全 文 ：Vol. 29 , No. 4
pp. 621～625 　July , 2003
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 29 卷 第 4 期
2003 年 7 月 　621～625 页
玉米转 Bt 基因自交系的抗玉米螟特性鉴定初报
刘宗华1 　汤继华1 　李宝健2 　范云六3 　李桂玲1 　季良越1 　陈伟程1
(1 河南农业大学玉米研究所 ,河南郑州 450002 ;2 中山大学生命科学学院 ,广东广州 510000 ;3 中国农科院生物技术中心 ,北京 100081)
摘 　要 　通过田间接卵和室内 PCR 分子检测 ,对采用回交法育成的 Mo17Bt 、478Bt 、综 3Bt和 8721Bt等 4 个转 Bt 基因自交系
的抗虫性以及 Bt 基因的存在 ,进行鉴定。结果表明 ,4 个转基因自交系群体的抗虫性明显提高 ,虫孔隧道长度比阴性对
照平均缩短 49. 70 % ,差异达显著水平 ,但抗虫性不如阳性对照 ;群体内 ,单株间抗虫性仍存在差异 ,有高抗到高感不同类
型 ,其中抗虫株的虫孔隧道长度比阴性对照平均缩短 78. 40 % ,达极显著水平。4 种转基因自交系均含有 Bt 基因 , 扩增
出小于 100 bp 的 DNA 片段。已选出既含有 Bt 基因、田间抗虫性表达又较明显的自交系 ,为进一步进行抗虫转基因杂交
种的选育 ,奠定了基础。Ξ
关键词 　玉米 ;转基因 ;PCR 鉴定 ;育种
中图分类号 : S513 　　　文献标识码 : A
Primary Study on Identif ication of Corn2borer Resistance in Corn Inbred2lines
Transferred with Bt Gene
LIU Zong2Hua1 　TANGJi2Hua1 　LI Bao2Jian2 　FAN Yun2Liu3 　LI Gui2Ling1 　J I Liang2Yue1 　CHEN Wei2Cheng1
(1 Corn Research Institute of Henan Agricultural University , Zhengzhou , Henan 450002 ; 2 Bio2science College of Zhongshan University , Guangzhou , Guangdong
510000 ; 3 Institute of Biotechnology , Chinese Academy of Agricultural Science , Beijing 100081 , China)
Abstract 　　Using both inoculation of corn borer eggs in the field and PCR molecular test in laboratory , the corn2borer re2
sistance and the existence of Bt gene were identified in four corn inbred2lines transferred with Bt gene. The results showed
that the resistance to corn borer of the four transgenic inbred2lines was increased obviously and the mean of worm tunnel
length was significantly decreased by 49. 71 % compared with the negative controls , but the resistance level was not high as
the positive control . Within each population of the four inbred2lines , the resistance varied from high level of resistance to
high level of sensitivity. Comparing with the negative controls , the tunnel length of the resistant plants was significantly de2
creased by 78. 40 %. DNA fragments specific for the Bt gene were detected from the four inbred2lines by PCR. The inbred2
lines with Bt gene and high resistant to corn borer were selected. These inbred2lines would facilitate breeding corn hybrid
with Bt gene.
Key words 　　Corn ; Transferred gene ; PCR identification ; Breeding
　　我国在转基因玉米的研究和利用与国外相比尚
有较大差距。尽管近年来利用子房注射或基因枪等
方法已将 Bt 杀虫毒蛋白基因导入一些易转化的玉
米自交系、愈伤组织或幼胚 ,获得转基因植株[1～6 ] ,
但目前 ,还没有将外源 Bt 基因转育到常用自交系
中 ,形成生产上可利用的抗虫玉米杂交种 ,尤其缺乏
转基因材料抗玉米螟特性的研究报道。本研究通过
回交转育的方法 ,将已导入甜玉米材料中的外源 Bt
基因转育到几个常用自交系中 ,通过自交纯合 ,选出
稳定的转 Bt 抗虫基因自交系 ,并对其抗玉米螟特性
进行初步鉴定 ,以期为转基因玉米杂交种的利用提
供理论依据。Ξ基金项目 :河南省自然科学基金资助项目 (2000210003) 。
作者简介 :刘宗华 (1960 - ) ,男 ,河南三门峡人 ,教授 ,硕士 ,从事玉米遗传育种研究。
Received(收稿日期) :2002202205 ,Accepted(接受日期) :2002207213.

1 　材料与方法
111 　材料
　　自 1996 年开始 ,以 Mo17、478、综 3 和 8721 等 4
个常用自交系为轮回亲本与中山大学李宝健等提供
并经分子鉴定呈阳性的抗虫转 Bt 甜玉米材料 91212
8 杂交 ,从杂交后代中选抗虫株作亲本与轮回亲本
连续 4 代回交 (每个回交世代均进行田间抗虫性接
卵鉴定并筛选抗虫株继续回交) ,又经 2 代自交 ,得
到Mo17Bt、478Bt 、综 3Bt和 8721Bt等 4 个转 Bt 基因自
交系。用于田间接卵鉴定的玉米螟虫卵从中国农业
科学院植物保护研究所购进。
112 　方法
11211 　田间接卵鉴定
2001～2002 年 ,在河南郑州科教园区播种上述
4 个转基因自交系及其相应未转基因的自交系 (阴
性对照 CK1) 和 912128Bt (阳性对照 CK2) 。当玉米长
至喇叭口期 (13214 片叶时) ,将黑头卵接入玉米心叶
内 ,每株接 2 块卵 ,每个转基因材料接 50 株左右 ,相
应对照接 10 株。2 周后进行叶片虫孔级别的调查。
收获后 ,去掉叶片和叶鞘 ,取地上茎逐株剖开量取虫
孔隧道长度 ,并依国际玉米螟协作组制定的分级标
准[7 ] ,按高抗 (HR) 、抗 (R) 、中抗 (MR) 、感 (S) 和高感
(HS) 5 级分类 ,判定各单株的抗性。
11212 　室内分子鉴定
1121211 　DNA 的提取 　　在玉米苗期 ,每株取 5 g
心叶 , - 80 ℃保存 ,CTAB 法提取 DNA。
1121212 　PCR 反应 　　PCR 引物参照陶震设计的
嵌合引物序列[8 ] ,CaMV35S启动子的引物序列为 5′2
caggtggcagtcaTCATTGAGATAAAGGAAAGG23′ 和 5′2
caggtggctgtgaCGAAGGATAGTGGGATTGTG23′; NOS 终
止 子 的 引 物 序 列 为 5′2caggtcgctgtcaT
TGAATCCTGTTGCCG2 GTCTT23′和 5′2caggtcgctgtcaAT
AATTGCGGGACTCTA2ATC23′,由上海生工生物工程
技术服务有限公司合成。在 25μL 的反应体系中 ,
含有 10 ×buffer 缓冲液 215μL ,25 mmol/ L MgCl2 2
μL ,25 mmol/ L 等浓度的 dNTP 015μL ,5 U/μL Taq 酶
012μL ,20 ng/μL 的模板 DNA 215μL ,终浓度为 012
μmol/ L 的 1 或 2 对 PCR 引物 ,25 mmol/ L DMSO 1125
μL ,加双蒸水至 25μL。PCR 反应程序为 :99°C 预变
性 5 min ;然后 95°C 变性 5 s ,65°C 复性 15s ,72°C 延
伸 1 s ,40 个循环 ;72°C 延伸 5 min ;4°C 保存。PCR
反应在 PE9600 型 PCR 仪上进行。
1121213 　PCR 产物检测 　　取 10μL PCR 反应产
物 ,在 2 %琼脂糖凝胶上 100 V 电泳 40 min ,以宝生
物工程有限公司生产的 DNA Marker DL22000 为分子
标记检测。在紫外透射仪上观察并拍照。
2 　结果与分析
211 　田间接卵鉴定结果分析
　　将经过 4 代回交和 2 代自交的转基因材料及其
对照的茎秆虫孔隧道长度以及其间的差异显著性测
验结果列于表 1。从表 1 看出 ,Mo17Bt、478Bt、综 3Bt和
8721Bt 4 种转 Bt 基因回交自交系各自群体的平均虫
孔隧道长度与其相应阴性对照 (CK1) 相比 ,分别缩
短 50150 %、44110 %、48113 %和 56145 % ,平均缩短
49170 % , t 测验结果 ,差异分别达显著或极显著水
平 ,但与阳性对照 (CK2) 相比 ,隧道长度趋于增加 ,
除综 3Bt增加幅度未达显著差异外 ,其他 3 个转基因
自交系的隧道长度均有显著或极显著增加。
表 1 Bt 基因回交自交系及其对照田间抗虫性反应和差异显著性鉴定结果
Table 1 Difference of corn borer resistance in the four inbred2lines and controls in field
Bt 回交自交系
BC inbred lines with Bt gene
CK1
　
CK2
　
材料
Material A1 A2
材料
Material
B
　
材料
Material C　
A1 比 CK1 ±%
A1compared
with CK1 ±%
A1 比 CK2 ±%
A1compared
with CK2 ±%
A2 比 CK1 ±%
A2compared
with CK1 ±%
A2 比 CK2 ±%
A2compared
with CK2 ±%
Mo17Bt 5140 2138 Mo17 10191 912128Bt 115 - 50150 3 260100 3 - 78119 3 3 58167
478Bt 7177 2111 478 13190 - 44110 3 418100 3 3 - 84182 3 3 40167
综 3Bt
Zong 3Bt
4171 2177 综 3Zong 3 9108 - 48113 3 214100 - 69149 3 3 84167
8721Bt 5133 2171 8721 12124 - 56145 3 3 255133 3 - 77186 3 3 80167 3
平均
Mean 5180 2149 11153 115 - 49170 3 286167 3 - 78140 3 3 66100
　　注 :A1、A2、B 和 C分别为 Bt 回交自交系群体、抗虫株、CK1 群体和 CK2 群体的平均虫孔隧道长度 (cm/ 株) ; 3 3 3 差异分别达 0105 和 0101
显著水平。
Note : A1 ,A2 ,B and C stand for the mean length of the worm tunnels (cm/ plant) of the four inbred2line populations , resistant plants with Bt gene , CK1 and
CK2 populations , respectively1 3 3 3 Significant differences at P0105 and P0101 ,respectively1
226 　　　作 　　物 　　学 　　报 29 卷 　

　　进一步分析表明 ,每个转基因自交系中 ,各单株
的抗虫性表现也不尽一致 ,均有高抗到高感不同类
型的出现。4 种转基因自交系各自抗虫株 (含 HR、
R、MR3 种类型) 的平均隧道长度依次为 2138 cm、
2111 cm、2177 cm 和 2171 cm , 比 CK1 分别缩短
78119 %、84182 %、69149 % 和 77186 % , 平均缩短
78140 % , t 测验结果差异达极显著水平 ;而与 CK2
相比 ,隧道长度分别增加 58167 %、40167 %、84167 %
和 80167 % ,平均增加 66100 % , t 测验结果除 8721Bt
增加幅度达显著差异外 ,其余差异均不显著。
由此表明 ,转 Bt 基因自交系整个群体的抗虫性
尽管与阳性对照相比有所下降 ,但明显优于未转基
因的阴性对照。因此 ,采用回交法转育 Bt 抗虫基因
是有效的 ,这就为进一步研究和利用奠定了基础。
212 　转基因材料 Bt 基因的 PCR分子鉴定
利用两对引物对转基因后代材料进行 PCR 扩
增 ,图 1 和图 2 分别为转基因材料 8721Bt和综 3Bt及
其对照利用 NOS 终止子引物的 PCR 扩增结果。从
图 1 可以看出 ,阴性对照 8721 没有扩增产物 ,而随
机选取的 30 株 8721Bt均有扩增产物 ;图 2 中的阳性
对照 982128Bt和 28 株综 3Bt转基因材料均有 100 bp 左右的扩增产物 ,而扩增产物的分子量大小与试验设计的扩增片段相吻合 ,说明有扩增产物的单株中含有目标基因。此外 ,Mo17Bt和 478Bt也扩增出同样的 DNA 条带。由此表明 ,通过回交转育法 ,已成功地将 Bt 基因导入到转育的自交系中。进一步将 PCR 检测的结果与田间接卵鉴定后对应植株的抗虫性反应进行对比 (表 2) 。在 4 个转基因材料共 15 个株系的 PCR 检测结果中 ,除综 3Bt有 1 个株系表现分离外 ,其他 14 个株系中随机选取的 84 个单株 PCR 检测结果均呈阳性 ,表明其为 Bt基因纯合的株系。这 84 个阳性单株经田间接卵鉴定 ,有 60 株表现抗虫 ,24 株感虫 ,平均抗虫株率为71143 % ,其中 Mo17Bt 、478Bt、综 3Bt和 8721Bt4 个材料的抗虫株率分别为 71143 %、55156 %、78157 %和76132 %。由此表明 ,含有 Bt 基因的单株 ,田间未必都表现抗虫 ,由此看来在本研究中 , Bt 基因在经过回交和自交的后代中仅在 2/ 3 以上单株中得到表达 ,而近 1/ 3 单株中未表达。这一方面与环境条件有关 ,另一方面也可能与外源 Bt 基因在不同的遗传背景、不同发育时期的表达程度有关。
　
图 1 转基因材料 8721Bt及其阴性对照的 PCR 扩增产物
Fig11 Amplified result by PCR of transferred material 8721Bt and its negative control
注 :1 和 33 为同一标记 ;2 为阴性对照自交系 8721 ;3232 为转基因自交系 8721Bt
Note : 1 and 33 Marker ;2 1negative ck inbred line 8721 ; 32321transgenic inbred line 8721Bt
图 2 转基因材料综 3Bt及其对照的 PCR 扩增产物
Fig12 Amplified result by PCR of transferred material Zong 3Bt and its control
注 :1228 为转基因自交系综 3Bt ;29230 阴性对照自交系综 3 ;31232 为阳性对照 912128Bt ;33 为 Marker
Note : 12281transgenic inbred line Zong 3Bt ;292301 negative ck inbred line Zong 3 ;
312321positive ck 912128Bt ;331 Marker
326　4 期 刘宗华等 :玉米转 Bt 基因自交系的抗玉米螟特性鉴定初报 　　　

表 2 PCR检测结果与田间接卵鉴定结果的比较
Table 2 PCR detection and borer resistance in field
转基因材料
Transferred
materials
株系数
No1 of lines PCR 检测结果Result of PCR株数
No1 plants + - 接卵鉴定结果Result of inoculating corn borer eggs抗虫株Resistant plant 感虫株Sensitive plant 表达株率Plant ratio expressing resistance ( %)
Mo17Bt 3 14 14 0 10 4 71143
478Bt 4 18 18 0 10 8 55156
综 3Bt 2 14 14 0 11 3 78157
Zong 3Bt 1 9 2 7 5 4 55156
8721Bt 4 38 38 0 29 9 76132
合计平均 3
Total and mean 3 14 84 84 0 60 24 71143
　　3 不含 PCR 检测表现分离的株系。3 One inbred2line (Zong 3Bt) was not included , in which Bt gene was segregating1
3 　讨论
本研究所用的转基因材料均是由通过 4 代回交
和连续 2 代自交所产生的转基因株系 ,且在每一回
交世代和自交后代均进行了苗期室内喂虫和喇叭口
期田间接卵鉴定[9 ,10 ] 。回交 4 代 (BC4) 抗虫株的 Bt
基因应是杂合体 ,经 2 次自交定会产生 Bt 基因纯合
的株系和杂合的株系 ,经 PCR 扩增 , Bt 基因纯合的
株系内每个单株均应有扩增产物 ,而杂合的株系则
出现株间分离 ,据此可选出 Bt 基因纯合的自交系。
由表 2 可见本研究经 PCR 分子鉴定的结果 ,在 4 种
转基因材料中均选出了 Bt 基因纯合的株系。
但表 2 中的田间接种鉴定结果表明 :在本研究
中 , Bt 基因在经过回交和自交的后代中 ,仅在 2/ 3
以上的单株中得到表达 ,而近 1/ 3 单株中未能表达 ,
即带有 Bt 抗虫基因的单株田间未必就能表现抗虫
性。转基因植株的遗传研究结果表明 ,外源基因的
分离符合典型的孟德尔遗传规律 ,而其表型性状的
分离却不一定符合典型的孟德尔规律 ,造成这种现
象的原因是多方面的 ,由于外源基因在表达过程中 ,
除基因与环境的相互作用外 ,外源基因与受体基因
组的同源性、基因的插入位点等多种因素均会影响
基因的表达效率 ,这可能是本研究中有 1/ 3 植株未
表达抗虫性的主要原因。因此在 Bt 抗虫转基因植
株的鉴定过程中需要田间抗性鉴定和室内分子鉴定
相结合 ,才能选出高效表达的单株。
此外 ,本试验在 2001 年春田间接卵后不久遭遇
大雨 ,可能会造成部分虫卵死亡或流失 ,再加上 ,当
年玉米螟自然虫口密度很低 ,危害极轻 ,使得一些感
虫对照株虫害度降低 ,结果造成转 Bt 基因材料的田
间抗虫性表现与未转基因的阴性对照相比 ,差异不
显著。因此 ,在 2002 年春 ,又重复进行了田间接卵
鉴定 ,并对此进行了统计分析。同时这也表明 ,因环
境所致的田间接卵鉴定结果的偏差 ,是造成转基因
材料中一些经 PCR 分子鉴定证明不带 Bt 基因的单
株在田间接卵鉴定时表现为“假抗”的原因之一。
致谢 :余迪求、贺平鸽同志参加了部分实验工作 ,特
此感谢 !
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