全 文 ：中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月·759·
转基因西洋参冠瘿组织生物合成熊果苷的研究
张 章1，陈敏青1，任胜芳1，赵昱2，于荣敏p
(1．暨南大学药学院，广东广州 510632；2．浙江大学药学院，浙江杭州310031)
摘 要：目的 应用悬浮培养转基因西洋参冠瘿组织生物合成熊果苷。方法 向预培养20d的西洋参冠瘿组织培
养物中加入60mg／mL对苯二酚溶液，共培养60h后终止转化；通过TLC和HPLC方法检测产物，使用柱色谱法
分离纯化产物，利用光谱数据对其结构进行鉴定。HPLC定量分析熊果苷产生的动力学变化曲线。结果产物同时
在冠瘿组织培养物和培养基存在，并经过提取、分离得到其纯品，经理化性质和谱学方法将其鉴定为4一羟基苯一p
D一吡喃葡萄糖苷(熊果苷)。摩尔转化率在共培养60h后达到最高(88．4％)，同时，培养物和培养基中产物的量
(63．69mg／瓶，1．86mg／瓶)以及产物的分泌百分率都达到最高(2．92％)。结论在国内外首次将转基因冠瘿组
织用于生物转化系统并成功地得到具有多种药理活性的熊果苷。
关键词：熊果苷；西洋参；冠瘿组织；生物转化
中图分类号：R282．6 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)05—0759—03
BiosynthesisofarbutinfromcrowngalloftransgenicPanaxquinquefolium
ZHANGZhan91，CHENMin—qin91，RENSheng—fan91，ZHAOYu2，YURong—minl
(1．CollegeofPharmacy，JinanUn versity，Guangzhou510632，China；2．School
ofPharmaceuticalSciences，ZhejiangUniversity，Hangzhou310031，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatethebiosynthesisofarbutinbysuspensioncultureofcrowngallof
transgenicPanaxquinquefolium．MethodsHydroquinoneinmethanol(60mg／mL)wasaddedtothe
mediumofthecrowngallofP．quinquefoliuma terpreeuhuredfo20d，thentheywereCO～culturedfor
another60h．Theproductwasisolatedanpurifiedbycolumnchromatographyanditstructurewasiden—
tiffedbyphysicochemicalpropertiesndspectroscopicdata．Thedynamiccurveofbiotransformationwas
investigatedbyquantativeanalysisofarbutinw thHPLC．ResultsTheproductcouldbeobtainedfrom
bothofthecultureandmedium，whichassolatedanelucidatedas4一hydroxyphenyl—pD—glueopyra—
noside(arbutin)．AfterCO—cultur dor60h，themoleconversionratioofhydroquinoneiS88．4％，the
productcontentsincultureandmediumare63．69mg／flasknd1．86mg／flask，respectively，andthex—
cretionratioofarbutinreachesthehighest(2．92％)．ConclusionIt’Sthefir tt mearoundtheworldthat
thecrowngalloftransgenicP．quinquefoliumisusedasabiotransformationsystemandarbutinwhich
showsvariedpharmacologicalactivitesh vebeengotsuccessfully．
Keywords：arbutin；PanaxquinquefoliumL．；crowngall；biotransformation
熊果苷(arbutin)，即4一羟基苯一pD一吡喃葡萄
糖苷，最初是由熊果等植物中分离得到的一种苷类
化合物，作为美白剂广泛用于化妆品中[1]。1996年
Daeda报道了熊果苷具有抑制黑素细胞的酪氨酸酶
活性，从而阐明了熊果苷的美白作用机制[2]。2003
年，我国学者又证明了该成分具有显著的镇咳、祛痰
和平喘作用[3]，有希望研制开发成为一种新的呼吸
系统治疗药物。
生物转化是利用生物体系产生的酶对外源化合
物进行的酶催化反应[4’5]。通过文献及专利查阅发
现，目前用于生物合成／转化的植物培养系统很多，
包括愈伤组织(callus)、培养细胞、转基因毛状根
(hairyroot)等，但迄今尚未发现利用转基因冠瘿组
织(crowngall)进行天然药物活性成分的生物合
成与生物转化的文献报道[5]。
转基因冠瘿组织具有生长迅速、不需加入外源
激素、遗传性状稳定等特点[6]。笔者首次利用本室诱
导获得的西洋参冠瘿组织生物转化对苯二酚，并成
功地获得了熊果苷。本实验报道转化产物熊果苷的
分离、鉴定，同时考察了熊果苷转化的动力学过程。
收稿日期：2005—07—21
基金项目：教育部科技计划重点项目(104180)i广东省自然科学基金项目(31891)；广东省中医药局科研项目(103041)
作者简介：张章(1980一)，男，安徽人，硕士在读，研究方向为天然药物活性成分的生物合成与生物转化研究。
E—mail：zzmoxue@163．corn
*通讯作者于荣敏Tel：(020)85221469E—mail：tyrm@jnu．edu．cn
万方数据
·760· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月
1材料与试剂
1．1仪器与试剂：HZTZ双层震荡器为哈尔滨市东
联电子技术开发有限公司生产；w—CJ—IF型净化
工作台为苏州净化设备厂产品；上海申安医疗器械
厂LDX--40BI型立式自动蒸气灭菌器；Agilent
1100Series高效液相色谱仪，ZORBA×Agilent
1100色谱工作站，SBC。。色谱柱(250mm×4．6
mm，5弘m)；薄层色谱采用青岛海洋化工厂生产的
GF254硅胶；X一4数字显示显微熔点测定仪由北
京泰克仪器有限公司生产。NMR在BrukerAd—
vance400MHz核磁共振波谱仪上测定，TMS为内
标；质谱在FiniganLCQ质谱仪上测定。
1．2药品(底物)：对苯二酚，杭州市华东医药有限
公司，分析纯。用前以甲醇溶解，配成60mg／mL的
溶液。
熊果苷对照品购自中国药品生物制品检定所。
2实验方法
2．1 西洋参冠瘿组织的培养：西洋参冠瘿组织[61培
养于装有100mLMS基本培养基(不含激素)的
250mL三角瓶中，于黑暗条件下25℃震荡培养，
摇床转速为110r／min。培养基pH5．7，121℃灭菌
20min。每20d继代一次，每瓶接种冠瘿组织(鲜
重)5g。
2．2生物转化方法：西洋参冠瘿组织在上述培养条
件下预培养20d，然后无菌条件下加入60mg／mL
的对苯二酚甲醇溶液0．5mL，共培养60h。同时在
另一培养瓶中加入0．5mL的甲醇(不含对苯二
酚)作为对照。
2．3 转化产物的检测：将添加底物的冠瘿组织再培
养60h后，抽滤，分别获得冠瘿组织培养物和培养
基；培养物用蒸馏水冲洗干净，洗液与培养基合并。
培养物50LC条件下烘干36h，乳钵捻成粉末状，称
取0．01g培养物用5mL甲醇室温冷浸提取48h，
提取液分别用于TLC和HPLC检测。培养基55。C
减压浓缩至适量，等体积醋酸乙酯、正丁醇分别萃取
3次，正丁醇部位减压蒸干，甲醇溶解残渣以供
TLC和HPLC检测。
按上述方法平行处理对照组培养物，分别获得培
养物甲醇提取液和培养基正丁醇萃取物的甲醇溶液。
TLC检测条件参考文献报道[7]。HPLC检测条
件：流动相为2％乙腈一水；体积流量为0．8mL／
min；柱温30。C；检测波长280nm；进样量2肛L。
2．4转化产物的分离纯化：本实验共用150mg底
物，分别加到5瓶预培养20d的西洋参冠瘿组织培
养瓶中，共培养60h。培养物甲醇冷浸提取物用温
水混悬，然后用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇依次萃取。
将正丁醇萃取部分于55‘C减压蒸干，甲醇溶解残
渣，100～200目硅胶拌样，300～400目硅胶装柱，
行硅胶柱色谱，氯仿一甲醇(90：10、85：15、80：
20、70：30)梯度洗脱；合并80：20洗脱部分，减压
蒸干。甲醇溶解残渣，上SephadexLH20柱，甲醇
洗脱，合并相同部位，经甲醇重结晶，得到白色针状
结晶(I)37mg。
取滤除西洋参冠瘿组织后的培养基，以正丁醇
萃取，依上法处理正丁醇萃取物，得到白色针状结晶
(I)2．1mg。
2．5西洋参冠瘿组织生物合成熊果苷的动力学曲
线：精确控制接种量，向8瓶预培养了20d的西洋
参冠瘿组织培养瓶中分别加入60mg／mL对苯二
酚甲醇溶液0．5mL，培养条件同上。分别于加入底
物后12、24、36、48、60、72、84、108、132h取出1培
养瓶终止转化。抽滤获得培养物和培养基，培养物用
少量蒸馏水冲洗干净，洗液与培养基合并。培养物处
理同2．3。培养基用蒸馏水定容到100mL，然后取
出10mL于一4℃保存备HPLC定量分析。
HPLC条件同2．3。
3 结果
3．1转化产物的检测：TLC检测结果见图1。在实
验组培养物和培养基中均检测到一个新的斑点。Rf
值和熊果苷标准品相同，均为0．55，与熊果苷共薄
层为同一斑点。
HPLC检测结果见图2。在实验组培养物提取
物中出现一个新峰，保留时间为8．416min。
3．2产物的结构鉴定：白色针状结晶I(甲醇)，mp
199～200‘C，Molish反应阳性，说明化合物I为一
糖类或苷类成分。IR(KBr)‰。。(cm_1)：1013，
1074，1220，1459，1513，2895，2911，377；
UVk。(nm，MeOH)：286，223；MSm／z： 95[M+
Na]+。由上可知，化合物I为一苷类成分，苷元为苯
环，相对分子质量272。
1H—NRM(D20)d：3．34—3．85(rll，6H)，
4．83(d，1H，J一7．40Hz)，6．91(d，2H，t，P一
5．92Hz)，7．1(d，2H，J=5．90Hz)。”C—NMR
(D，O)艿：150．2(C一1)，115．8(C一2，C一6)，118．4
(C一3，C一5)，151．2(C一4)，101．5(C一17)，73．2(C一
2’)，76．0(C一3’)，68．6(C一47)，74．7(C一57)，60．4
(C一6’)。由1H—NMR和13C—NMR所提供的数据表
明，结晶I存在对二取代的芳环，芳环的4个氢组成
万方数据
中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月·761·
豢蜷
鞔蘩羹
叠肇
1 2345
l
l
1一对照培养基正丁醇萃取物 2一实验培养基正丁醇萃取物
3一熊果苷对照品 4一实验培养物甲醇提取物
5一对照培养物甲醇提取物
卜n—BuOHextractofcontrolmediumgroup2-n—BuOHextract
ofexperimentalmediumgroup3-arbutinreferencesubstance
4-MeOHextractofexperimentalcultureg oup5-MeOHex—
tractofcontrolcu tureg oup
图l 西洋参冠瘿组织生物合成熊果苷的TLC图谱
Fig．1TLCChromatogramofarbutinb osythesis
bycrowngallofP．quinquefolium
B
O 2 4 6 8
A一买验培养物甲醇提取物B一对照堵养物甲醇提取物C一熙果
苷对照品 D一实验培养基E一对照培养基
A·-MeOHextractofexperimentalcultureg oupB--MeOHex——
tractofcontrolcu tureg oupC—arbutinreferencesubstance
D—·experimentalediumgroupE·—controlmediumgroup
图2西洋参冠瘿组织生物合成熊果苷的HPLC图谱
Fig．2HPLCChromatogramofarbutinb osythesis
fromcrowngallofP．quinquefolium
A。B。系统，成苷的糖为p—D一吡喃葡萄糖苷。
3．3 西洋参冠瘿组织生物合成熊果苷的动力学曲
线：在12～132h内，西洋参冠瘿组织对对苯二酚生
物转化的动力学曲线见图3。在加入底物后第60h，
每瓶培养物和培养基中熊果苷量达到最高，分别为
63．69和1．86mg；熊果苷分泌进入培养基的比例达
。
壤
g
≮
垃
母l∈
蹉
2 243648607284108132
t|h
2·5
： 雾
1．5芝
一
1毒
崮
0·50
0
l一产物在培养物中的量2一产物在培养基中的量
1-contentofproductin ulture2-contentofproductinmedium
图3西洋参冠瘿组织生物合成熊果苷的动力学曲线
Fig．3Dynamiccurveofarbutinb osynthesis
fromcrowngallofP．quinquefolium
到最高，为2．92％。总摩尔转化率达到88．4％。
4讨论
本研究使用悬浮培养转基因西洋参冠瘿组织作
为生物合成／转化系统，国内外均未见文献报道。
冠瘿组织培养系统与愈伤组织／细胞培养比较
具有倍增速度快、培养条件简单(不需加入外源激
素)、遗传性状稳定等优点，非常适合于天然药物活
性成分的生物合成与生物转化研究，以及天然药用
成分的大规模生产。
本研究还发现，熊果苷在西洋参冠瘿组织培养
物和培养基中均有分布。其中熊果苷量的动力学曲
线说明了由于冠瘿组织中水解酶酶活的变化而导致
的产物量的上升或下降，这提示应该选择合适的共
培养周期和收获时间以减少产物的酶解。此外，培养
基中熊果苷同比下降也可能是由于培养后期偏酸的
培养基条件对其有一定的水解作用。
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加∞∞柏如加m
0
万方数据
转基因西洋参冠瘿组织生物合成熊果苷的研究
作者： 张章， 陈敏青， 任胜芳， 赵昱， 于荣敏， ZHANG Zhang， CHEN Min-qing， REN
Sheng-fang， ZHAO Yu， YU Rong-min
作者单位： 张章,陈敏青,任胜芳,于荣敏,ZHANG Zhang,CHEN Min-qing,REN Sheng-fang,YU Rong-
min(暨南大学药学院,广东,广州,510632)， 赵昱,ZHAO Yu(浙江大学药学院,浙江,杭州
,310031)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(5)
被引用次数： 9次

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