全 文 ：·药理与临床·
调心方活性部位对皮质酮抑制大鼠海马脑片CA1区诱发
长时程增强的作用
乔海法, 杨 胜,周文霞 ,张永祥
(军事医学科学院毒物药物研究所, 北京 100850)
摘 要:目的 以长时程增强 ( LTP )为指标 ,研究调心方( TXR)活性部位 A( TXR-A )对皮质酮抑制大鼠海马脑片
LTP 作用的影响。方法 将脑片分为正常对照组、皮质酮组、皮质酮+ T XR 组、皮质酮+ 不同浓度 TXR-A 组,记
录前脑片用含药人工脑脊液 ( ACSF ) 孵育 1 h, 记录时用相同 ACSF 灌流。采用细胞外微电极记录技术,记录大鼠
海马脑片 CA1 区诱发群峰电位 ( PS) ,然后施以 100 Hz、100 个脉冲的强直刺激 HFS 诱发 LT P。结果 与正常脑
脊液组相比,皮质酮 ( 2 mo l/ L ) 孵育海马脑片 1. 5 h 以上, 强直刺激后 PS 增幅显著降低, 提示皮质酮对海马
LTP 具有抑制作用。用不同浓度的 T XR-A+ 皮质酮孵育脑片 1. 5 h 以上,强直刺激后高浓度 TXR-A 组的 PS 平
均幅度显著提高, 且作用优于 TXR。提示 TXR-A 可以对抗皮质酮对 LTP 的抑制。结论 该活性部位可能是发挥
TXR 改善皮质酮抑制大鼠海马 CA1 区诱发 LT P 作用的主要成分之一, 拮抗皮质酮对 LTP 的抑制是其益智作用
的机制之一。
关键词: 调心方; 长时程增强 ( LT P) ; 皮质酮; 海马脑片
中图分类号: R285. 5 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2005) 01 0065 04
Effect of active fraction of Tiaoxin Recipe on long-term potentiation
inhibited by corticosterone in area CA1 of rat hippocampal slices
QIAO Hai-fa, YANG Sheng , ZHOU Wen-xia, ZHANG Yong-x iang
( I nstitute of Pha rmaco lo gy and Tox icolog y , Academy of M ilitary Medical Science, Beijing 100850, China)
Abstract: Obj ective T o invest igate the effect of act ive fraction A ( TXR-A ) ex tr acted f rom T iaox in
Recipe ( T XR) on inhibit ion of cort ico sterone on long-term potent iat ion ( LT P) induced by high frequency
st imulat ion ( HFS ) in rat hippocampal slices. Methods T he slices w ere divided into contro l,
co rt icosterone, cort ico sterone+ TXR, and cort icosterone+ differ ent concentrat ion o f TXR-A g roups, then
w er e incubated w ith ar tif icial cerebrospinal f luid ( ACSF) added by dr ug s for 1 h befo re r ecording and were
perfused with the same A CSF dur ing recording. Populat ion spike ( PS ) w as recorded fr om stratum
py ramidale o f area CA1 using ex t racellular r ecording fo llow ing st imulat ion o f Schaf fer co llaterals in rat
hippocampal slices. T hen a 100 Hz, 100 pulses HFS w as used to induce LT P. Results PS amplitude w as
decr eased signif icantly v s that in the contro l g roup, w hen the slices w ere pre-incubated in ACSF added by
co rt icosterone ( 2 mo l/ L ) over 1. 5 h, meaning that LT P w as inhibited by co rt icosterone. How ever , PS
amplitude of the slices pre-incubated in ACSF added by cort icosterone ( 2 mo l/ L ) and high concentr ation
TXR-A was incr eased signif icantly v s that o f co rticosterone pre-treat ing slices, meaning that high
concentrat ion T XR-A enhanced LT P inhibited by cort icosterone. Furthermore, increased LT P amplitude
in high concentrat ion T XR-A was much more than that in TXR. Conclusion T XR-A is one of main T XR
act ive ingr edients w hich facilitate LT P inhibited by cort icosterone in area CA 1 o f rat hippocampal slices.
The antagonist ef fect on co rt icosterone inhibit ion on LTP is one of the mechanisms to benefit the
intelligence.
Key words : T iaox in Recipe ( T XR) ; long-term po tentiat ion ( LTP) ; cort icoster one; hippocampal slice
糖皮质激素 ( glucocort icoids, GCs) 过度分泌
与海马的增龄性认知机能障碍及阿尔茨海默病
( AD) 所表现的海马机能损伤关系密切。前期研究
表明, ip 皮质酮 ( cort icoster one) 可明显抑制整体
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收稿日期: 2004-05-08基金项目:国家自然科学基金重点项目( 39830450)作者简介:乔海法( 1967—) ,男,山东青岛人,教授,医学博士,现为军事医学科学院总后优秀人才科研工作站研究人员,主要从事中药及神经药理学研究。Tel: ( 010) 66931627 E-mail: haifaqiao@163. com
* 通讯作者 Tel: ( 010) 66931625 Fax: ( 010) 68211656 E-mail: Zhouw x @n ic. bmi . ac. cn
大 鼠海马齿状回诱发长时程增强 ( long-term
po tent iat ion, LT P)
[ 1] ; 皮质酮也可以抑制海马脑片
CA1区诱发 LTP,由党参、桂枝、茯苓、菖蒲、远志和
炙甘草等中药组成的调心方 ( TXR) 则可以明显对
抗这一作用[ 2]。为深入探讨 TXR 发挥益智作用的
物质基础,笔者通过药理和化学研究方法, 获得了几
个部位, 其中,部位 A 中含总皂苷 70% 以上,初步
动物实验结果表明, 该部位对 -淀粉样蛋白 ( -
AP) 诱导的痴呆模型大鼠的空间学习记忆障碍具
有明显改善作用,提示该部位可能是 TXR 发挥益
智作用的活性部位之一。为进一步探讨其发挥益智
作用的机制, 本研究采用细胞外微电极记录技术,首
先观察皮质酮对脑片 LTP 诱发的抑制作用, 然后
观察调心方活性部位 A ( T XR-A) 对皮质酮抑制大
鼠海马脑片 CA1 区诱发 LTP 的影响, 并与 T XR
全方对抗皮质酮抑制 LTP 诱发的作用进行比较。
1 材料与方法
1. 1 动物: 二级 Wistar 大鼠, 雌性, 体重 160～
200 g ,由军事医学科学院动物中心提供。
1. 2 药品与试剂: TXR 为水提醇沉制成的水溶液,
含生药 7. 45 g/ mL; T XR-A 则采取水煎、醇沉, 进
而以乙醚、正丁醇提取的工艺进行提取, TXR-A
(配方中远志的总皂苷> 50%) 配成含生药 7. 45 g /
mL 的溶液; 均由上海中医药大学老年医学研究所
提供。皮质酮购于美国 Gibco BRL 公司;其他试剂
均为国产分析纯。
1. 3 海马脑片制备:将大鼠在乙醚麻醉下断头取
脑,于大脑半球腹内侧分离出双侧海马, 在 4 ℃ 供
氧条件下, 用振动切片机 ( Vibro slice MA 752,
Campden Ins,英国) 沿与海马长轴垂直的方向将其
切成厚为 400 m 的脑片,全部脑片置于不断通入
氧混合气体 ( 95% O 2+ 5% CO 2 ) 的人工脑脊液
( art ificial cerebrospinal f luid, ACSF ) 中, 在室温
( 21～26 ℃) 下孵育 1. 5 h 以上。ACSF 的组成为
( mmol / L ) : NaCl 124、KCl 5、KH2PO 4 1. 2、MgSO 4
1. 3、NaHCO3 26、CaCl2 2. 5、D-glucose 10,调 pH 值
至 7. 3～7. 4。
1. 4 群峰电位 ( populat ion spike, PS) 记录:将孵
育后的脑片置于海马浴槽中并固定,不断通入氧混
合气,用蠕动泵持续灌流 ACSF ( 1. 5～2 mL/ m in) ,
使海马脑片全浸于液面下。整个实验过程用恒温器
将浴槽温度控制在 ( 30±1) ℃。双极刺激电极置于
由海马 CA3 区锥体细胞发出而投射于 CA1 区的
Schaffer 侧支上, 玻璃微电极 (内充 4 mmol / L
NaCl 溶液,阻抗 3～7 M ) 置于海马 CA1 区锥体
细胞层,由刺激器 ( SEN -7203,日本) 输出刺激信号
经隔离器 ( SS-104J, 日本) 至刺激电极。记录细胞外
诱发 PS, 则通过微电极放大器 ( Axoclamp2A,
Axon Ins, 美国) 与计算机相联, 由 Pclab2. 2 软件
(北京微信斯达科技发展有限公司) 进行采样处理。
1. 5 LTP 的诱发:实验开始时,先用中等强度的单
刺激 (间隔 60 s, 持续 200 s) 诱发出特征性的基
础 PS,稳定记录 10 min,使 PS 达到稳定, 调节 PS
幅度至最大幅度的 50%～60% , 再稳定记录 15
m in, 然后给予 Schaffer 侧支纤维一个频率为 100
Hz 的 100 个脉冲的高频刺激 ( HFS) ,此时可以记
录到增大的 PS, HFS 后连续记录 60 min。
1. 6 观测指标和测量方法:实验中以 PS 幅度相对
值 ( %) 为观测指标,并观察其增幅情况。具体测定
方法:每 5个连续时间点即连续 5 min 采集的 5个值
( 1个/ min) 进行平均得一个值,以 HFS 之前 15 m in
内的 PS 均值为 100%,每 5 个时间点平均得到的值
分别除以 HFS 之前的 PS 均值,得各时间点的 PS 幅
度相对值 ( % )。整体的平均增幅则是将 HFS 后 60
m in PS 幅度均值除以 HFS 前的 PS 均值。
1. 7 给药方法: 将 T XR 及 T XR-A 溶液离心, 并
用 ACSF 分别稀释。其中, T XR 稀释 1 000倍,使其
含生药 7. 45 mg/ mL; T XR-A 溶液则分别稀释
2 000、1 000、500 倍, 使其含生药分别为 3. 75、
7. 45、14. 9 mg / mL。当观察药物对海马脑片基础突
触传递的影响时,先采用通常的 ACSF 灌流脑片并
记录正常的 PS, 然后采用含药 ACSF 灌流脑片, 观
察其是否发生变化;当观察皮质酮对海马脑片 LT P
的抑制作用及 T XR 或 TXR-A 对抗皮质酮的这种
作用时, 则分别在实验前用含皮质酮 ( 2 mol/ L )
及皮质酮 ( 2 mo l/ L ) + T XR (含生药 7. 45 mg /
mL) 或皮质酮+ 不同质量浓度 TXR-A 的 ACSF
孵育脑片 1. 5 h 以上,并在整个实验记录过程中均
用此含药 ACSF 灌流脑片。
1. 8 数据处理: 采用 Origin 6. 0 软件 ( M icro cal
Sof tw are, 美国) 及 SAS 软件包 ( Release 6. 12,
Sas Inst itute Inc,美国) 对数据进行分析和统计学
处理。定量资料数据用 x±s 表示。两组数据比较采
用配对 Students t 检验; LTP 的动态变化采用具
有一个重复测量的两因素方差分析 ( tw o-w ay
AN O-VA ) ;而 1 h 平均 PS 幅度相对值则采用单因
素方差分析 ( o ne-w ay ANOVA) ; 多组比较用 SNK
检验。
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2 结果
2. 1 皮质酮对大鼠海马脑片诱发 LT P 的抑制作
用:首先用通常的 ACSF 灌流海马脑片,记录正常
的 PS, 将 PS 调至最大幅度的 50%～60%, 稳定记
录 10 min 后,灌流含 2 mo l/ L 皮质酮的 ACSF,观
察其对脑片基础 PS 的影响。结果发现,所记录的 7
例脑片在灌流后 30 min 内 PS 的形状、幅度没有发
生明显变化 (图 1)。提示皮质酮并不影响大鼠海马
脑片的基础突触传递。
预先用含 2 mol/ L 皮质酮的 ACSF 孵育海马
脑片 1. 5 h 以上,再观察 LT P 的诱发情况。结果发
现, LTP 的幅度受到明显的抑制, 与对照组即正常
ACSF 组相比, HFS 后不同时间点 PS 增幅及 60
min 内的平均 PS 幅度也明显降低 (表 1、图 2) ,提示
图 1 皮质酮对大鼠海马脑片基础 PS 的影响 ( n= 7)
Fig. 1 Ef fect of corticosterone on baseline of PS
in rat hippocampal slices ( n= 7)
皮质酮可以明显抑制大鼠海马脑片 LTP 的幅度。
2. 2 TXR-A 及 T XR 对皮质酮抑制大鼠海马脑片
表 1 TXR-A 对皮质酮抑制大鼠海马脑片 CA1 区诱发 PS 幅度的影响 ( x±s, n= 6)
Table 1 Ef fect of TXR-A on PS inhibited by corticosterone in CA1 area of rat hippocampal slices ( x±s, n= 6)
组 别 剂 量
/ ( mg·mL- 1)
PS 相对幅度值/ %
5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 m in
对照 - 150. 8± 5. 6 152. 2± 3. 6 152. 4± 3. 9 155. 0± 8. 1 156. 9± 7. 9 156. 6± 9. 4
皮质酮 - 110. 1± 7. 4* * 109. 5± 8. 4* * 110. 2± 6. 0* * 109. 7± 9. 4* * 110. 9±11. 1* * 110. 3±14. 8* *
皮质酮+ TXR 7. 45 172. 0±21. 1# # 170. 4±22. 9# # 170. 6±20. 4# # 166. 4±25. 6# # 165. 0±25. 6# # 165. 3±31. 4# #
皮质酮+ TXR-A 3. 75 121. 7± 7. 8 119. 7± 8. 9 119. 5± 9. 6 118. 1± 7. 5 119. 8± 9. 3 118. 1± 9. 2
7. 45 146. 1±20. 6# 140. 3±18. 1# 146. 7±11. 3# 137. 2±10. 0# 138. 9±14. 4# 134. 6±15. 6#
14. 9 190. 9±26. 8# # ※△ 207. 2±20. 4# # ※△ 203. 0±25. 4# # ※△ 205. 7±20. 9# # ※△ 199. 0±14. 9# # ※△ 217. 8±11. 7# # ※△
组 别 剂 量
/ ( mg·mL- 1)
PS 相对幅度值/ %
35 min 40 min 45 min 50 min 55 min 60 m in
对照 - 153. 0± 3. 3 154. 7± 7. 7 156. 8± 9. 5 157. 9± 4. 8 159. 5±12. 6 159. 3±17. 3
皮质酮 - 109. 7±12. 6* * 106. 5±12. 6* * 107. 0±15. 9* * 104. 6±11. 4* * 105. 7±13. 8* * 106. 8±16. 2* *
皮质酮+ TXR 7. 45 164. 0±23. 7# # 167. 0±22. 4# # 165. 6±23. 9# # 163. 9±25. 0# # 167. 9±25. 0# # 168. 7±28. 4# #
皮质酮+ TXR-A 3. 75 120. 6± 4. 5 117. 5± 7. 4 118. 1± 8. 3 117. 8±17. 7 118. 2± 6. 1 116. 6± 6. 7
7. 45 139. 8±11. 0# 133. 9±12. 2# 136. 6±13. 8# 134. 4±14. 1# 128. 9±19. 8 135. 1±10. 9#
14. 9 223. 6±28. 2# # ▲△232. 4±24. 2# # ▲△ 235. 1±21. 2# # ▲△ 246. 3±23. 2# # ▲△△249. 8±27. 0# # ▲△△256. 6±34. 1# # ▲△△
与对照组比较: * * P < 0. 01; 与皮质酮组比较: # P < 0. 05 # # P < 0. 01; 与皮质酮+ T XR 组比较: ▲P < 0. 05; 与皮质酮+ T XR-A
( 3. 75、7. 45 m g/ mL) 组比较: △P < 0. 05 △△P < 0. 01
* * P< 0. 01 v s cont rol group ; # P< 0. 05 # # P < 0. 01 v s cort icosterone group; ▲P< 0. 05 v s corticoster on e+ T XR group; △P < 0. 05
△△P < 0. 01 vs cort icos terone+ TXR-A ( 3. 75, 7. 45 m g/ mL) groups
诱发 PS 幅度的影响: 预先分别用含皮质酮+ T XR
及皮质酮+ 不同浓度 T XR-A 的含药 ACSF 孵育海
马脑片 1. 5 h 以上,然后在记录脑片 PS 以及随后诱
发 LT P 的过程中一直采用同样的含药 ACSF 灌流,
观察 TXR-A 对皮质酮抑制脑片诱发 PS 及 LTP 幅
度的影响。结果显示, HFS 后 14. 9 mg/ mL TXR-A
组不同时间点的 PS 幅度明显高于皮质酮模型组
( P< 0. 01) (表 1)。7. 45 和 14. 9 mg / mL TXR-A
组脑片 HFS 后 60 min 内的平均 PS 幅度相对值明
显高于模型组 ( P< 0. 01) , 并表现出一定的量效关
系, 14. 9 mg / mL TXR-A 组的作用优于 TXR ( P<
0. 05) (图2)。提示高浓度 T XR-A 可明显改善皮质
酮对不同时间点 PS 幅度及整个 LTP 维持的抑制
作用。
3 讨论
皮质酮是肾上腺皮质分泌的主要 GCs, 具有抗
炎、抗免疫和介导应激等重要作用, 其分泌受控于下
丘脑-垂体-肾上腺 ( HPA) 功能轴,血浆皮质酮水平
升高可作用于下丘脑糖皮质激素受体而反馈性抑制
HPA 轴功能,减少肾上腺皮质分泌皮质酮,并使血浆
皮质酮保持在一个较为稳定的水平。临床研究表明,
AD 患者 HPA 轴功能亢进, GCs 水平明显高于正常
水平[ 3～5]。皮质酮过量分泌可损伤中枢神经系统,尤
其对海马神经细胞具有选择性毒性[ 6, 7]。AD患者中,
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1-对照 2-皮质酮 3-皮质酮 + T XR 4-皮质酮 + TXR-A
( 3. 75 mg/ mL ) 5-皮质酮+ T XR-A ( 7. 45 m g/ mL) 6-皮质
酮+ T XR-A ( 14. 9 mg/ mL ) 与对照组比较: * * P < 0. 01; 与
皮质酮组比较: # # P < 0. 01; 与 T XR 组比较: △P< 0. 05; 与皮
质酮+ TXR-A ( 3. 75 m g/ mL) 组比较: ▲P < 0. 05
1-con trol 2-cor ticosteron e 3-cort icosterone + T XR 4-
cort icosterone + T XR-A ( 3. 75 m g/ mL ) 5-cor ticoster on e+
T XR-A (7. 45 mg/ mL ) 6-cort icos terone+ TXR-A ( 14. 9 mg/
mL )
* * P < 0. 01 v s cont rol group; # # P < 0. 01 v s cort icosterone
group; △P < 0. 05 vs T XR group ; ▲P < 0. 05 v s cort icosterone+
T XR-A (3. 75 mg/ mL ) group
图 2 TXR-A 对皮质酮抑制大鼠海马脑片 CA1 区
诱发 LTP 平均 PS 幅度的影响 ( n= 6)
Fig. 2 Ef fect of TXR-A on mean PS of LTP
inhibited by corticosterone in CA1 area
of rat hippocampal slices ( n= 6)
与学习记忆功能存在高度相关性的海马的损伤程度
同其认知能力衰退具有明显的相关性,前期研究表
明, 快速老化小鼠海马中的皮质酮含量呈增龄性升
高[ 8] ;皮质酮可显著抑制整体大鼠海马齿状回及离体
海马脑片 CA 1区 LTP 的诱发及维持[ 1, 2] ,这与文献
报道一致[ 9, 10]。
本实验以 LTP 为观测指标, 首先观察了皮质酮
对大鼠海马脑片 LTP 的抑制作用, 并在此基础上研
究了 T XR-A 对皮质酮抑制大鼠海马脑片 LT P 的影
响。结果表明,皮质酮并不影响大鼠海马脑片的基础
突触传递,加入 T XR-A 也没有改变。相同于或 2倍
于 T XR 浓度的 TXR-A 可以增强被皮质酮抑制的
LTP 幅度,并具有一定的量效关系,两倍浓度的作用
明显优于 T XR。因此, TXR 的该活性部位可能是发
挥原方对抗皮质酮抑制大鼠海马脑片诱发 LT P 的主
要成分之一,它拮抗皮质酮抑制 LT P 的作用可能也
是其益智的机制之一。然而,在正常脑片上的实验表
明,不但与 T XR 相同浓度的 T XR-A 对 LT P 的促
进作用不如 TXR, 即使 2 倍浓度的 TXR-A 作用也
不如 T XR (结果另文发表) ,这又提示 T XR-A 发挥
益智作用与受试对象的机能状态有关, 其对改善皮质
酮损害 LT P 具有特异性。由于皮质酮抑制海马 LT P
的诱发和维持与 Ca2+ 及一些与 LTP 关系密切的蛋
白激酶的磷酸化有关,因此,该活性成分可能是通过
改善皮质酮的这种抑制作用来促进 LT P 的诱发并发
挥益智作用的。
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