全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月·773·
茯苓原生质体制备与再生条件初探
梁清乐，王秋颖+，曾念开，王怀凯
(中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京 100094)
摘 要：目的 研究茯苓原生质体制备及其再生条件。方法 采用不同菌龄、酶液浓度、酶解时间、稳渗剂对茯苓原
生质体产率及再生条件进行研究。结果不同菌龄、酶液浓度、酶解时间、稳渗剂对茯苓原生质体产率及再生产生
不同影响。结论Z，。．。原生质体制备时菌丝最适菌龄为72h，酶液浓度为3％，稳渗剂以0．5mol／L的甘露醇为佳。
Z。。原生质体制备时菌丝最适菌龄为56h，酶液浓度为3％，稳渗剂以0．6mol／L的甘露醇为佳。Z-”和Z-o—s原生
质体均以甘露醇作稳渗剂再生率较高，其最佳浓度为0．6mol／L。在该条件下Z。z原生质体再生率为7．5X10～，
Zl0_3为1．3×10～。
关键词：茯苓；原生质体；形成；再生
中图分类号：R282．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)05—0773—03
SeparationandregenerationofPoriaCOCOSprotoplast
LIANGQing—le，WANGQiu—ying，ZENGNian—kai，WANGHuai—kai
(InstituteofMedicinalPl nt，ChineseAcademyofMedicalScienceandPekingUnionMedicalCo lege，
Beijing100094，China)
Abstract：ObjectiveTostudythconditionsofseparationandregenerationofPoriaCOC05protoplast．
MethodsSeparationandregenerationofP．COCOSprotoplastunderdifferentagesofhyphae，enzymecon—
sistency，andenzymolysictimeandstabillizer．ResultsTheresultshowedthatheyieldoftheproto—
plastwasdifferentunderdifferentagesofhyphae，enzymeconcentration，enzymolysictime，andstabil z—
er．ConclusionForstrainZ10一2，itsoptimalageofhyphae，enzymeconcentration，andstabilizeris72h，
3％，and0．5mol／Lmannitol，respectively．Thes rainZl0-3is56h，3％，and0．6mol／Lmannit01．The
frequencyofregenerationof hetWOstrainssthebestand7．5X10-3(strainZlo-2)and1．3×10—2(strain
Z10-2)separatelywhenthestabilizeris0．6mol／I。mannit01．
Keywords：PoriaCOCOS(Sehw．)Wolf；protoplast；separation；regeneration
1972年荷兰的DeVries和Wessels，用从Tri—
chodemaviride中制备的裂解酶分离了裂褶菌的原
生质体，随后又分离了双孢蘑菇和草菇的原生质体。
1980年以后，由于商品脱壁酶的出现，开始有大量
的关于从真菌中分离原生质体的报道[1’2]。食、药用
菌原生质体技术在20世纪80年代得到了迅速发展
和广泛应用，现在已是食、药用菌生理、生化、遗传等
基础理论研究和菌种改良的一种重要方法和有效工
具‘引。
传统中药茯苓PoriaCOCOS(Schw．)Wolf，几千
年来被广泛用于临床治疗和人体保健。目前茯苓有
效成分茯苓多糖的研究较为深入，也有较多的茯苓
新疗效、新用途的报道。但研究主要集中在栽培、化
学、药理及临床应用等方面，而茯苓的遗传育种研究
甚少，本实验对茯苓原生质体制备与再生条件进行
收稿日期：2005—09—21
*通讯作者王秋颖
了初步探索。
1 材料
1．1菌种：Z。㈣由中国医学科学院药用植物研究所
真菌室提供，z。∽由福建三明真菌研究所提供。
1．2培养基
1．2．1 斜面培养基：麦麸5％(水煮0．5h，滤过，
取滤汁)，葡萄糖2％，磷酸二氢钾0．3％，硫酸镁
0．15％，VB0．001％，琼脂1．5％，pH值自然。
1．2．2发酵培养基：麦麸5％(水煮0．5h，滤过，
取滤汁)，葡萄糖20A，磷酸二氢钾0．3％，硫酸镁
0．15％，VB0．001％，pH值自然。
1．2．3再生培养基：马铃薯10％(水煮0．5h，滤
过，取滤汁)，酵母粉0．3％，蛋白胨0．5％，葡萄糖
2％，磷酸二氢钾0．2％，硫酸镁0．1％，硫酸铵
0．1％，VB0．001％，琼脂条1．5％(煮溶)。
万方数据
·774· 中草芮 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月
1．2．4高渗再生培养基：再生培养基中加入0．5
mol／L甘露醇作为稳渗剂。
1．3试剂：0．1mol／LTris一0．1mol／LEDTA，0．1
mol／LTris一0．1mol／LEDTA配制的0．2％巯基
乙醇；稳渗剂KCl、NaCl、甘露醇、蔗糖；50mmol／L
CaCl2的30％聚乙二醇(PEG6000)(北京欣经科试
剂公司)；溶壁酶(广东省微生物研究所)；蜗牛酶
(北京欣经科试剂公司)。
2方法
2．1原生质体的制备
2．1．1酶液制备：用灭菌的0．5mol／L渗透压稳
定剂配制，酶溶解后5000r／min离心10min，去掉
沉淀杂质，上清液用0．22tim微孔滤膜滤过除菌，
4℃冰箱中保存备用。
2．1．2 菌种培养：将菌株Z。。小Z。。．。从试管斜面挑
取数小块，分别接种于150mL麦麸液体培养基中，
28LC下摇床培养7d，然后滤过收集菌丝，用无菌
水冲洗后，用研钵磨，取Z。∽、Z。。一。各10mL分别再
接人150mL新培养基中培养，温度为28℃，做以
下处理。
2．1．3菌龄试验：分别取培养24、32、40、48、56、
72、96h的Z，㈣、Z。㈦菌丝，铜网滤过收集菌丝，用无
菌水将菌丝冲洗干净一o．1mol／LTris一0．1mol／L
EDTA冲洗一0．2％巯基乙醇处理30min，温度为
28℃，振荡一铜网收集菌丝，用0．5mol／L甘露醇
冲洗一将收集的菌丝在1500r／min下离心
10min一称取0．25g菌丝体加上1mol30／酶液，
28℃振荡酶解2．0h一铜网滤过一滤液离心500
r／min，5min2次，去掉菌丝段一3500r／min下离
心10min，得到沉淀即为原生质体一将沉淀用稳渗
剂洗涤离心2次，然后用血球计数板计数。
2．1．4酶浓度试验：所用蜗牛酶、溶壁酶的酶浓度
分别为1％、2％、3％、4％，取培养56h的Z。∽，72h
的Z。∽的菌丝进行处理，操作步骤同2．1．3，然后用
血球计数板计数。
2．1．5酶解时间试验：所用蜗牛酶、溶壁酶的酶浓
度为3％，取培养56h的Z。∽，72h的Z。呲的菌丝
进行处理，酶解时间为1．5、2、2．5、3h，操作步骤同
2．1．3，血球计数板计数。
2．1．6 稳渗剂试验：采用0．4、0．5、0．6mol／L
KCl，0．4、0．5、0．6mol／L蔗糖和0．4、0．5、0．6
mol／L甘露醇作为稳渗剂，取培养56h的Z。∽，72
h的Z协：的菌丝，酶液浓度为3％，操作步骤同
2．1．3，血球计数板计数。
2．2原生质体再生
2．2．1不同稳渗剂的试验：分别采用0．5mol／L
KCl，0．5mol／LNaCl，0．5mol／L蔗糖，0．5mol／
L甘露醇作为稳渗剂加入到完全培养基中，取制备
好的原生质体0．1mL涂皿，使每皿原生质体数目
达到104个／mL，28℃下培养，观察平皿中的再生
菌落数，计算再生率。
原生质体再生率一再生菌落数／原生质体总数
2．2．2不同浓度的稳渗剂试验：分别用0．4、0．6、
0．8mol／L甘露醇作为稳渗剂加入到完全培养基
中，每皿原生质体数目达到104个／mL，28℃下培
养，观察平皿中的再生菌落数，计算再生率。
3结果与讨论
3．1原生质体制备
3．1．1菌龄对茯苓原生质体产量的影响：从表1可
以看出，Z。∽菌丝酶解的最适菌龄为72h，Z。∽茵丝
酶解的最适菌龄为56h，且Z。∽菌丝在56h时，原
生质体个体较大，适于融合，为最适菌龄。Z，∞。在培
养96h后，得到的原生质体虽然较多，但个体较老，
不适于融合。因此，在原生质体制备过程中，菌龄对
原生质体的影响很明显。菌龄过小或者过大都将影
响原生质体的形成，一般以对数生长期的幼嫩菌丝
酶解制备原生质体效果最好，但不同菌种由于其生
理生化及生长速度不同，适宜分离原生质体的菌龄
亦不同。
表1菌龄对原生质体产率的影响
Table1 Effectofvariousagesonprotoplastyield
3．1．2酶浓度对茯苓原生质体产量的影响：从表2
中可以看出，Z。㈣菌和Z。∽菌株采用3％的蜗牛酶
和溶壁酶混合酶液酶解菌丝时，其原生质体产量最
高，实验证明，茯苓菌丝原生质体的制备需要在一定
浓度的酶液中进行，但酶液浓度并非与原生质体产
率成正比关系，相反，如果酶液浓度过高，还会造成
原生质体变形，但酶液浓度过低酶解效果亦不理想。
表2酶液浓度对原生质体产率的影响
Table2 Effectofvariousenzymeconcentrations
onproloplastyield
万方数据
中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月·775·
3．1．3酶解时间对茯苓原生质体产量的影响：试验
结果见表3，Z，。．：菌株采用3％酶液酶解2．0h后，
其原生质体产量最高，而Z。。．。菌采用3％酶液酶解
2．5h，其原生质体产率最高。实验表明原生质体产
率与酶解时间有一定关系，但并不成正相关，有些菌
类如果延长酶解时间，原生质体产率会显著降低，这
可能是因为脱壁太彻底或杂酶对原生质体长时间的
损伤降低了原生质体的活性和再生。
表3酶解时间对原生质体产率的影响
Table3 Effectofzymolytictimeonprotoplastyield
原生质体产量／(×105·mL-1)菌株——
1．5h 2．0h 2．5h 3．0h
3．1．4不同稳渗剂对茯苓原生质体产量的影响：脱
去了细胞壁的原生质体是很脆弱的，需要特定的等
渗溶液来悬浮原生质体，原生质体在分离、再生及融
合过程中都离不开渗透压稳定剂的保护。稳渗剂的
种类和浓度对原生质体的分离有着较大影响，本实
验选用不同浓度的KCI、蔗糖、甘露醇稳渗剂对茯苓
进行酶解对比试验，结果见表4。对于Z，㈣，0．5
mol／L甘露醇作稳渗剂时所得原生质体数量最多，
且原生质体大小均匀，其次为蔗糖，KCl最差；Z。㈦
以0．6mol／L甘露醇作稳渗剂所得原生质体最多，
蔗糖次之，KCl最次。因此，最适合的渗透压稳定剂
条件需要根据不同供试菌株来确定。
3．2原生质体再生
3．2．1不同种类的稳渗剂对茯苓原生质体产量的
影响：由表5可以看出甘露醇作稳渗剂对茯苓原生
质体的再生效果最佳。其次为蔗糖，而无机盐NaCl、
KCl效果较差。且Z。。。。在NaCl为稳渗剂的条件下
几乎不能再生。
3．2．2不同浓度的稳渗剂对茯苓原生质体产量的
影响：由表6可以看出，同一种稳渗剂不同的浓度其
原生质体再生率也不同，0．6mol／L甘露醇作为稳
渗剂时其原生质体再生率最高。
表4不同稳渗剂对原生质体产率的影响
Table4 Effectofvariousstabilizersonp otoplastyield
表5不同种类的稳渗剂对原生质体再生的影响
Table5 Effectofvariouskindsof tabilizers
onprotoplastregeneration
表6不同浓度的稳渗剂对原生质体再生的影响
Table6 Effectofvariousconcentrationsofstabilizers
onprotoplastregeneration
References：
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RP—HPLC法测定厚朴中厚朴碱
刘明哲，邹玉红，陈晓辉，毕开顺+
(沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳 110016)
厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia珊cinalisetWi s．subsp．biloba(Rehd．etWils．)Ch nget
Rehd．etWils．或凹叶厚朴M．officinalisRehd．Law的干燥干皮、根皮和枝皮。厚朴中主要有效成
收稿日期：2005—07—30
作者简介：刘明哲(1980一)，男，满族，河北保定人，在读硕士，主要从事中药质量标准的研究。
Tel：(024)23986296E—mail：liumz80@yahoo．com．ca
*通讯作者毕开顺
万方数据
茯苓原生质体制备与再生条件初探
作者： 梁清乐， 王秋颖， 曾念开， 王怀凯， LIANG Qing-le， WANG Qiu-ying， ZENG Nian-
kai， WANG Huai-kai
作者单位： 中国医学科学院,中国协和医科大学药用植物研究所,北京,100094
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(5)
被引用次数： 1次
参考文献(3条)
1.Chang S T.Miles P E Edible Mushrooms and Their Cultivation Boca Raton 1989
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引证文献(1条)
1.梁清乐.王秋颖.曾念开.王怀凯 茯苓灭活原生质体融合育种研究[期刊论文]-中草药 2006(11)
本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200605050.aspx