全 文 ：中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·1545·
复方鳖甲软肝方对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子一p1的影响
付 敏，张东伟，王继峰+，牛建昭，杨美娟，李 健
(北京中医药大学细胞生物化学实验室，北京100029)
)
／
研究表明转化生长因子一131(TGF一61)+在肺纤
维化的发生和发展过程中起重要的作用[1~3]。肺纤
维化在发病过程中，炎症和损伤可以诱导TGF一131
的活化和高表达“]。活化的TGF一61通过其受体和
Smad途径增加细胞外基质的形成，从而进一步诱
发肺纤维化。本实验室研究表明复方鳖甲软肝方具
有抗博莱霉素诱发的肺纤维化作用[s’6]。为了深入探
讨其作用机制，本实验利用Westernblottiog和免
疫组化方法，观察复方鳖甲软肝方对肺纤维化大鼠
肺组织中TGF一61表达的影响，以进一步揭示其抗
肺纤维化作用机制。
l 材料 一
1．1 实验药物：复方鳖甲软肝方(即复方鳖甲软肝
片原料粉)由内蒙古福瑞制药有限公司提供，批号
20020501。注射用盐酸博莱霉素，日本化药株式会社
制造，批号X12100。
1．2实验动物：SD雄性大鼠，体重(206±16)g。
实验动物和饲料购自北京维通利华实验动物技术有
限公司。实验动物饲养在洁净级动物房，适应性喂养
1周，饲料为该公司提供的固体全价饲料，饮用水为
自来水，实验期间自由饮水和进食。
1．3主要试剂：兔抗一TGF一61，SantaCruz公司产
品。DABkit、Alkalinephosphatasego tanti—rabbit
IgG、NBT／BCIP显色浓缩液，购自北京中山生物技
术有限公司。
1．4 主要仪器：垂直板电泳仪、低温高速离心机、电
印迹装置、匀浆器、微波炉、保湿盒，PCR扩增仪
(美国EricompINC)、水平电泳仪、Nikon4500数
码相机。
2方法
2．1大鼠肺纤维化模型复制[5]：大鼠1．5％戊巴比
妥钠ip麻醉(O．25mL／100g)后，固定在解剖台
上，颈部剪毛，用碘酒与酒精消毒，切开颈正中部皮
肤，逐层剥离，暴露气管，然后向气管内注入0．3mL
博莱霉素生理盐水溶液(1mg／200g)，继续注入
0．3mL空气，注后立即将动物直立并左右旋转，使
药液在肺内均匀分布。其中假手术组大鼠肺部注入
等体积的生理盐水，正常组大鼠不做任何处理。
2．2实验动物的分组和给药方法[6]：SD大鼠分为
假手术组、模型组、复方鳖甲软肝方组，每组10只。
造模后第2天，各组大鼠分别ig给药。复方鳖甲软
肝方原料粉，在使用时分别用蒸馏水溶解。其中假手
术组、模型组大鼠分别ig生理盐水，给药剂量为
0．014L／kg。复方鳖甲软肝方组ig复方鳖甲软肝方
原料粉混悬液(O．7g／kg)，各组大鼠每天ig体积相
等。每周连续给药6d，连续给药4周。到第28天
时，ip1．5％戊巴比妥钠溶液(2．5mL／kg)麻醉
后，将大鼠固定，取肺脏用冷PBS清洗后，置
于一70℃冻存备用。
2．3肺组织处理方法：取大鼠的右肺下叶及附叶适
量，置于一70℃中冻存。下叶及附叶剩余肺组织，
部分用PBS一甲醛固定，用于免疫组化染色；部分冻
存于一20℃冰箱，用于Westernblotting测定。
2．4 Westernblotting法测肺组织中TGF一131水
平：取100mg肺组织，冻于液氮中。隔铝泊纸捣碎。
用1ml。缓冲液A[o．6％NP一40，150mmol／L
NaCl，10mmol／LHEPES(pH7．9)，1mmol／L
PMSF]溶解粉末，乳钵匀浆。将匀浆液转入1．5mL
管中，0℃、2000×g离心30S，弃未破碎组织。上清
液于冰浴中静置15min，0℃、5000×g离心15
min。小心移取上清液，分装，一20℃保存，即为胞
浆蛋白。采用15％分离胶，5％浓缩胶进行SDS—
PAGE电泳。半干法转移，5％牛奶4℃封闭过夜。
加兔抗TGF—t?1做1：1000稀释(一抗)，4℃过
夜。PBS洗5min；3次，将膜与5％牛奶，羊抗兔
lgG／HRP(二抗，1：2000)一起孵育，室温2h。
PBS洗5rain，3～5次。NBT／BCIP显色，特异性条
带显蓝紫色或蓝黑色。用PBS终止反应。照相，图像
收稿日期：2006—03—11
基金项目；教育部长江学者和创新团队发展计划资助项目(IRT0413)；国家自然科学基金资助项目(30510403202，30371775)
作者简介：付敏(1979一)，湖北武汉人，北京中医药大学2001级博士研究生，研究方向为中药作用的生化机制。
E—mail：fmess@163．corn
*通讯作者王继峰E—mail：wangiifeng@126．com
万方数据
·1546· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
分析。实验重复6次。
2．5免疫组化法测肺组织中TGF—p1的表达：将肺
组织固定于中性甲醛液中，常规石蜡包埋，连续做厚
5m的切片。免疫组化染色采用SP法，用PBS代
替一抗作阴性对照。第一抗体浓度为l：200。第二
抗体为HRP标记，DAB显色。显微镜观察，照相。
图像分析。每组随机取5张切片，每张切片随机取5
个视野，统一放大倍数为200倍，测定阳性细胞的
面密度(阳性目标总面积／统计场总面积)。
2．6实验结果处理：图像分析使用北航CMIAS医
学图像分析管理系统，由军事医学科学院放射免疫
所病理图像分析室分析，测定肺组织TGF—B1转移
印迹图的吸光度值、免疫组化的面密度和PCR产
物的吸光度值。实验结果用x±s表示，利用SPSS
11．0统计软件进行单因素方差分析。
3结果
3．1 Westernblotting实验结果：见图1和表1。模
型组大鼠肺组织蛋白中TGF—B1的水平明显高于假
手术组大鼠(P<0．01)，说明肺纤维化大鼠肺组织
中TGF—p1高度表达。而复方鳖甲软肝方组大鼠肺
组织蛋白中TGF—p1的水平降低。
3．2 TGF—p1蛋白表达的免疫组化实验结果见图2
及表2。大鼠肺组织中TGF—isl的阳性部位主要在
1、5假手术组2、6-模型组3、4、7、8一复方整甲软肝方组
1，5-Shamgroup2，6modelgroup3，4，7，8Compound
BeijiaRuanganPrescriptiongroup
圈1肺纤维化大鼠肺组织TGF—Bl的
Westernblotting图像
Fig．1ImagesofWesternblottingofTGF一8linlung
tissueofpulmonaryfibrosisrats
表l Westernblotting图像分析结果(x土s，n一6)
Table1 ResultsofimageanalysisofWesternblotting
(x士s，n=6)
与假手术组比较：一P
图2 TGF—el免疫组化结果
Fig．2ResultsofimmunohistochemistryofTGF—Bl
表2免疫组化图像分析Q士s，n=6)
Table2 Imageanalysisof mmunohisto-
chemistry(i士s，H=6)
组别 剂量／(rag·kg．1) 面密度
模型 一0．0350土0．0153～
复方鳖甲软肝方 700 0．0139士0．0033At,
与假手术组比较：一P
肺泡巨噬细胞、支气管周围结缔组织细胞、血管内皮
细胞和肺内间质细胞。模型组大鼠TGFBl大量表
达，主要分布于上皮细胞、肺泡巨噬细胞和肺内间质
细胞。复方鳖甲软肝方组的TGF—B1的表达量下降
(与模型组相比，P
4讨论
目前研究发现，细胞因子网络在肺纤维化的发
生和发展中起重要的作用。在众多的细胞因子中，
TGF—B1是导致肺纤维化关键性的细胞因子，它不
仅可直接促进细胞外基质(ECM)沉积，而且还与
其他细胞因子如CTGF、血小板衍生生长因子
(PDGF)、NF—KB／IKB、血管内皮生长因子(VEGF)、
TNF一Ⅱ以及Fas／Fas—L等相互作用，组成一个复杂
的信号网络，共同调节肺部的微环境。因此，对
TGF—B1在肺纤维化变化情况的研究，将有助于进
一步认识肺纤维化的发病机制，从而为临床的诊断
和治疗肺纤维化提供科学的依据。
本实验利用Westernblotting方法证明，肺纤
维化大鼠肺组织蛋白中TGF—p1水平明显高于假手
术组，这与文献报道结果相一致[7’8]。TGF—Bl的活
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·1547·
化可诱导细胞的迁移、增殖及细胞外基质的过度合
成[8]，诱发肺纤维化，这一点在肺纤维化的病人和实
验动物中已经得到证实[9]。阻断TGF一61的活化或
TGF—t31基因敲除的动物则不容易发生肺纤维
化[10‘11]。本实验中观察到，大鼠ig复方鳖甲软肝方
后肺组织蛋白中TGF一61的水平有一定程度的降
低，说明复方鳖甲软肝方能够从蛋白翻译水平调节
肺组织TGF—B1的活性。
鉴于TGF一61的高表达在肺纤维化发生中的重
要作用，应用免疫组化方法对TGF一61蛋白的来源
进行研究。结果发现，TGF一61主要位于肺间质的纤
维增生区域附近，部分小支气管及血管周围也有表
达。文献报道TGF一61主要来源于肺泡上皮细胞、成
纤维细胞和巨噬细胞等[12|。TGF—t31在肺间质表达
较假手术组也明显增强，这种高表达一直持续到第
80天，提示肺内间质局部TGF一61在纤维化持续发
展中发挥重要作用。而组织病理学研究表明，80d
时肺内成纤维细胞大量增生，肺泡结构破坏，纤维灶
形成。免疫组化结果显示，肺成纤维灶呈强阳性反
应，提示在肺纤维化进展期，肺内间质细胞是TGF一
阻的主要来源之一。TGF=pI蛋白在肺纤维化病灶
中增加原因：(1)肺泡炎时肺泡巨噬细胞、嗜酸性细
胞等高表达；(2)肺损伤时支气管和肺泡上皮细胞高
表达；(3)肺纤维化时成纤维细胞、肌成纤维细胞等
间质细胞高表达n31。高表达的TGF—B1能促进细胞
外基质持续过量沉积，是肺纤维化发生和发展的主
要原因。
肺纤维化大鼠TGF一61在转录和翻译水平均表
达增高，高水平的TGF一131主要来源于上皮细胞和
肺间质细胞。复方鳖甲软肝方能从蛋白水平上调节
TGF一61的分泌，从而发挥治疗肺纤维化的作用，这
是复方鳖甲软肝方抗肺纤维化的机制之一。而复
方鳖甲软肝方是否具有影响其他相关细胞因子的作
用，有待进一步研究。
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黄芪多糖对麻醉犬急性心源性休克血流动力学和氧代谢的影响
吕文伟1，刘淑杰2，王秋静1，李天舒1，石卓P
(1．吉林大学基础医学院药理学教研室，吉林长春130021；2．白求恩医科大学制药厂，吉林长春】30012)
心源性休克是急性心肌梗死的严重并发症之
一，是引起急性心肌梗死死亡的主要原因Ⅲ。因此研
究开发具有正性肌力及保护心肌的药物尤其重要。
黄芪始载于《神农本革经》，味甘、性温，有补气升阳，
收稿日期：2006—03一10
作者简介：吕文伟(1961一)，男，吉林省长春市人，主管技师．主要从事心血管药理学研究。
*通讯作者石卓Tel：(0431)5619799
万方数据
复方鳖甲软肝方对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子-β1的
影响
作者： 付敏， 张东伟， 王继峰， 牛建昭， 杨美娟， 李健
作者单位： 北京中医药大学,细胞生物化学实验室,北京,100029
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(10)
被引用次数： 1次
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200610037.aspx