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷分离良好。在选
定色谱条件下 ,分别精密吸取对照品溶液和供试品
溶液 20μL ,注入液相色谱仪 ,测定 ,计算杜仲雄花
及杜仲雄花茶中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷的质
量分数 ,结果见表 1。
t/ min
12京尼平苷酸 22绿原酸 32京尼平苷
12geniposidic acid 22chlorogenic acid 32geniposide
图 1 对照品( A) 、杜仲雄花( B) 、杜仲雄花茶( C)的 HPLC图谱
Fig. 1 HPLC Chromatograms of reference substance ( A) , E. ulmoides stamen ( B) and E. stamen tea ( C)
表 1 杜仲雄花、杜仲雄花茶中京尼平苷酸、绿原酸、
京尼平苷的测定结果( n = 3)
Table 1 Determination of geniposidic acid , chlorogenic
acid , and geniposide in E. ulmoides stamen
and E. ulmoides stamen tea ( n = 3)
样品 批号 京尼平苷酸/ % 绿原酸/ % 京尼平苷/ %
杜仲雄花 070416 11638 3 01 408 3 01168 7
070417 11602 5 01 416 5 01185 4
070418 11659 2 01 426 8 01176 8
杜仲雄花茶 070420 11957 1 01 519 2 01984 3
070421 11862 8 01 508 3 01953 7
070422 11895 4 01 517 4 01979 5 3 讨论检测波长的选择 :通过对京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷对照品溶液进行紫外波长扫描 ,结果表明 ,3 种成分在 234～240 nm 均有较强的吸收。因此选择 237 nm 为紫外检测波长。流动相系统的选择 :根据京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷 3 种物质的结构 ,选择 C18柱利用反相高效液相色谱法 ,以甲醇2水作为流动相进行分离。杜仲雄花成分复杂 ,京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷附近峰很多 ,当溶剂极性较大时 ,虽然出峰时间短 ,但样 (下转第 143 页)
·27· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
“2. 3”项下方法操作 ,在上述色谱条件下进行测定 ,计算
得平均加样回收率为 99. 81 % ,RSD 为 2. 38 %(n = 6) 。
2. 9 样品的测定 :分别精密吸取供试品溶液 10
μL ,注入色谱仪 ,在上述色谱条件下进行测定 ,计算
川陈皮素的量 ,结果见表 1 和图 1。
表 1 不同产地枳壳药材的测定结果 ( n = 3)
Table 1 Determination of Fructus Aurantii
from various habitats ( n = 3)
编号 样品来源 商品名称 川陈皮素/ %
1 2003207231 江西新干 (香橙)采集 江枳壳 0. 053
2 2003207225 江西樟树吴城乡采集 江枳壳 0. 055
3 2003207231 江西樟树吴城乡采集 江枳壳 0. 059
4 2004207231 江西新干 (臭橙)采集 江枳壳 0. 023
5 2002210202 购于重庆綦江县药材公司 川枳壳 0. 013
6 2002209230 购于重庆江津药材公司 川枳壳 0. 015
7 2002211215 购于湖南怀化药材公司 湘枳壳 0. 120
8 2002211217 购于湖南沅江药材公司 湘枳壳 0. 177
9 2002211208 购于江西樟树药材市场湖南沅江产 湘枳壳 0. 182
10 2002211217 购于湖南沅江药材公司 湘枳壳 0. 170
11 2002212204 浙江兰溪药农家购 (大暑后) 苏枳壳 0. 050
12 2002212204 浙江兰溪药农家购 (大暑前) 苏枳壳 0. 062
13 2002210229 购于武汉国药集团 枳壳饮片 0. 069
14 2002211217 购于湖南沅江药材公司 (炒)枳壳 0. 175
15 2002210229 购于湖北九州通购 ,沅江产 枳壳饮片 0. 046
16 2002211 购于南昌三点堂药房 枳壳饮片 0. 137
3 讨论
3. 1 流动相的选择 :参考文献方法 [ 5 ]结果分离不
好 ,且流动相复杂。本试验选择了不同配比的流动
相 ,结果表明 ,甲醇2水 (55 ∶45) 分离效果较好。川
陈皮素在 330 nm 处有最大紫外吸收。
3. 2 提取方法的选择 :通过超声提取、加热回流提
取及索氏提取的比较 ,超声提取不完全 ,加热回流提
3 2川陈皮素3 2nobiletin
图 1 对照品( A)和样品( B) HPLC图
Fig. 1 HPLC Chromatograms of reference
substance ( A) and sample ( B)
取和索氏提取完全 ,但加热回流提取法提取时间相
对较短 ,操作简便 ,故本实验采用加热回流方法。
3. 3 提取溶剂的选择 :实验中考察了甲醇、乙醇、氯
仿、丙酮作为提取溶剂 ,结果表明 ,甲醇的提取效果
好且完全 ,本实验采用甲醇为提取溶剂。
3. 4 本试验首次采用 H PL C 法对不同产地的枳壳
药材进行川陈皮素的测定 ,方法简便、准确、重现性
好 ,可作为枳壳药材中川陈皮素测定的有效方法。
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21922201
(上接第 72 页)
品中 3 种有效成分和杂峰难以分离 ,为此调小流动
相的极性 ,最终选择甲醇2水 (15 ∶85) 为流动相可使
3 种成分有较好的分离度。由于京尼平苷酸、绿原
酸中有羧基、酚羟基 ,在中性溶剂中两种成分易电
离 ,从而在色谱柱上存在“双保留”现象 ,为此 ,在流
动相中加入少量冰醋酸 ,可抑制羧基、酚羟基的离
解 ,从而使两峰的峰形得到改善。经实验测定优化 ,
选择甲醇2水2冰醋酸 (15 ∶85 ∶115)为流动相。
本实验同时测定杜仲雄花及杜仲雄花茶中京尼
平苷酸、绿原酸、京尼平苷 ,为评定杜仲雄花及杜仲
雄花茶的质量提供了快捷、可行的测定方法 ,可用于
其质量控制 ,也适用于大量样品的快速处理。
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·341·中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月