全 文 ：·药理实验与临床观察·
调心方对 β淀粉样蛋白所致大鼠海马神经元凋亡的调控作用
姚明忠 ,赵伟康
(上海中医药大学老年医学研究所 ,上海　 200032)
摘　要:目的　探讨调心方的药效及作用机制。方法　原代培养大鼠海马神经元 , Aβ 1-42诱导神经细胞毒模型。采
用 FDA与 PI双染检测神经元存活率 , Hoechst 33258染色、 TUN EL判断神经元凋亡 ,免疫细胞化学研究 Caspase-
3表达 , N o rthern Blo t、 RT-PCR研究凋亡相关基因 ( bcl-2、 bax、 c-jun、 c-fo s)表达。结果　神经元经 Aβ l-42处理后 ,
活细胞数减少 ,染色质浓缩、核碎裂 , TUNEL染色阳性神经元增多 , Ca spase-3表达增加 , bcl-2 m RNA表达减少 ,
而 bax与 c-jun表达增加、 c-fo s的表达变化不明显。调心方可显著改善上述变化。结论　调心方对 Aβ 1-42神经细
胞毒有保护作用 ,可提高细胞存活率 ,抑制凋亡。其机制可能通过提高 bcl-2 m RAN水平 ,降低 bax和 c-jun m RAN
水平 ,减少 Caspase-3表达而实现。
关键词: β淀粉样蛋白 ;调心方 ;神经元凋亡 ;半胱天冬酶 -3,凋亡相关基因表达
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 06 0521 04
Regulating effect of heart-beneficial recipe onβ-amyloid
induced apoptosis of rat hippocampal neurons
YAO Ming-zhong , ZHAO Wei-kang
　　 ( Institute of Geriatrics, Shanghai Univ er sity o f TCM , Shanghai 200032, China )
Abstract: Object　 To study the ef fect and mechanism o f hear t-beneficial recipe ( HBR) on β-amyloid
induced neuronal apoptosis. Methods　 In o rder to establish neuro to xic model, the primary cultured rat
hippocampal neurons w ere t rea ted wi th 25μmo l /L aggrega ted β-amyloid f ragment 1-42 ( Aβ 1-42) . Neu-
ronal surviv al was a ssessed by viable counting af ter double-stained w ith f luorescein diacetate ( FDA) and
propidium iodide ( PI) . Apopto sis o f neurons w as determined by Hoechst 33258 staining and terminal
t ransferase deoxyuridine nick-end labeling ( TUNEL) staining. The pro tein expression o f Caspase-3 w as
examined by immunocy tochemical SABC method. The transcription o f mRNAs rela ted to bcl-2, bax , c-jun
and c-fos gene w ere observ ed by No rthern Blo t or RT-PCR method. Results　 In the Aβ 1-42 trea ted neu-
rons, the number o f v iable cell w as decreased. Hoechst 33258 staining show ed condensation of nuclea r
chroma tin and nuclear f ragmenta tion. TUN EL staining revealed tha t the number of posi tiv e neuron w as
increased. The expression o f Ca spase-3 pro tein w as eleva ted. The expression of bcl-2 mRNA was de-
creased, but bax and c-jun mRNA were inerea sed. Af ter HBR treatment, the above indexes w ere im-
proved. Conclusion　 HBR could regulate the expression of apopto sis-associated gene and Caspase-3, at-
tenuate the neuro to xic action of Aβ 1-42 and improve neuronal viabi li ty via suppressing apopto tic process.
Key words: β -amyloid pro tein; heart-beneficial recipe; neuronal apoptosis; Caspase-3; apopto sis-as-
sociated gene expression
　　 Alzheimer病 ( AD)的主要病理特征为神经元
丢失、大量老年斑 ( SP)、神经纤维缠结 ( N FT)。其发
病机制有: β淀粉样蛋白 (β-amyloid, Aβ )毒性说 [1 ]、
Tau蛋白异常修饰说、神经细胞凋亡说 [2, 3 ]等。 中医
认为 AD属“神病”范畴 ,就五脏而言 ,心与“神”直接
相关 ,治疗 AD可从调心立法 ,调心方即以此为依
据 ,经临床疗效观察 ,能有效改善轻中度 AD患者的
记忆力、智力、认知功能、生活能力 [4, 5 ]。实验发现调
心方可显著改善 Aβ诱导的大鼠痴呆模型学习记忆
障碍 ,提高 Aβ大鼠下降的 ChAT活性和 M受体 Rt
值 [6 ] ,但其作用机制还有待深入研究。实验拟针对
AD的病理特征 ,根据“ Aβ毒性说”建立 Aβ所致的
·521·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 6期
收稿日期: 2000-10-26基金项目:国家自然科学基金重点项目 ( No. 39830450)及上海市教委科技发展基金 (No. 98CJ01)资助作者简介:姚明忠 ( 1962-) ,男 ,江苏丹阳人 ,副教授 ,博士 ,现在中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所进行博士后研究 ,研究方向为延缓衰老、 Alzheimer病研究及基因治疗。
神经细胞毒模型 ,从神经细胞凋亡角度 ,探讨调心方
的药效与作用机制。
1　实验材料
Wista r孕鼠 (上海中医学大学实验动物中心 )。
调心方 (党参、桂枝、茯苓、远志、菖蒲等组成 ,上海市
中医药研究院老年所提供 )。 Aβ 1-42( 37℃孵育 3
d,使其变成聚集状态 )、 Tacrine ( Sigma ) ,小鼠抗大
鼠 CPP32单克隆抗体 ( Santa Cruz) , SABC免疫组
化染色试剂盒 (博士德公司提供 ) , In Si tu Cell
Apopto sis Detection Ki t , POD(华美公司提供 ) ,随
机引物标记盒、 Access RT-PCR盒 ( Promega ) , [α-
32
P ] dCT P(北京亚辉公司 ) , bcl-2、 c-jun c-fo s cD-
N A探针 (北京市肿瘤研究所提供 ) , bax PCR引物
(北京赛百盛公司合成 ) ,β -actin cDN A探针及 PCR
引物 (德国 Leipzig大学 Dr Chen赠送 )。
2　实验方法
2. 1　大鼠海马神经元原代培养与鉴定:从 18～ 19 d
Wista r胎鼠取海马进行神经元原代培养。培养至 12
d的神经细胞经神经元特异性烯醇化酶 ( NSE)免疫
细胞化学 ( SABC法 )鉴定 ,神经元占 95%以上。
2. 2　调心方含药血清的制备及剂量 -效应关系:雄
性 Wistar成年大鼠 20只 ,分为:生理盐水组、调心
方低、中、高剂量组。低、中、高剂量组分别以成人等
效剂量的 2, 3. 5, 5倍 ig大鼠 ,每天给药 2次 ,连续 3
d,末次给药后 1 h采血 ,分离血清。采用神经元存活
率测定 ( M T T比色分析 )研究剂量-效应关系 ,观察
到调心方低剂量组为最佳作用剂量。
2. 3　细胞分组及药物干预:神经元培养至 12 d,分
为 4组:正常组、模型组 ( Aβ 1-42)、 Tacrine组 ( 0. 15
mmol /L Tacrine+ Aβ 1-42)、调心方组 (调心方药物
血清+ Aβ 1-42)。 Aβ 1-42的终浓度为 25μmo l /L,
处理 24 h。
2. 4　调心方对 Aβ所致的神经元存活率的影响:
FDA与 PI双染法。
2. 5　调心方对 Aβ 所致的神经元凋亡的影响:
Hoechst 33258染色与 TUN EL(按试剂盒说明书
操作 )。
2. 6　调心方对 Aβ所致的蛋白酶 Caspase-3表达的
影响: SABC法。
2. 7　调心方对 Aβ所致的神经元凋亡相关基因表
达的影响
2. 7. 1　 Northern印迹杂交:细胞总 RNA提取采用
异硫氰酸胍一步法 ,其它步骤按分子克隆实验指南
方法 [7 ]进行。
2. 7. 2　 RT-PCR: bax PCR引物: 5′TCAGCC-
CATCT TCT TCCAGAT GGT 3′, 5′CCACCAGC-
TCTG AACAGATCATGA 3′; β -actin PCR引物:
5′ CCAGCCA TGTACGTT GCT ATCCAG 3′, 5′
GGAACCGCTCATT GCCAATGGTGA 3′。按 Ac-
cess RT-PCR盒说明书操作。
2. 8　图像处理与结果分析:采用 LEICA Q500IW图
像分析系统分析积分吸光度 ( IA) ,所得数据用 SPSS
9. 0统计软件进行方差分析 (o ne-w ay ANOVA)。
3　结果
3. 1　调心方对 Aβ所致神经元存活率的影响 ( FDA
与 PI双染法 ):荧光境下观察到活细胞呈绿色、死细
胞呈红色。正常组、模型组、 Tacrine组、调心方组神
经元存活率 (% ) ( x± s , n= 6)分别为 100. 00±
12. 69, 38. 47± 7. 29, 50. 92± 8. 28和 76. 53±
12. 49。 模型组神经元存活率较正常组显著降低
( P < 0. 01) ; Tacrine组、调心方组神经元存活率较
模型组均显著升高 ( P < 0. 05或 P < 0. 01) ;调心方
组与 Tacrine组之间比较有显著性差异 ( P < 0. 01)。
3. 2　调心方对 Aβ所致的神经元凋亡的影响
3. 2. 1　 Hoechst 33258染色: 荧光镜下观察到正常
组细胞核形态较大 ,染色质密度低而均匀。模型组染
色质浓缩 ,甚至核碎裂。调心方组染色质浓缩或核碎
裂的细胞有所减少 ,而 Tacrine组的变化不太明显。
3. 2. 2　 TUN EL:正常组、模型组、 Tacrine组、调心
方组 TUNEL染色阳性神经元数 ( x± s , n= 6)分别
为 3. 50± 1. 87, 78. 67± 13. 69, 72. 50± 11. 95和
46. 83± 9. 28。 模型组 TUN EL染色阳性神经元数
较正常组显著升高 (P < 0. 01) ;调心方组较模型组
显著下降 ( P < 0. 01) ; Tacrine组有下降趋势 ,但无
统计学意义 ,调心方组与 Tacrine组之间比较有显
著性差异 ( P < 0. 01)。
3. 3　调心方对 Aβ所致的蛋白酶 Caspase-3表达的
影响:正常组、模型组、 Tacrine组、调心方组积分吸
光度 ( IA) ( x± s , n= 6)分别为 460. 59± 160. 99,
2 006. 62 ± 661. 15, 1 792. 58 ± 650. 90 和
1 043. 11± 296. 00。 模型组 Caspase-3表达较正常
组明显升高 ( P < 0. 01) ;调心方组的表达较模型组
明显降低 ( P < 0. 01) , Tacrine组有降低趋势 ,但无
统计学意义。
3. 4　调心方对 Aβ所致神经元凋亡相关基因 ba1-
2、 bax、 c-jun、 c-fos表达的影响: bcl-2、 c-jun、 c-fo s、
β-actin cDN A探针进行 Northern印迹杂交后放射
自显影 (图 1～ 3) ,图像分析系统进行积分吸光度
·522· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 6期
( IA)检测 ,结合内参照 β-actin的 IA值进行上样量
校正。 Bax及 β -actin引物同时进行 RT-PCR, PCR
产物琼脂糖凝胶电泳 (图 4) ,可见扩增出了 540 bp
( bax )及 378 bp(β -actin)条带 ,图像分析系统进行积
分吸光度 ( IA)检测 ,同样结合内参照 β-actin的 IA
值进行上样量校正 (表 1)。
A-正常组　 B-模型组
C-Tacrine组　 D-调心方组
图 1　 bcl-2 Northern印迹杂交
图注同图 1
图 2　 c-jun Northern印迹杂交
图注同图 1
图 3　 c-f os Northern印迹杂议
B-PCR Marker 为 1031, 900, 800, 700, 600,
500, 400, 300 bp(自下而上 ) ,其余图注同图 1。
图 4　 bax RT-PCR产物琼脂糖凝胶电脉
表 1　调心方对 Aβ 所致神经元凋亡相关基因 bcl-2、
bax、 c-jun、 c-f os表达的影响 (校正后的 IA值 )
组别 bcl-2 bax c-jun c-fos
正常 　 1 655. 32　　 96. 46 　 1920. 74 　 1054. 40
模型 621. 32 149. 61 2343. 20 1175. 23
Tacrine 729. 55 131. 99 2035. 22 1138. 59
调心方 1 466. 45 107. 02 1979. 36 1094. 38
　　结果显示: ( 1) bcl-2:模型组的 bcl-2表达较正
常组降低了 62. 46% ,而 Tacrine组、调心方组的表
达较模型组分别升高了 0. 17, 1. 36倍。( 2) bax: 模型
组的 bax表达较正常组升高了 55. 10% ,而 Tacrine
组、调心方组的表达较模型组分别降低了 11. 78% ,
28. 47% 。 ( 3) c-jun:模型组的 c-jun表达较正常组升
高了 21. 99% ,而 Tacrine组、调心方组的表达较模
型组分别降低了 13. 14% , 15. 53% 。 ( 4)c-fos: 模型
组的 c-fos 表达较正常组升高了 11. 46% ,而
Tacrine组、调心方组的表达较模型组分别降低了
3. 21% , 6. 88% ,变化不甚明显。
4　讨论
鉴定 Aβ神经毒作用 ,首先要检测 Aβ是否损伤
了培养的神经元 ,可用细胞存活率来判断 ,经 FDA
和 PI双染后细胞计数看到了 Aβ具有神经毒作用 ,
损伤了培养神经元 ,使细胞存活率降低。 Aβ的神经
毒性机制非常复杂 ,通过上述方法还不能区分神经
元损伤的类型 ,即无法区分坏死与凋亡。研究应用了
Hoechst 33258染色、 T UN EL进行观察 ,显示 Aβ处
理神经元后 ,出现了凋亡特征 ,因此可判断 25
μmol /L聚集状态的 Aβ引起的神经元损伤类型主
要是凋亡 ,即凋亡是神经元存活率降低的重要原因。
大量的事实证明凋亡发生是一个复杂的、由
Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程。 该
家族成员 Caspase-3 ( CPP32)是哺乳动物细胞凋亡
中的关键蛋白酶。研究观察到 Aβ引起 Caspase-3的
表达升高 ,说明可经过 Caspase-3蛋白酶途径引起
神经元凋亡。
细胞凋亡作为许多生理、病理现象的最终结局 ,
其调节也比较复杂。bcl-2是一个公认的凋亡抑制基
因 , bax是 bcl-2家族中与 bcl-2功能相反的一个基
因 ,可促进细胞凋亡。 Bcl-2 /Bax组成一个平衡体
系 , Bax过剩则细胞凋亡加重 ,而 Bcl-2过多则细胞
调亡被抑制。 c-jun和 c-fos是即早反应基因 ( IEG) ,
它们对细胞内外的各种刺激和 DN A损伤做出反
应 ,表达增加。 c-jun、 c-fos编码蛋白组成异源二聚
体 ,称为 Ap-1, AP-1是一个重要的转录因子 ,结合
于 DNA上可诱导细胞凋亡。本研究观察到 Aβ可以
使 bcl-2基因转录减少 ,而 bax、 c-jun的转录增加 ,
·523·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 6期
表明 Aβ诱导的神经元凋亡是通过一些凋亡相关基
因表达的改变来实现。
调心方由党参、桂枝、茯苓、远志、菖蒲等组成 ,
党参补益元气、安神益智 ,为君 ;桂枝温通经脉、振奋
心阳为臣 ;茯苓益气凝神、化痰强记 ,远志安神、益
智、开窍 ,二药为佐 ;菖蒲豁痰通窍增智为使 ,全方共
奏益心气、振心阳、化痰浊、通心窍之功效。研究发现
调心方能减轻 Aβ诱导的神经元凋亡 ,使细胞存活
率增加 ,这可能是调心方临床发挥疗效的机制之一。
研究还发现调心方可降低 Caspase-3的表达 ,
对凋亡相关的 Caspase-3途径进行调控。在凋亡相
关基因的 m RNA表达研究中心发现 ,调心方可提高
bcl-2表达 ,降低 bax和 c-jun的表达 ,通过对这些凋
亡相关基因表达的调控 ,来抑制 Aβ诱导的神经元
凋亡。 实验中调心方对 c-fos表达的调控作用不明
显 ,可能是由于 c-fos属于即刻早期反应基因 ,处理
24 h后其表达变化的高峰已过。
参考文献:
[ 1 ]　 Selkod D J. Alzh eimer s diseas e: a cen tral role for am yloid
[ J] . J Neu ropathol Exp Neu rol , 1994, 53: 438-447.
[2 ]　 Smale G, Niciiol s N R, Brady D R, et a l. Evid ence fo r apop-
totic cell d eath in Alzheimer s dis ease [ J]. Ex p Neu rol , 1995,
133: 225-230.
[3 ]　 Baringa M . Is apoptosis key in Alzh eimer s diseas e? [ J] . Scie-
nce, 1998, 281: 1303-1304.
[ 4 ]　林水淼 . 调理心肾治疗老年性痴呆 [ J ] . 中国中西医结合杂
志 , 1992, 12( 7): 393.
[5 ]　林水淼 ,杨柏灿 .养心健脑液治疗 Alzheimer痴呆的临床观察
[ J ]. 上海中医药大学上海市中医药研究院学报 , 1996, 10( 2):
44-47.
[6 ]　周　晖 ,赵伟康 . 调心方对 Aβ大鼠痴呆模型空间学习记忆障
碍和胆碱能系统的影响 [ J] .中药药理和临床 , 1998, 14 ( 3):
29-31.
[ 7]　 J. 萨姆布鲁克 , E. F.弗里奇 , T. 曼尼阿蒂斯 .分子克隆实验
指南 [M ]. 第二版 . 北京:科学出版社 , 1992.
海嘧啶抗肿瘤作用的实验研究
季宇彬 ,高世勇 ,孔　琪 ,张秀娟 ,杨宝峰
(哈尔滨商业大学 制药工程系 ,黑龙江 哈尔滨　 150076)
摘　要: 目的　研究海嘧啶的抗肿瘤作用。 方法　采用 M T T实验和集落形成实验观察海嘧啶的体外抗肿瘤作用 ;
通过海嘧啶对 FC小鼠和 S180、 H22荷瘤小鼠瘤重和生存时间的研究 ,观察了海嘧啶的体内抗肿瘤作用。结果　海嘧
啶对 8种人癌细胞具有一定的杀伤作用 ,以对 BGC-823、 Eca-109、 HCT-8细胞的抑制作用最强 ;对 BGC-823、 Eca-
109、 HCT-8细胞的集落形成有明显的抑制作用 ,以对 Eca-109细胞集落形成抑制作用最强 ;可明显抑制 FC小鼠和
S180小鼠瘤体的生长 ,明显延长 H22荷瘤小鼠的生存时间。 结论　海嘧啶由中药复方和 5-Fu两部分复合而成 ,其抗
肿瘤作用与二者相比具有明显的协同作用 ,使抑瘤率大幅度提高。
关键词: 海嘧啶 ;荷瘤小鼠 ;抗肿瘤作用
中图分类号: R979. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 06 0524 04
Experimental studies on antitumor activities of Haimiding
JI Yu-bin, GAO Shi-yong , KONG Qi, ZHANG Xiu-juan, YANG Bao-feng
　　 ( Depa rtment o f Pharmaceutica l Engineering , Harbin Commercial Univ er sity , Harbin Heilong jiang 150076, China)
Abstract: Object　 To study the antitumor activ ities o f Haimiding . Methods　 The in vit ro anti tumo r
action w as observ ed by M T T and colony fo rmation, i ts in vivo effects were studied by observ ing tumo r
w eight and surv iv al time of FC, S180 and H2 2 mice. Results　 Haimiding is a pow erful anti tumo r agent in 8
kinds of human cancer cell line, especially on BGC-823, Eca-109 and HCT-8, wi th Eca-109 being the most
susceptible. Haimiding also inhibits the g row th o f cancer cells of FC and S180 mice and prolong s the survival
time of H22 mice. Conclusion　 Haimiding is a compounded preparation consisted o f 5-Fu and Chinese
medicine, they show ed obvious synergistic effect to inhibi t the g row th rate of tumo rs.
Key words: Haimiding; tumo r bea ring mice; anit tumor activi ty
·524· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 6期
收稿日期: 2001-01-11基金项目:国家科委生命中心博士基金资助 (项目号: 96-901-06-10) ;中国优秀博士后基金资助 (中博号 [ 1999 ]17号 ) ;黑龙江省杰出青年基金资助 ( J9906) ;黑龙江省自然科学基金项目资助 (项目号: D9801)作者简介:季宇彬　男 ,博士 ,教授 ,硕士、博士研究生导师 , 44岁。多年来一直致力于中药药理、肿瘤药理、分子药理学研究 , 1999年进入哈尔滨医科大学博士后工作流动站工作。
* 哈尔滨医科大学博士后导师