全 文 ：12麻黄碱　22伪麻黄碱
12ephedrine　22p seudoephedrine
图 1　麻黄碱对照品 (A)、风湿关节炎片 (B)
和阴性液 (C)的 HPLC 图谱
F ig11　HPLC chromatogram s of ephedr ine (A) ,
Fengsh i Guan j ieyan Tablet (B) ,
and negative sample (C)
献报道的R P2H PL C 方法较多[2～ 4 ]。实验曾选用甲
醇20101 mo löL 磷酸二氢钾 (以磷酸调至 pH 215)、
十二烷基硫酸钠溶液2乙腈2磷酸作为流动相, 前者
pH 值较小、使用一段时间后造成柱效明显降低, 而
离子对色谱平衡时间长、在所选波长处噪音大、难清
洗。本实验选择的色谱条件下麻黄碱和伪麻黄碱分
离度较好, 适合企业常规质控。
312　未对制剂中的伪麻黄碱定量分析, 但实验中精
密称取伪麻黄碱对照品 213 m g, 用甲醇溶解定容至
5 mL , 稀释 10 倍后在上述色谱条件下进样, 以确定
此色谱条件下图谱中伪麻黄碱的位置。
313　采用碱性氯仿较酸水2有机溶剂提取更为简
便, 提取效率较高。
References:
[ 1 ]　Zha L H , Su Z G, Zhang G Z, et a l1 A pp lication and research
on Ep hed ra resourse [J ]1 Ch in B u ll B ot (植物学通报) , 2002,
19 (4) : 39624051
[ 2 ]　L iang H X, Yu R G, Yang Q H , et a l1 U se of the Pow ell
m ethod to op tim ize the compo sit ion of H PL C mobile phase —
the separation of ephedrine and p seudoephedrine [J ]1 A cta
P harm S in (药学学报) , 1991, 26 (1) : 492521
[ 3 ]　L iang H , L i W Y, Chen Y1 D eterm ination of ephedrine in
Q ingxuan P reparations by H PL C [J ]1 Ch in J P harm A na l (药
物分析杂志) , 1999, 19 (4) : 27622771
[ 4 ]　Kazuh iko S, Keiich i S, Yuji I, et a l1 D eterm ination of
alkalo ids in Ep hed ra herb by h igh2perfo rm ance liqu id
ch rom atography [J ]1 Iy akuh in K enky u (医药品研究) , 1996,
27 (5) : 25522611
均匀设计与正交设计联用筛选复方银杏的最佳配比
唐春红1, 2, 蔡绍皙1, 王伯初1Ξ
(11 重庆大学生物工程学院 生物力学与组织工程教育部重点实验室, 重庆　400044;
21 重庆工商大学环境与生物工程学院, 重庆　400033)
　　正交设计是在中药复方筛选试验中使用最多的
一种设计方法, 均匀设计由于其试验次数少, 优化效
率高的优点也开始用于中药复方的筛选[1 ]。本实验
采用均匀设计联用正交设计的方法, 以内皮细胞为
作用对象, 以细胞释放的一氧化氮和细胞生长状态
作为观察指标, 对以葛根素、银杏提取物和精氨酸为
主效药的复方银杏进行最佳配比的筛选, 为以后的
深入研究奠定基础。
1　材料与方法
111　材料: 银杏提取物 GBE2828w 由贵州大学生
化中试基地惠赠。葛根素由陕西正平制药公司惠赠。
人脐静脉血管内皮细胞株 ECV 2304 (中国科学院上
海细胞生物研究所) , 干粉型DM EM öF 12培养基 (美
国H yclone 公司) , 水合联胺 (重庆东方试剂厂)。
112　仪器: CO 2 培养箱 (美国 SH ELL LAB 公司) ,
W D 800A SL —4 (格兰仕) 不锈钢型微波炉, 倒置显微
镜 (日本O lympu s 公司) , 3599 型 96 孔培养板 (美国
Co rn ing Inco rpo ra ted 公司) ,B IO —RAD 酶标仪。
113　NO 的测定: Griess R eagen t K it (Beyo t im e
B io techno logy) 在 1～ 100 Λmo löL 有很好的线性关
系。在 96 孔培养板内分别依次加入 50 ΛL 培养液、
Griess R eagen t É 和Ê , 用酶标仪在 540 nm 下测定
吸光度, 与标准曲线比较, 计算NO 浓度。
114　各药物最佳质量浓度范围的确定: 将人脐静脉
内皮细胞株 ECV 2304 传代于 50 mL 培养瓶中, 待
细胞均匀铺满瓶底, 消化细胞DM EM 2F12 培养液
吹打制成细胞悬液, 接种于 96 孔培养板中, 每孔
011 mL , 含 1×105 个细胞, 培养 24 h 后, 弃上清液
·36·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2004203216
作者简介: 唐春红 (1965—) , 女, 四川三台县人, 副教授, 现在重庆大学攻读博士学位, 研究方向为保健食品加工与天然产物制药。
(或改用无血清培养液培养 24 h, 弃上清液) , 同时
加入水合联胺和不同质量浓度的各种药物作用于细
胞, 24 h 后检测NO 浓度。优选得 GBE2828w、葛根
素和精氨酸的最佳质量浓度范围分别为 100～ 500、
011～ 50、011～ 100 ΛgömL。
115　方法设计: 按U 6 (64) 和L 9 (34) 安排试验, 优选
银杏叶提取物、葛根素、精氨酸的最佳质量浓度。
2　结果与分析
211　均匀试验设计结果: 见表 1。水合联胺损伤细
胞加药物保护后, 可以用NO 的增加为药物作用好
坏的判断指标, 另一个指标是细胞生长状态的好坏,
通过表 1 直观看出, 序号 4 的结果较好。
表 1　U6 (64)均匀设计试验及结果
Table 1　U6 (64) un iform design and results
序号
因　　素
GBE2828w
(Λg·
mL - 1)
葛根素
(Λg·
mL - 1)
精氨酸
(Λg·
mL - 1)
空
列
指　　标
NO ö
(Λmo l
·L - 1)
生长
状态
1 200 80 30 0 3. 314 形态较差
2 160 30 5 0 3. 991 形态较好
3 100 10 40 0 1. 197 形态一般
4 60 100 15 0 7. 922 形态很好
5 40 50 50 0 1. 332 形态差　
6 20 20 25 0 6. 838 形态很好
212　正交试验设计结果与分析: 见表 2。以均匀设
计表中序号 4 中的各因素的水平数为基准上下浮
动, 也可考虑单因素水平作用效果, 对各因素的水平
数进行合理取值。通过各因素不同水平的极差分析
和最优水平的排序分析, 可以得出, 该复方最佳配比
为银杏提取物 40 ΛgömL , 葛根素 120 ΛgömL , 精氨
酸 20 ΛgömL。这与正交试验表中和第 3 号组合恰巧
是一致的, 其水平的取值经综合分析是可信的, 再通
过验证试验和一系列的药理实验, 证明此最佳复方
配比是正确的。
3　结论与讨论
311　本实验通过均匀设计与正交设计联用, 筛选得
到复方银杏中药复方最佳配比为: 银杏提取物、葛根
素、精氨酸的质量浓度比为 40∶120∶20。
312　内皮细胞被认为是心、脑血管疾病基因治疗中
最佳靶细胞[2 ]。因此本研究选用内皮细胞作为药物
筛选的靶细胞, 用水合联胺对内皮细胞进行损伤, 用
不同浓度和配比的几种植物提取物对细胞进行处
理, 以内皮细胞释放的NO 和细胞的生长状态为药
物作用的判断指标对复方进行筛选。本实验得到的
复方配比能够将受损的内皮细胞恢复到正常状态,
证明它对心血管的保护机制之一是通过保护内皮细
表 2　L 9 (34)正交试验设计结果
Table 2　L 9 (34) orthogonal design and the results
试验号
GBE2828w ö
(Λg·mL - 1) 葛根素ö(Λg·mL - 1) 氨基酸ö(Λg·mL - 1) NO ö(Λg·mL - 1)
1 40 80 10 4. 601
2 40 100 15 6. 024
3 40 120 20 8. 261
4 60 80 15 5. 211
5 60 100 20 6. 499
6 60 120 10 7. 176
7 80 80 20 5. 143
8 80 100 10 5. 415
9 80 120 15 6. 905
K 1 18. 886 14. 955 17. 192
K 2 18. 886 17. 938 18. 140
K 3 17. 463 22. 342 19. 903
k1 6. 295 4. 985 5. 731
k2 6. 295 5. 979 6. 046
k3 5. 821 7. 447 6. 634
R 0. 474 2. 462 0. 903
最优组合 A 1 B 3 C3
因素主次顺序 3 1 2
胞而起作用的。
313　均匀设计与正交设计联用的优点: 将两种设计
方法有机结合, 可以扬长避短, 无论在药理学研究还
是在制剂生产工艺参数的优化研究中, 都可以在省
时、省力、省钱的基础上在整个实验范围内尽快找到
最佳的复方配比、最佳药效和最优工艺条件, 使均匀
设计的实验次数大为减少, 使正交设计能够进行直
观分析的优点在药学研究中更好地发挥出来。
314　均匀设计与正交设计联用的理论基础: 由于正
交实验设计实验次数的跳跃性和均匀设计分析时对
分析人员的数理统计知识的严格要求等, 使这两种
设计方法在药学研究中的应用受到一定程度的限
制。将均匀设计与正交设计联用是有其理论基础的,
对均匀试验设计而言, 如果没有计算机处理数据, 也
可以从试验中找到一个最优的指标, 相应的试验为
要选的工艺条件, 这种方法是建立在均匀性的基础
之上, 由于试验点分散均匀, 试验中最优的工艺条件
离试验范围内的最优工艺条件不是很远, 所以还是
有效的。这就是可以先用均匀实验设计进行复方的
粗筛, 再在此基础上用正交实验设计进行复方细筛
的理论依据, 李卫民等[1 ]通过实验证明了这一点。实
验处理结果提示, 均匀设计联用正交设计的复方筛
选方法可作为一种中药复方筛选的研究手段。
Reference:
[ 1 ]　L i W M , Gao Y, L i D H. A pp lication of un ifo rm 2design
m ethod used to select p ropo rtion of ingredien ts in Houpuw an
[J ]1 Ch in J E xp T rad it M ed F orm (中国实验方剂学杂志)
2001 (2) : 182201
·46· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月