全 文 ：·882· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
中，DNA损伤可以启动分子级联反应，使细胞进入
细胞周期的S期从而为修复损伤的DNA提供时
间，此系统依赖于p53蛋白和PCNA蛋白的活化及
在细胞核内积聚，以便参与DNA修复和／或细胞周
期阻滞。继之NER的内切步骤、DNA修复和转录
过程均需要p53参与啪；内切后是损伤链的外切，最
后复制因子、DNA聚合酶和DNA连接酶相互作用
完成修复口“J。
本实验采用免疫组织化学方法检测了UVB辐
射后HaCaT细胞自然产生和清除光产物CPDs的
情况，并观察了JIl芎嗪对HaCaT细胞光产物CPDs
的影响。从结果可以看出，与非照光组和阴性对照组
相比，UVB辐射可以导致细胞DNA损伤而产生
CPDs，免疫组化法可以检测到细胞核棕褐色着色的
阳性细胞。UVB辐射后CPDs产生和清除的时效作
用表现为：照射UVB后细胞即开始产生CPDs，0．5
h左右达到高峰。同时细胞也在清除CPDs，在开始
的4h内清除速率较快，辐射后4～24h，CPDs清
除速率减慢，表现为阳性细胞数减少不明显。
川芎中的阿魏酸能有效地抑制氧自由基产生，
保护膜脂质不被氧化，防止DNA损伤发生，还可能
抑制肿瘤细胞的增殖生长[6]。川I芎嗪为其主要的活
性成分。本实验中在UVB辐射后加入川芎嗪与细
胞共同孵育后阳性细胞数明显少于单纯照射组，证
实了川芎嗪的光保护作用在于加药可以降低细胞培
养体系中CPDs的量，此效应可能与加速照光后已
生成的CPDs的清除有关，进一推测可能与前述的
抗炎、抗过氧化等机制有关。
通过RT—PCR法和Westernblotting法比较
了单纯UVB辐射HaCaT细胞中p53和PCNA的
mRNA和蛋白表达水平以及加用川芎嗪后对这些
调控基因表达的影响。从结果中可以看出，30mJ／
cnl2UVB辐射后，HaCaT细胞p53和PCNA的
mRNA和蛋白表达增加，经UVB照射再加川芎嗪
处理后，两种调控分子的mRNA和蛋白表达水平
均较单纯uVB照射组低，说明川芎嗪降低细胞中
CPDs水平的光保护作用机制可能与下调这些相关
修复基因的mRNA和蛋自表达有关。
总之，HaCaT细胞对UVB照射所致光产物
CPDs的清除存在快速期及慢速期；川芎嗪可降低
光产橛CPDs水平。川芎嗪的光保护作用可能与其
下调修复相关调控分子p53和PCNA基因和蛋白
表达有关。
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丹参酮ⅡA在大鼠肝微粒体酶中的代谢动力学
毕惠嫦1，和凡1，温莹莹1，陈孝2，黄 民p
(1．中山大学药学院临床药理研究所，广东广州 510080；2．中山大学附属第一医院药学部，广东广州510080)
摘要：目的研究丹参酮Ⅱn在大鼠肝微粒体酶中的代谢，以及选择性细胞色素P450(CYP)酶抑制剂对其代谢
的影响。方法超速离心法制备大鼠肝微粒体，采用高效液相一质谱联用方法测定孵育液中丹参酮Ⅱn原形药物的
收稿日期：2006—06—10
基金项目：广州新药临床前评价研究技术平台(广州市重大项目，2004ZI—E4051)
作者简介：黄民(1963一)，男，中山大学药学院院长，教授、博士生导师；研究方向为药物代谢与药动学、遗传药理学。
Tel：(020)87334521Fax：(020)87334718E—mail：huangmin@mail．sysu．edu．cn
*通讯作者黄民
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月·883·
浓度。研究丹参酮Ⅱ一的酶促动力学，推导出药物米氏常数(K。)和最大反应速度(y⋯)；并计算体外酶对药物的
清除率(观。。。)。同时观察不同浓度和不同种类的CYP酶特异性抑制剂对丹参酮Ⅱn代谢的影响。结果丹参酮
ⅡA在大鼠肝微粒体酶中的y⋯为(1．20±0．18)nmol／(rain·mg)；K。为(4．35±0．67)nmol／mL；CL。为
(o．28±0．06)mL／(min·mg)。噻氯匹啶和酮康唑能够显著抑制丹参酮Ⅱn的代谢，奎尼丁对丹参酮Ⅱ一的代谢也
有一定的抑制作用，而其他CYP酶抑制剂对丹参酮Ⅱn的代谢无明显影响。结论CYP2C19和CYP3AI主要参
与了丹参酮Ⅱn的代谢，CYP2D6也起到了部分代谢作用；这些CYP酶的抑制剂可能使丹参酮Ⅱn的代谢受到抑
制，造成药物药效或毒性的增加。
关键词：丹参酮ⅡA；代谢；肝微粒体；细胞色素P450(CYP)
中图分类号：R285．61 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)06—0882—05
MetabolickineticsoftanshinonelIAi ratlivermicrosomalenzyme
BIHui—chan91，HEFanl，WENYing～yin91，CHENXia02，HUANGMinl
(1．InstituteofClinicalPharmacology，SchoolofPharmaceuticalSc ences，SunYat—senU iversity，Guangzhou510080
China；2．DepartmentofPharmacy，FirstAffiliatedHospital，SunYat—senU iversity，Guangzhou510080，China)
Abstract：ObjectiveTostudythemetabolickineticsoftanshinoneⅡAa dtheffectsof elective
CYP450inhibitorsonthemetabolismoftanshinoneⅡAi ratlivermicrosomalenzyme．MethodsRat
livermicrosomeswerepreparedbyusingultracentrifugationmethod．TanshinoneⅡAco centrationinthe
incubationp001wasdeterminedbyLC／LC／MSmethod．TheMichaelis—Mentenparam tersK。andV⋯in
ratlivermicrosomeswerinitiallyestimatedbyanalyzingL eweave—Brurkplot．Thecl arance(CLi。t)was
calculatedforinvitroenzymetotanshinoneⅡA．VariousselectiveCYPinhibitorswe eusedtoinvestigate
theirnhibitoryeffectsonthemetabolismoftanshinoneⅡAa dtheprincipalCYPisoformsinvolvedin
tanshinoneⅡAmetabolicring．ResultsTheV。。。，K。，and(jLi。toftanshinoneⅡAwere(1．20±0．18)
nmol／(min·mg)，(4．35±0．67)nmol／mL，and(0．28±0．06)mE／(min·mg)，respectively．The
metabolismoftanshinoneⅡAwasignificantlyinhibitedbyticlopidineandk toconazole．Quinidineco ld
inhibitthemetabolismoftanshinoneⅡA，whiletheot ernhibitorsshowed1ittleinhibitoryeffectonthe
metabolismoftanshinoneⅡA．ConclusionItiSshownthatCYP2C19andCYP3A1areinvolvedinthe
metabolismoftanshinoneⅡAa dCYP2D6contributetothmetabolismtoso eextent．Theirselective
CYPinhibitorsmayhavepotentialinhibitiononmetabolismoftanshinoneⅡAa dmakethefficacyor
toxicityincreased．
Keywords：tanshinoneⅡA；metabolism；livermicr somes；CYP
丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA)是丹参根中的二
萜醌类脂溶性有效成分，经大量药理及临床观察研
究证明，丹参酮ⅡA具有多种药理作用，如心血管作
用、抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎作用等。1~3]。尤其在心
血管作用方面，其具有扩张冠状动脉、增加心肌收缩
力等作用，是临床治疗冠心病的常用药物，具有良好
的新药开发前景[4’5]。有关丹参酮ⅡA在大鼠肝微粒
体中的代谢动力学及参与其代谢的细胞色素酶
P450(CYP)亚型，国内外尚未见报道。本实验旨在
研究丹参酮ⅡA在大鼠肝微粒体中的代谢以及参与
其代谢的主要CYP亚型，为进一步研究该药的代
谢性相互作用奠定基础。
1材料与方法
1．1实验动物：SD大鼠，雄性，体重(250±25)g，
由中山大学实验动物中心提供，动物合格证号：
0008513。实验前禁食12h。
1．2药物及试剂：丹参酮ⅡA由中山大学药学院药
物化学教研室提取，质量分数大于99．8％；氯雷他
定购于中国药品生物制品检定所，质量分数为
99．4％。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸
(NADPH)，Roch公司；a一萘磺酮，磺胺苯毗唑，噻氯
匹啶，奎尼丁，4一甲基吡唑，酮康唑均购自Sigma公
司；甲醇为色谱一质谱纯，美国Tedia公司；其余试剂
均为分析纯，水为超纯水。
1．3 实验仪器：美国FinniganTSQ—QUANTUM
型三重四极杆液相色谱一质谱系统，配有电喷雾离子
化源、Surveyor输液泵及自动进样器以及Xcalibur
1．3数据采集软件、Lcquan数据处理软件。德国
Beckman公司AvantiJ—E型高速离心机、Optima
LE一80K型超速离心机。
1．4色谱一质谱条件：采用液相色谱一质谱法测定丹
参酮ⅡA。离子源为电喷雾电离源(ESI)；正离子方
式检测；电喷雾电压为3500eV；加热毛细管温度
为350℃；鞘气(N2)压力为103．425kPa，辅气
万方数据
·884· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
(N。)压力为6．895kPa，碰撞气(Ar)压力为
0．133Pa；碰撞诱导解离(CID)电压分别为15eV
(丹参酮ⅡA)和22eV(氯雷他定)；碰撞能量分别
为20eV(丹参酮ⅡA)和41eV(氯雷他定)；扫描
方式为选择反应监测(SRM)，用于定量分析的离子
反应分别为m／z295—249(丹参酮ⅡA)和优／z
383--，266(氯雷他定)。色谱分析柱为HypersilBDS
C。。色谱柱(2．1mm×50mm，5弘m，大连依利特科
学仪器有限公司)；流劝相为甲醇一水(90：10)(水
中含1％甲酸)，体积流量为300t-L／min，柱温为30
℃。分析时间为2min。
1．5肝微粒体制备：大鼠断头处死后，立即取出肝
脏，称质量。迅速放入o～4℃冰浴中剪碎，用冰冷
的蔗糖溶液(o．25mmol／L，pH7．4)洗涤数次至
没有血色后制成匀浆，在16000×g、4℃离心20
min；取上清液，1000 0×g、4℃离心60min；取沉
淀用焦磷酸钾溶液(o．1mol／L，pH7．4)洗涤1
次，混悬均匀，再次10000×g、4℃离心60min。
弃上清，沉淀用含20％甘油的Tris—HCl缓冲液
(o．1mol／L，pH7．4)重悬，一80℃保存备用。
Lowry法艮3测定肝微粒体蛋白质浓度。
1．6孵育条件：孵育体系总体积500弘L，反应体系
中包含NADPH(1mmol／L)，微粒体蛋白(0．4
mg／mL)，磷酸盐缓冲液(O．1mol／L，pH7．4)。丹
参酮ⅡA及各种抑制剂用不同比例的甲醇配制，反
应体系中甲醇终体积分数小于1％。反应在37℃
水浴中进行，预孵5min，加入NADPH启动反应，
一定时间后，加冰乙醚1．5mL终止反应，按1．7项
下处理并进样分析。
1．7 样品处理：0．5mL孵育液中加冰乙醚1．5
mL，加入5肛L(5／zg／mL)内标氯雷他定溶液，混
匀，涡旋1min，4000r／min离心10min，取有机相
于真空干燥箱挥干后加500弘L甲醇～水(90；lO)
溶解，移入进样管，进样10弘L进行色谱一质谱分析。
1．8代谢抑制实验：研究选择性的CYP酶抑制剂
对丹参酮ⅡA代谢的影响。孵育条件同前。孵育体系
中丹参酮ⅡA浓度为2t-mol／L，微粒体蛋白质量浓
度为0．4mg／mL，孵时间为5min(根据酶促动力
学实验结果确定)。实验中所用的选择性抑制剂为
。c～萘磺酮(CYPlA2，0．5～2pmol／L)，磺胺苯吡唑
(CYP2C9，2．5～10／堕mol／L)，噻氯匹啶
(CYP2C19，1．25～40pmol／L)，奎尼丁(CYP2D6，
0．5～2／1mol／L)，4一甲基吡唑(CYP2E1，5～20
umol／L)，酮康唑(CYP3A1，0．1～4／卫mol／L)，对照
组用等量的溶剂代替抑制剂。抑制程度按抑制剂浓
度为0时代谢量为100％计算。
2结果
2．1方法的专属性与线性：在选定的检测条件下，
由色谱图(图1)可见，本方法具有良好的专属性，丹
参酮ⅡA和内标氯雷他定峰形良好，无内源性杂质干
扰，各种抑制剂的加入也不干扰丹参酮ⅡA的检测。
丹参酮ⅡA在0．5～16弘mol／L线性良好，代表性标
准曲线方程：y=15．46C+8．78(R2—0．9974)。
2．2回收率与精密度：丹参酮ⅡA在肝微粒体酶中
浓度分别为1、4、16ptmol／L时，提取回收率(72—5)
分别为(65．0±1．o)％、(70．9±0．5)％、(64．2±
1．3)％，呈非浓度依赖关系；批内精密度RSD(咒一
5)分别为8．7％、2．9％、3。2％；批间精密度RSD
(咒一5)分别为7．6％、3．0％、4．1％。符合生物样品
的检测要求。
2．3 孵育时间对丹参酮ⅡA代谢的影响：在含有
0．4mg／mL大鼠肝微粒体酶中加入丹参酮ⅡA(2
牡mol／L)，在37℃水浴中孵育不同时间(1～40
rain)。结果显示，在1～10min内丹参酮ⅡA呈线性
消除。
2．4肝微粒体蛋白质量浓度对丹参酮Ⅱn代谢的
影响：在不同蛋白质量浓度(0．05～0．8mg／mL)
的微粒体酶中加入丹参酮ⅡA(2弘mol／L)，在37℃
水浴中孵育5min。结果显示，在0．05～o．4mg／mL
内，随着蛋白质量浓度的增加，丹参酮ⅡA消除呈线
性增加。
2．5微粒体酶对不同浓度丹参酮ⅡA的代谢：在蛋
白质量浓度为0．4mg／mL的肝微粒体酶中，分别
加入不同量的丹参酮ⅡA(终浓度为0．5、1、2、4、8、
16t．￡mol／L)，37℃水浴中孵育5min。根据
Lineweaver—Burk双倒数曲线，使用GraphPad
Prism4．0软件来求算米氏常数(瓦)和最大反应速
率(y。。)，其截距的倒数即为y～值，斜率与V～
的乘积即为K。值，y一／K。即为CLi。。(体外酶对药
物的清除率)，从而得出样品的酶促动力学参数[5’6]。
结果y。。为(1．20±0．18)nmol／(min·rag)，K。为
(4．35±0．67)nmol／mL。CLInt为(0．28士0．06)
mL／(min·mg)。
2．6 选择性CYP抑制剂对丹参酮ⅡA代谢的影
响：不同酶抑制剂能对CYP酶不同亚家族产生特
异性的抑制，借此可以研究药物的代谢途径以及药
物的代谢规律。以抑制剂的浓度为横坐标，药物的代
谢率为纵坐标(按抑制剂浓度为0时代谢量为
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
100％计算)作图，结果见图2。结果表明，CYP2C19
的特异性抑制剂噻氯匹啶在1．25Ilmol／L时就可
以明显抑制肝微粒体酶对丹参酮1IA的代谢(P<
0．01)，降低丹参酮ⅡA的代谢速率；同样CYP3A1
的特异性抑制剂酮康唑在0．1t堕mol／L时就可明显
抑制肝微粒体酶对丹参酮ⅡA的代谢(P<0．01)。
CYP2D6的特异性抑制剂奎尼丁虽然也在1／lmol／
L对丹参酮ⅡA的代谢有明显的抑制作用(P<
0．01)，但作用远小于噻氯匹啶和酮康唑，其最高浓
度(2t2mol／L)时对酶的抑制作用也远小于噻氯匹
啶和酮康唑的抑制作用。所以，噻氯匹啶和酮康唑可
以显著抑制丹参酮ⅡA的代谢速率；奎尼丁对药物
的代谢也呈现一定程度的抑制，而其他抑制剂对丹
参酮ⅡA的代谢无明显的影响。蕊。¨≮
一一一f＼八一
0 0．4 0．8 1．2 1．6 2．0 0 0．4 0．8 1．2 1．6 2．0 0 0．4 0．8 1．2 1．6 2．0
t}h
A一空白大鼠肝微粒体B一空白肝微粒体加入内标(氯雷他定)C一加人丹参酮IA孵育5min的肝微粒体样品
A—blankratmicrosomesB—ratlivermicrosomeswithIS(10ratadine)C—ratmicrosomesincubatedwithtanshinoneIAfor5min
图1丹参酮Ⅱ一(A、B、C中的上图)及内标(A、B、C中的下图)的高效色谱一质谱
Fig．1RepresentativechromatogramsftanshinoneⅡ^(upA，B，andC)andIS(Ioratadine，downA，B andC)
孚＼
姗|
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靛
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00
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80
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噻氯匹啶／(utool·L-1)
4一甲基吡唑／(utool·L-1)
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0 1 2 3 4
酮康唑／(umol·L-1)
0 0．5 l 1．5 2
i一萘磺酮／(umo卜L-1)
100
量80
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着40
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蔼
g
靛
罂
00
80
60
40
20
0
奎尼丁／(utool·L-1)
图2 CYP选择性抑制剂对大鼠肝微粒体代谢丹参酮Ⅱ-(2lamol／L)作用的影响(辟一3)
Fig．2EffectsofvariousCYPselectiveinhibitorsonmetabolismoftanshinoneⅡA(2umol／L)
inratlivermicrosomes(稃一3)
3讨论
本实验建立的测定肝微粒体酶中丹参酮ⅡA的
色谱一质谱方法，经回收率、精密度及标准曲线等方
法学验证项目考察，表明此分析方法具有灵敏、准
确、快速的特点，能成功应用于丹参酮ⅡA在大鼠肝
微粒体酶中的代谢研究。研究结果显示，丹参酮ⅡA
在大鼠肝微粒体中被迅速代谢；在温孵时间(1～10
min)以及蛋白质量浓度(o．05～0．4mg／mL)，丹
参酮ⅡA的代谢呈线性变化。当丹参酮ⅡA浓度大于
2／-mol／L时，其代谢速率不再随底物浓度的增加而
增加，反而表现速率下降的特性。通过研究不同酶抑
制剂对药物代谢的影响，可以了解药物的代谢规律
以及可能产生的药物相互作用。噻氯匹啶和酮康唑
为CYP2C19和CYP3A1的特异性抑制剂，在本实
验中可以显著抑制丹参酮ⅡA的代谢；奎尼丁
(CYP2D6)对药物的代谢也呈现一定程度的抑制，
而其他抑制剂对丹参酮ⅡA的代谢无明显的影响。
这说明CYP3A1和CYP2C19主要参与了丹参酮
万方数据
·886· 中草喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
ⅡA的代谢，是丹参酮ⅡA代谢的一个关键步骤；
CYP2D6也部分参与了药物的代谢。由于药物间代
谢性相互作用是影响药物在体内浓度水平的一个重
要因素，因此抑制丹参酮ⅡA上述的代谢途径将会
降低其代谢速率，提高丹参酮ⅡA在体内的水平。提
示CYP2C19、CYP3A1、CYP2D6的抑制剂与丹参
酮ⅡA之间有潜在的药物相互作用，前者可以降低丹
参酮ⅡA的代谢速率。本研究对丹参酮ⅡA的体外代
谢作了初步的探讨，为进一步药物相互作用研究和
进行人体试验提供参考和依据。
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p一榄香烯对人膀胱癌BIU一87细胞磷脂膜功能及Bcl一2表达的影响
李传刚1，李墨林2，周 琴3，舒晓宏，刘用楫1，韩国柱3
(1．大连医科大学附属第二医院泌尿外科，辽宁大连116023；2。大连医科大学病理生理教研室，
辽宁大连116027；3．大连医科大学药学院，辽宁大连116027)
摘 要：目的 探讨p榄香烯对人膀胱癌BIU一87细胞磷脂膜功能及Bel一2表达的影响。方法[32P]Pi同位素参
入，提取细胞磷脂进行HPTLC分析细胞磷脂(PC及PE)代谢，考马斯亮蓝法测定细胞膜蛋自水平，分析细胞脂
膜流动性及流式细胞仪测定Bcl一2表达的变化。结果随着p榄香烯浓度的增加，[32P]Pi参人细胞PC、PE量明显
降低，膜蛋白水平及Bel一2表达明显降低，其最大抑制率分别为：41．1％、43．3％、43％、50％，呈明显的量效关系
(P
关键词：p榄香烯；人膀胱癌；磷脂；HPTLC；Bcl一2
中图分类号：R285．5 文献标识码；A 文章编号：0253—2670(2007)06—0886—04
Effectsofp—elemeneonphosphatidemembranefu ctionandBcl一2expression
ofhumanbladderca cinomaBIU一87cells
LIChuan—gan91，LIMo—Iin2，ZHOUQin3，SHUXiao—hon93，LIUYong—jil，HANGuo—zhu3
(1．DepartmentofUrinarySurgery，secondAffiliatedHospital，DalianMed calU ivercity，Dalian116023，China；
2．DepartmentofPathophysiology，DalianMedicUniversity，Dalian116027，China；3．School
ofPharmacy，DalianMedic lUniversity，Dalian116027，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheffectsofpelemeneonthephosphatidemembranefu ction
andBcl一2expressionofhumanbladercarcinomaBIU一87cells．MethodsPho phatidylch01ine(PC)and
phosphalidylethanolamine(PE)contentsweremeasuredbytheme hodf[32P]Piincorporationand
HPTLCseperation，the1evelofmembraneproteinwasdeterminedbyCoomassiebrilliantblue。the
expressionofBcl一2wasobservedbyflowcytometry，andthemembranefluidityof heBIU一87cellswas
examined．ResultsComparingw ththecontr01，the肛elemenecouldmark dlyinhibitthelevelofPC，
PE，membraneprot in，andBcl一2expressioninadose—dependentmanner，themaximuminhibitionrates
are41．1％，43．3％，43％，and50％(P<0．05)，respectively，aswellasthemembranefluidityofthe
收稿日期：2006—11-24
基金项目：辽宁省科技厅自然科学基金计划资助项目(20062156)
作者简介：李传刚(1967一)，男，大连人，辽宁省中西医结合学会理事，博士，教授，硕士生导师，从事中西医结合防治膀胱肿瘤的临床及
．⋯。料词￡]三饩，已发表论文20余麓。Tel：13591397759E—mail：ehuangang—li@hotmail．tom
*通讯作者舒晓宏E—mail；schuxh@yahoo．corn．cn
万方数据
丹参酮ⅡA在大鼠肝微粒体酶中的代谢动力学
作者： 毕惠嫦， 和凡， 温莹莹， 陈孝， 黄民， BI Hui-chang， HE Fan， WEN Ying-ying，
CHEN Xiao， HUANG Min
作者单位： 毕惠嫦,和凡,温莹莹,黄民,BI Hui-chang,HE Fan,WEN Ying-ying,HUANG Min(中山大学药学
院临床药理研究所,广东,广州,510080)， 陈孝,CHEN Xiao(中山大学附属第一医院,药学部
,广东,广州,510080)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(6)
被引用次数： 7次
参考文献(6条)
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本文读者也读过(4条)
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引证文献(8条)
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