全 文 ：·1566· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
与其他种的遗传相似度低、遗传距离大，加强对该种
的保护显得尤为重要。
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鹿源类中药材DNA序列分析及马鹿和梅花鹿的PCR鉴定
白根本1，张林源2，刘春生1，程伟1，陈代贤3
(1．北京中医药大学，北京 100102；2．北京麋鹿生态实验中心，北京100076；3．大连市药品检验所，辽宁大连221100)
摘 要：目的 采用特异引物PCR扩增鉴定马鹿和梅花鹿源中药材。方法从马鹿、梅花鹿等国内11种鹿的鹿血
和鹿茸中提取DNA，用通用引物L1091和H1478调取细胞线粒体12SrRNA基因片段，在该片段核苷酸序列比对
的基础上，设计马鹿和梅花鹿高特异性PCR鉴定引物对，并进行PCR特异性鉴定。结果12SrRNA基因片段能
较好地在种的水平上将不同的种区分开来；特异引物对(EP一1／H1478和EP一2／H1478)PCR可准确地鉴定出马鹿
和梅花鹿等。结论特异引物PCR适宜马鹿、梅花鹿等珍贵中药材的鉴定。
关键词：鹿：DNA序列；PCR鉴定
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)10—1566—04
AnalysisofDNAsequenceofChinesemedicinalmaterialsdeersandPCRidentification
ofCervuselaphusandC．nippon
BAIGan—benl，ZHANGLin—yuan2，LIUChun—shen91，CHENGWeil，CHENDai—xian3
(1．BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Beijing100102，China；2．BeijingMiluEcologicalResearch
Center，Beijing100001，China；3．DalianInstituteforDrugControl，Dalian221100，China)
Abstract：ObjectiveToidentifytheanimaldrugofCervuselaphsandC．nipponfromoriginofdeers．
MethodsToextractDNAfromdeerbloodandhairyantlerof11 speciesofdeerssuchasC．elapbus，C．
nipponandsoon，andtogainthemitochondriat12S RNAgenefragmentusingthegeneralprimersof
L1091andH1478．Basedonthesequencemuhialinementof11speciesd ersaboveg nefragments，design—
ingthecouplesofspecialdifferenceprimersandidentifyingC．elaphsandC．nippon．Results12SrRNA
Genefragmentscandistinguishdifferentdeerswell．Thecoupleofprimers(EP一1／H1478andEP一2／
H1478)PCRcaneffectivelyd ntifyC．elaphusandC．nippon．ConclusionSpecialprimerPCRissuitable
fortheidentificationofvaluableChinesemedicinalmaterials，suchasC．elaphusandC．nippon．
Keywords：deer；DNAsequence；PCRidentification
收稿日期：2005-12-26
基金项目：北京中医药大学21I工程项目资助
作者简介：白根本(1958一)，教授，博士后，长期从事遗传学、生物技术的教学与科研工作，主持完成2项国家自然科学基金等，发表论文
40余篇。Tel：(010)64219516E—mail：baigb@263．net
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·1567·
鹿源类动物药材为名贵中药材，《中国药典》将
梅花鹿和马鹿茸列为正品。但目前药材市场上有约
10多种鹿源药材，加上有鹿茸、鹿血、鹿鞭等通过加
工或非加工药材，以及伪品牛鞭、驴鞭等给梅花鹿和
马鹿的准确鉴定带来了极大的困难。DNA核酸序列
和特异引物PCR扩增在动物药材鹿茸、鹿鞭、乌梢
蛇、龟板、土鳖虫、蜈蚣等[1’2]鉴定方面都取得了良好
效果。但就鹿源类药材鉴定仍然存在一些问题，首先
是有些基因比对属于科以上的水平，虽然利用常规
方法难以鉴定，但在DNA序列上已相去甚远；其
次，比对的范围有限。一是鹿源药材从种内DNA序
列比对鉴定没有实际意义，《中国药典》规定了梅花
鹿和马鹿这2个种，并非某个产地；二是对同一物种
不同药用部位(血、鞭、肉，甚至毛)DNA序列的比对
从遗传学上讲已没有必要，这也是本研究在取材上
不同于过去同类研究。我国是主要的产鹿国之一，包
括鹿科15个属，有16个种，其中白唇鹿、毛冠鹿和
坡鹿是我国特有的种，但从DNA水平上最具鉴定
意义是同属内动物药材的鉴定，由于属间及其以上
DNA序列的差异远远大于同属种间的差异，所以在
DNA水平上关键的是要找出DNA种间水平的差
异。本实验在国内11种鹿12SrRNA基因序列研究
的基础上，设计出了马鹿和梅花鹿的高特异性鉴定
引物，以期建立简便易行的鹿源类中药材的鉴定
方法。
1材料和方法
1．1 材料：鹿血采自北京麇鹿园，鹿茸片由大连市
药品检验所陈代贤研究员提供并鉴定(表1)。
表1样品
Table1 Samples
1．2 DNA提取：异丙醇法提取鹿血DNA；鹿茸
DNA的提取方法：取0．3g的鹿茸片材料(用刀片
刮去表面层，无菌水清洗若干次，凉干后研磨至细粉
末，装入一10mL离心管；加入400pLTEN9(50
mmol／LTris—CI，100mmol／LEDTA·Naz，200
rrl而ol／LNaCl，pH9．0)
提取液混匀；加100弘g／
mLRNase(无DNA
酶)，加终浓度为2％
SDS混匀10rain，37℃
保温1h；加5～10mg
蛋白酶K(proteinase
K)，终浓度40mmol／L
的DTT，使总体积为5
mL；50℃保温3～4h，
期间不时轻摇，使组织 图1鹿血(1～4)和鹿
消解；加等体积的Tris一 茸(5、6)的DNA
C1(pH8．0)的饱和酚，Fig．1DNAotdeerblood
轻轻颠倒数分钟，室温(1--4)andhairy
条件下12000r／min离 antler(5，6)
心10min，取上清液于一洁净的离心管中；加入等
体积的酚一氯仿一异戊醇(50：48：2)轻轻颠倒数分
钟，室温12000r／min离心10rain，取上清液于一洁
净的离心管中；加入等体积的氯仿一异戊醇(24：1)
同上方法抽提一次，取上清液于一洁净的离心管中，
重复抽提3次；加1／10体积的3molNaAc(终浓度
为0．3m01)，加入2倍体积的预冷乙醇4℃过夜沉
淀；12000r／min离心15rain，弃上清，加入70％乙
醇漂洗1～2次；室温挥发干乙醇，加入适量的无菌
去离子水；1％的琼脂糖凝胶电泳，观察DNA质量
(部分样品DNA见图1)，鹿茸片DNA有降解。
1．3 12SrRNA基因的扩增：12SrRNA基因片段
通过引物对[11为：L1091：57一AAAAAGCTTCAAA—
CTGGGATTAGATACCCCACTAT一37；H1478：
57一TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGT一
37。反应体系和反应条件：ddH：O37．2肛L，10×
Buffer5弘L，MgCl23肛L(25mmol／L)idNTP1pL
(每种10mmol／L)，L1091／H1478各0．3弘L(50
mmol／L)，DNA3pL(约100ng)，Taq酶0．3弘L
(O．9U)。PCR扩增条件：94℃预变性6mih，72℃、
4rain；循环体包括94℃、40S，56℃、1min，72℃、1
min，共40个循环；72℃延伸补齐6rain；最后4℃
保存。用1．4％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增，获得约
500bp的DNA片段，见图2(部分样品)。
1．4序列分析：扩增产物用低熔点胶法回收，测序
由上海生物工程公司完成，所得数据用PHYLIP
3．6a3软件进行分析比较。
2结果与分析
．1 图3是11种鹿12SrRNA基因片段比对结
万方数据
·1568· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10,El
1～6一梅花魇、马屁、水鹿、臼唇鹿、姑屁、麇鹿
ck一对照 M—DNA标记
l—C．nippon2一C．elaphus3一C．unicolor4一C．albirostris
5一Damad ma6一Elapharusdavidianus
ck．．controlM．．DNAmarker
图2 12SrRNA基因片段的PCR扩增产物
Fig．2PCRAmplificationof12SrRNAgenefragments
果，由于种内重复的测序结果完全相同，故在图3中
不再列出。在12种鹿基因片段序列中，共有45个碱
基的变异，其中共有53个碱基转换，10个碱基颠
换，转换与颠换比为5．3：1；爪哇鹿在182处有一
个碱基的插入。从碱基发生变异的位置看，在2～
12、242～248、270～287的3个区域发生突变的频
率比较高。从种的角度看，站鹿、麋鹿、驯鹿和狍发生
变异的频率最高，主要表现在属问，在45个碱基变
异中，鹿属内的碱基变异有18个，其中有15次转换
和2次颠换，二者相差7．5倍，即碱基的颠换主要发
生在属间。
2．2 分子系统树采用ClustalX1．8分别用简约
(Parsimony)法和邻接(NeighbourJon ning)法构
建，经分析比较NJ法所构建的系统树更接近鹿科
动物的系统进化(图4)，在亚科水平上除了空齿鹿
亚科的驼鹿与鹿亚科聚在一类外，其余10种鹿分别
聚为两类，即鹿亚科和空齿鹿亚科。在鹿亚科中又以
马鹿和梅花鹿首先聚在一起；并依次聚类的是白唇
鹿等，最后与粘鹿聚在一起。这一进化树基本反映了
鹿科动物系统进化关系。
2．3梅花鹿与马鹿的PCR特异鉴定：根据图3，11
种鹿科动物12SrRNA基因片段序列差异分析，分
别设计梅花鹿和马鹿特异PCR鉴定引物对(表2)。
并以序列最接近的鹿属其他种及空白模板为对照进
行PCR扩增鉴定。PCR反应体系同上，梅花鹿鉴定
的复性温度为6l℃，马鹿为65℃。扩增产物用
1．4％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，成像，结果见图
5。图5-a中只有马鹿有扩增条带，图5-b只有梅花
鹿有扩增条带，长度均约400bp，与设计长度(根据
测序结果计算长度)相符。
引物设计遵从以下原则：首先是特异性原则，即
C“埔 ^“nO丌m1^^ACM0^CTGTrcGcCAGAGT^mCCGIGCAATI
CH4 ^．A
C曲h哪H C^ ^ ^
ctⅥt TCG c ^ ^．．C㈣ G ^^．
C-”cch O ^ ^A如 C C ^T^
C“口●“ AC TGT．^^
D女一 0 ^^Edamdi— O ^． ^．．．．
Rnm，-aI‘IA ^ ^．，^
GCFITATACCcTTcT^0AOGAOCCT(]TTCTATAATCGATAAACCCCGATAAACC／
C
C
C
nTrCTAATCTAAGAAA^Tcc^^c
cT
图3 11种鹿12SrRNA基因片段多重序列比较
Fig．3Alignmentsof12SrRNAgenefragment
sequencesof1l peciesofdeer
-JL—L—[
-——-·--。—-·。—---J
马鹿
梅花鹿
白唇鹿
坡鹿
驼鹿
爪哇鹿
水鹿
廪鹿
自自鹿
狍
驯鹿
30 25 20 lb lU 5 0
图4 11种鹿聚类图
Fig．4Clusterd ndrogramof11 sepciesofdeer
种间差别越大越好。其次遵从引物设计的基本原则，
即引物长度以15～30bp为宜；引物内部不应该形
成二级结构，两个引物之间尤其在3’末端不应有互
补链存在；引物碱基的顺序不应与非扩增区域有同
源性；引物3‘末端碱基原则上要求与模板DNA一
一配对。而3’末端碱基在很大程度上影响死g聚合
酶的延伸效率，据报道37碱基引发错配的效率大小
依次为A>G、C>T。客观上引物的设计往往并不
能满足以上要求，如引物长度和G、C受配对引物的
Tm值及客观序列的制约，从实践方面笔者认为序
列长度可以在38bp内，为了保证PCR的特异性，
尤其是特异引物只差1～2个碱基时，双引物的Tm
东l||i薏黑羔
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·1569·
表2 PCR引物对
Table2 PairofPCRprimer
名称／引物 序 列 配对引物
梅花鹿／EP一15GTTATGTAAACAAAACTATTCGCCAGAGTACTACCGGC3’H1478
-S鹿／EP．25『GTTATGTAAACAAGACTGTTCGCCM；AGTACTACCGGC3’H1478
1一水鹿2一梅花屣3一马厩4一自唇鹿5一爪哇屁
6一坡鹿ck一空白模板M—DNA标记
1-C．unmoor2．C．nippon3=C．elaphs4-C．albirostris
5-C．timorensis6-C．e／dfck—controlM—DNAmarker
图5特异PCR扩增
Fig．5SpecificityofprimersPCRamplification
值相差越小越好，否则其他影响特异性的条件都可
能掩盖PCR的特异性。
3讨论
由于动物鹿源药材因器官、加工等原因，给常规
鉴定带来了很大困难，单从12SrRNA基因序列的
来源研究不同鹿种具有很好的稳定性。在本研究中
有6个鹿种进行了2样本的重复测序，其结果表现
出高度的一致性，证明了在种的水平上该区段进化
是保守的，属间序列差异明显大于种间差异。
动物药材的基因鉴定很好地克服了不同器官以
及样品保存时间等给鉴定带来的复杂性，但仅从序
列鉴定仍然较难推广，高度特异性引物极大地简化
了鉴定程序。在本研究中，所用的试验材料有鹿血和
存放时间数年的鹿茸，在基因片段的调用上取得了
同样的效果。特异引物的设计在技术上除了遵循引
物设计的基本原则外，序列之间的差异大小直接影
响特异性扩增的效果，马鹿和梅花鹿在所分析的片
段上仅有2个碱基的差异，但所设计的引物对(-B
鹿：PE一1，H1478；梅花鹿：PN一1，H1478)都特异地扩
增出长度约400bp的12SrRNA基因片段，这与根
据测序结果设计的序列长度一致。
在本研究中，马鹿和梅花鹿特异性扩增引物对中
都用了共同引物H1478。事实上，如果将下游引物设
计的其他碱基变异较大的区域将会取得更好的鉴别
效果。此外，引物质量直接影响特异性扩增的效果，引
物设计时遵循引物设计的一般技术指标外，要尽可能
地选择差异较大的区域，如果遇到差异数仅1～2个，
且间隔距离又较远时，要尽可能地差异碱基放在引物
的37端，同时引物的Tm值越匹配越好。
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近红外光谱鉴别冬虫夏草道地药材
王钢力1，石 岩1，魏玉海2，王慧春2，徐晓杰3，林瑞超1
(1．中国药品生物制品检定所，北京100050；2．青海省药品检验所，青海西宁810000；
3．热电(上海)科技仪器有限公司，北京100032)
摘 要：目的研究冬虫夏草药材的道地性。方法收集不同产地的冬虫夏草药材样品102批，采用漫反射法，测
定药材粉末及药渣的近红外光谱，采用透射法测定药材甲醇提取物的近红外光谱。采用TQ定量分析软件，对样品
的青海和西藏产地进行判别分析。结果药材粉末的判断准确率达到i00％，药材的甲醇提取物光谱较药渣更能显
示药材的产地差别。结论在扩大建模样本的前提下，近红外光谱分析可以用于冬虫夏草药材的产地鉴别。
关键词：近红外光谱；冬虫夏草；地道药材；鉴别
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)10—1569一03
ApplicationofNIRanalysisin dentificationofgenuineCordyceps
WANGGang—lil，SHIYanl，WEIYu—hai2，WANGHui—chun2，XUXiao—jie3，LINRui—cha01
(1．NationalInstituteforControlofBiologicalandPharmaceuticalProducts，Beijing100050，China；2．Qinghai
收稿日期：2006—01—05
基金项目：青海省重大科技项目(2004一N一103一01)
万方数据
鹿源类中药材DNA序列分析及马鹿和梅花鹿的PCR鉴定
作者： 白根本， 张林源， 刘春生， 程伟， 陈代贤， BAI Gen-ben， ZHANG Lin-yuan， LIU
Chun-sheng， CHENG Wei， CHEN Dai-xian
作者单位： 白根本,刘春生,程伟,BAI Gen-ben,LIU Chun-sheng,CHENG Wei(北京中医药大学,北京
,100102)， 张林源,ZHANG Lin-yuan(北京糜鹿生态实验中心,北京,100076)， 陈代贤,CHEN
Dai-xian(大连市药品检验所,辽宁,大连,221100)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(10)
被引用次数： 5次

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