全 文 ：·1652· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs39卷第11期2008年11月
表9甘草微丸粉体学参数(一=5)
Table9 Mtcromeriticsparameter
ofGancaopellets(席=5)
批号 收率／％ 圆整度／(9)堆密度／(g·mL。1)脆碎度
速力100r／rain，水浴温度(37士0．5)℃，于设定时间
取样5mL，同时补加同温等量磷酸盐缓冲液。经
0．45弘m微孔滤膜滤过，吸取续滤液10弘L，采用
HPLC法分别测定芍药苷、甘草酸的峰面积，根据线
性方程计算质量浓度。以微丸中有效成分的实际质
量为100％，计算芍药苷、甘草酸的累积溶出率。结果
表明两种微丸在30min内体外溶出均达90％以上，
因此可以认为是微丸。结果见图2。
蠢80
链
匿40
磷
O
0 20 40 60
t／rain
圈2芍药徽丸和甘草微丸中有效成分的体外溶出
曲线(厅=3)
Fig．2Dissolutioncurvesofactivecomponents
Inpellets白=3)
3讨论
用挤出滚圆的方法分别制备了芍药、甘草微丸，
其在30min内体外溶出均达90％以上，且微丸圆整
度好、收率高，可进一步通过包衣制备芍药、甘草缓
释微丸，为芍药甘草方效应组分释药行为的配伍研
究奠定基础[3]。
药物的溶解度是药物的一项重要理化性质，中
药复方为多成分组成的混合物，每种成分的各自溶
解度不同。本实验分别测定药物不同指标性成分在
不同介质中的表观溶解度，为溶出介质的选择提供
了依据。提取物的理化性质、粉体学性质对微丸的处
方及工艺有重大的影响，为中药复方各组分进行制
剂的适宜性研究提供借鉴意义。
中药提取物一般易吸潮，无论在乙醇中或水中
黏度均较大。润湿剂或黏合剂的用量稍改变，软材性
质将产生较大变化，即在挤出滚圆中适合成球的润
湿剂或黏合剂的用量范围较窄。在以中药提取物为
原料的微丸制备过程中，控制软材润湿剂的比例是
挤出滚圆工艺中最关键的因素。相对增加中药物料
软材制备的湿度，能降低黏性和韧性，使之能被剪切
打断、成球；降低湿度，则挤出物塑性增强，韧性增
大，滚圆中不易被剪切打断，即使被打断在滚圆中也
多呈哑铃型或棒状。
参考文献：
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杂志，200l，10(9)：661—664．
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复方释药系统[J]．中国中药杂志，2006，31(20)。1669—1670．
斑点免疫印迹法快速测定地龙炮制品中蚓激酶及其水解产物
王厚伟
(山东中医药大学药学院，山东济南250355)
摘要：目的 测定参环毛蚓、秉氏环毛蚓、日本杜拉蚓和天锡杜拉蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物，建立斑点免
疫印迹法评价相应生药材药效成分明确的中药炮制品质量新方法。方法 以兔抗蚓激酶单抗为一抗，应用斑点免
疫印迹法对地龙炮制品中蚓激酶及其水解产物作定性检测．杂交信号应用QuantityOne软件作定量分析。结果
现行中药材参环毛蚓与山东产地方品种：秉氏环毛蚓、日本杜拉蚓、天锡杜拉蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物的质
量分数分别为125．23、118．34、81．05、72．13pg／g。结论秉氏环毛蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物与现行地龙炮
制品参环毛蚓无显著差异，理论上可作为广地龙的替代晶。斑点免疫印迹法简便快捷，结果准确，无需大型设备，可
用于地龙与类似中药材炮制品的品质评价。
收稿日期：2008—03—28
基金项目：山东省教育厅资助项目(J06L17)I山东省优秀中青年科学家奖励基金资助项目(2007BSBl4087)，山东省中药理论与技术倒
新团队资助项目
作者简介：王厚伟(1973一)，山东日照人。博士，讲师，主要研究方向中药生物工程。Telt(0531)82613129E—mail：houweiw@163．corn
万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月· 653·
关键词：地龙；斑点印迹l蚓激酶
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)11—1652—04
Rapiddeterminationoflumbrukinaseandithydrolysates
inprocessedearthwormbydotblotting
WANGHOR—wei
(CollegeofPharmacy，ShandongUniversityfTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China)
Abstract：ObjectiveTodeterminethelumbrukinasecontentsanditshydrolysatesinprocessed
earthworm，setupan wevaluatingmethodofdotblottingtoevaluatethequalitiesofthoseprocessed
Chinesemedicinesasearthworm．MethodsContentsoflumbrukinaseanditshydrolysatesinprocessed
earthworme edeterminedbydotblottingwithrabbitantibodyfanti—lumbrukinaseasthefirst
antibody．BlottingsignalwasanalyzedbyQuantityOnesoftware．ResultsContentsoflumbrukinaseand
itshydrolysatesinprocessedearthwormofPheretimaaspergilum，P．pingi，Drawidajaponica，andD．
gistiwere125．23，118．34，81．05，and72．13ttg／g，respectively．ConclusionTherewasno g ificant
differencebetweentheprocessedearthwormsfP．aspergilumandP．pingiinthecontentof
lumbrukinaseandit hydrolysates，bothofwhichwerehigherthanthoseoftheothertWOspeciesn
Shandong．Theoretically，theprocessedpro uctsofP．pingicouldbeusedasthesuccedaneumofP．
aspergilumintheclinicaloftraditionalChinesemedicine．Dotblot ing，asaconvenientandaccurate
method，couldbebroadlyusedforthevaluationoftheprocessedpro uctsofChinesecruderugssimilar
toearthworm．
Keywords：earthworm；dotblotting；lumbrukinase
蚓激酶是活体地龙中含有的一种具有溶栓药效
的纤维蛋白水解酶，是该种生药材质量评价的重要
指标成分。中医临床应用的是地龙的干燥体，是将新
鲜活体地龙经沸水烫死后洗净、去除内脏、切段，以
及干燥等工艺加工而成。蚓激酶对温度敏感，在炮制
过程中容易遭受地龙中其他蛋白酶的攻击而发生水
解或降解，地龙炮制品中的蚓激酶活性很低，无法作
为其品质评价指标。大量研究表明，地龙炮制品发挥
溶栓药效作用的主要物质基础是蚓激酶的水解产物
与未发生水解作用的少量蚓激酶[1]。鉴于蚓激酶水
解产物的不确定性，传统用于中药质量评价的
HPLC法无法直接测出地龙炮制品中该类组分的
量。因此还没有建立这类直接应用于中药炮制品质
量评价的便捷方法，除非作繁琐的药效学检验。基于
大分子蛋白质抗原的水解产物大都能够与原抗原抗
体结合的特性，本实验拟用斑点免疫印迹的方法检
测地龙炮制品中蚓激酶及其水解产物。斑点免疫印
迹法是一种建立在Western—blotting技术上的基于
药物免疫原性的免疫杂交方法乜]。基于蚓激酶抗体
对地龙炮制品中的蚓激酶及其水解产物的免疫识别
作用，以兔抗蚓激酶单抗为一抗，与地龙炮制品水提
液在硝酸纤维素膜上作免疫杂交，经HRP标记的二
抗催化底物ECL显色，应用QuantityOne软件对杂
交斑点作定量分析，可以平行比较不同种质地龙炮
制品间蚓激酶及其水解产物的量。
1仪器与试药
广地龙药材购自山东中医药大学附属中鲁医
院，山东产地方品种日本杜拉蚓Drawidajaponica
(Mich．)采集于莱芜水沟的黑色粘土中，天锡杜拉
蚓D．gisti(Mich．)采集于济南郊区草地的褐色粘
土中，秉氏环毛蚓Pheretimap ngi(Stephenson)采
集于山东省农业科学院药用植物园的沙土中，由本
教研室鉴定，按《中国药典》2005年版方法加工为炮
制品。蚓激酶标准品(Sigma公司)，硝酸纤维素膜与
兔抗蚓激酶单抗(gF南翔科生物技术有限公司)；辣
根酶标记山羊抗兔IgG、ECL试剂盒(北京中山
公司)。
2方法与结果
2．1供试品溶液的制备：准确称量4种地龙炮制品
各20g，加人25mmol／LPBS20mL，搅拌浸润30
min后，充分研磨浸提30min，其间，分3次加入60
mLPBS。然后，转移至2个50mL离心管4000×g
离心30min，上清滤过去脂，收集于250mL量瓶中。
沉淀加入20mLPBS重新悬浮，研磨浸提30rain，
4000×g离心30min，取上清液合并于量瓶中，定
容至250mL，即得。
2．2标准品溶液的制备：精密称取蚓激酶标准品
1．6mg，置于10mL量瓶中，加水至刻度。摇匀，用
万方数据
·1654· 中革焉ChineseTraditionalandHerblDrugs第39卷第11期2008年11月
作标准品储备液(160vg／mL)。精密量取标准品储
备液1、0．75、0．5、0．25mL，置于4个10mL量瓶
中，加水至刻度，摇匀，即得质量浓度为16、12、8、4
／-g／mL的蚓激酶抗原标准液。以1g／L的BsA(小牛
血清白蛋白)溶液与50mg／mL脱脂奶粉作为阴性
标准品溶液。
’
2．3 斑点免疫印迹干扰试验：取50pLBSA溶液点
加到硝酸纤维素膜上，重复5次，以50mg／mL脱脂
奶粉封闭2h后，室温下先用一抗兔抗蚓激酶抗体
(1：1000稀释)孵育2h，PBS—T洗膜1h，再用辣根
过氧化物酶标记的山羊抗兔lgG二抗(1：2000稀
释)孵育1h，PBS—T洗膜30rain后，按Amersham
公司试剂盒说明书进行ECL显影。显影结果无杂交
斑点出现，表明BSA与脱脂奶粉蛋白对蚓激酶抗体
无免疫识别作用，该2种阴性标准品溶液对斑点免
疫印迹试验结果无干扰。
2．4线性关系考察：取16、12、8、4弘g／mI．蚓激酶抗
原标准液与1g／LBSA阴性对照溶液各50pL，点加
到硝酸纤维素膜上(相当于蚓激酶标准品的质量为
0、0．2、0．4、0．6、0．8ug)。参照斑点免疫印迹干扰试
验项下方法作斑点免疫印迹，印迹斑点采用
Quantityone软件作轨迹定量扫描分析(图l-A)，背
景排除的RollingDiskSize值设为5。应用轨迹定量
法测定不同质量浓度标准液的杂交信号。以质量浓
度为横坐标，轨迹信号量为纵坐标，得回归方程Y一
3．0844X，R2=0．9494。结果表明蚓激酶抗原在O～
16pg／mL内与Dotblotting斑点的轨迹信号量的线
性关系良好。
2．5精密度试验：取广地龙炮制品溶液50弘L，点加
到硝酸纤维素膜上，重复5次，作斑点免疫印迹，应
用轨迹定量法测定杂交斑点的轨迹信号量，5次重
复的平均值为31．07INT‘mm，RSD为0．9％。
2．6稳定性试验：取广地龙炮制品溶液50pL，点加
到硝酸纤维素膜上，分别于0、2、4、6、8h后与蚓激
酶抗体作免疫杂交，杂交信号作轨迹定量扫描分析，
计算得其RSD为1．1％。结果表明供试品溶液在8h
内是稳定的。
2．7重现性试验：称取广地龙炮制品6份，每份20
g，制备供试品溶液，取50pL点加到硝酸纤维素膜
上，作斑点免疫印迹，杂交信号作轨迹定量分析，计
算得其RSD为2．7％。
2．8加样回收率试验：精确称取0．10mg蚓激酶标
准品，加入到20mL1g／LBSA溶液中，取50pL点
加到硝酸纤维素膜上，与1：1000稀释的兔抗蚓激
酶抗体作斑点免疫印迹，重复5次，杂交信号应用
QuanityOne软件作轨迹定量扫描分析，计算得蚓
激酶的平均回收率为96．85％，RSD为1．4％。
2．9样品测定：各取4种地龙炮制品的浸提液50
肛L，点加到硝酸纤维素膜上，与1：1000稀释的兔
抗蚓激酶抗体作斑点免疫印迹，重复5次，杂交信号
应用QuanityOne做定量分析(图1一B)。根据回归方
程得出4种地龙炮制品中蚓激酶及其水解产物的浓
度与质量分数，见表1。可见，现行中药材广地龙品种
参环毛蚓炮制品药效品质最好，蚓激酶及其水解产
物质量分数为125．23pg／g，山东地方野生种质地龙
中，秉氏环毛蚓的蚓激酶及其水解产物的量最高，质
量分数为118．34pg／g，药效品质与广地龙无显著差
异(表2)，可以作为现行中药材广地龙的替代品，其
他两种山东地龙品种日本杜拉蚓与天锡杜拉蚓的蚓
激酶及其水解产物的量显著低于广地龙。
Rf
J 2 j 4 5
1．2，3．4．5分别为16、12、8、4、0pg／mL的
蚓激酶标准液的免疫印迹斑点
1，2，3，4，and5aMblottingdotofstandardlumbru·
kinaseolutionsof18．12。8。4．and0pg／mL
Rf
2 5 4
1、2，3，4分别为秉氏环毛蚓、日本杜拉蚓、
天锡杜拉蚓与参环毛蝴样品液的免疫印迹斑点
1，2，3，and4 areblottingdotoftheprocessedeartbworm_3
ofP．pingi，D．japonicatD．giati。andP．aspergilum
圈1免疫印迹斑点(A)与轨迹扫描图(B)
Fig．1Dot—blotting(A)andtrace—scanningplot(B)
oftestsamples
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11,El·1655·
裹1轨迹定量法测定供试样品蚓激酶及其水解产物(j±，)
TableDeterminationoflumbrukinaseandithydro-
lysatesinfourprocessedearthworms
bytrace—trackingnalysis(z士$)
供试样品，器篡，篇，。芝：釜，虎黧兰，
3讨论
应用斑点免疫印迹法对4种地龙炮制品蚓激酶
及其水解产物的量的测定结果表明，山东地方品种
秉氏环毛蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物的量与现
行临床应用地龙药材参环毛蚓无显著性差异，理论
上，可作为现行地龙药材的替代品。
以现行临床应用的中药材(如水蛭、土鳖虫、全
蝎等)为对照，斑点免疫印迹法可对多种中药资源药
效品质作平行比较，是一种发现新的现行中药材替
代品、扩大中药资源范围的有效手段；对于生药的药
裹2 4品种地龙炮制品中蚓激酶及其水解产物质■分数的
LSD检验
Table2 LSDTestoflumbrukinasea dIthydrolysates
infourspeciesofprocessedearthworms
组平均致镶譬：秉鬈挈朋本杜81．0拉蚓5撅雩芸≯
效成分已明确、而在炮制中不稳定的这类中药炮制
品，可以应用斑点免疫印迹法进行质量检测与控制，
并指导临床用药，具有重大实践意义。
参考文献：
E13王宗伟，集秀文。范兴亚．蚯蚓生物工程技术研究进展EJ3．
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SpringHarborLaboratoryPress，1989．
大孔吸附树脂对丁香叶中丁香苦苷的富集工艺研究
刘 欣1，高月娟2，王建明”，许贵军2，薛红梅2
(1．浙江大学药学院，浙江杭州 310058}2．黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江哈尔滨150040)
摘要：目的研究大孔吸附树脂富集丁香苦苷类成分的工艺条件及参数。方法 以丁香苦苷为考察指标，建立
HPLC分析方法，通过考察6种大孔吸附树脂对丁香苦苷的吸附分离性能，筛选出AB一8树脂作为分离纯化丁香苦
苷类成分的介质，并对AB一8树脂的吸附性能进行研究。考察富集丁香苦苷类成分的最佳工艺条件。结果丁香叶
经水提醇沉浓缩后，以AB一8型大孔树脂为吸附剂，4BV的水洗脱出去杂质后，收集5BV50％乙醇洗脱液为最佳工
艺条件。结论大孔吸附树脂分离工艺可作为富集丁香苦苷类成分的有效方法，并为丁香叶药材的质量控制和新
型给药系统的研究奠定基础。
关键词：富集I丁香叶，丁香苦苷；大孔吸附树脂
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)11—1655—05
EnrichmentprocessofsyringopicrosideinF l umSyringaeOblataewithmacroporousresin
LIUXinl，GAOYue—juan2，WANGJian—ruin92，XUGui—jun2，XUEHong—mei2
(1．CollegeofPharmacy，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China；2．AcademyofTraditionalChineseMedicine，
HeilongjiangUniversityofTraditionalChineseMedicine，Harbin150040，China)
Abstract：ObjectiveTostudytheoptimalconditionsandparametersforthenrichmentprocessof
syringopicrosideinFoliumSyringaeOblataewithmacroporousresin．MethodsWiththe nrichment
degreeofsyringopicrosideasanin x，theanalyticalmethodofHPLCwasdeveloped，AB一8resinwas
收稿日期：2007—05—23
。
基金项目：教育部博士点专项基金资助项目(20060228005)
作者简介：刘欣(1974～)，男，黑龙江省哈尔滨市人，讲师，中药学博士生．浙江大学药学院博士后，主要从事中药新型给药系统、药物
作用机制研究。Tel：(0571)88208457E—mail：Liuxinyyll@yahoo．corn．cn
·通讯作者王建明Tel／Faxl(0451)8219626—2E-mail：wangjianming@hljucm．net
万方数据
斑点免疫印迹法快速测定地龙炮制品中蚓激酶及其水解产物
作者： 王厚伟， WANG Hou-wei
作者单位： 山东中医药大学药学院,山东,济南,250355
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(11)
被引用次数： 2次
参考文献(2条)
1.王宗伟;梁秀文;范兴亚 蚯蚓生物工程技术研究进展[期刊论文]-中草药 2000(05)
2.Sambrook J;Fritsch E F;Maniatis T Molecular Cloning;A LaboratoryManua 1989
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引证文献(2条)
1.陈丽艳.张迎.綦菲.宋芳婷.王伟明 地龙的鲜品和干品可溶性蛋白及纤溶酶活性的对比研究[期刊论文]-中国实验
方剂学杂志 2012(8)
2.蔡皓.秦昆明.刘晓.李嬛.陆兔林.蔡宝昌 中药饮片质量标准的研究现状及相关思考[期刊论文]-世界科学技术-中
医药现代化 2011(3)
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