全 文 ：中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月·573·
组织中的PCNA呈阳性的肿瘤细胞显著低于模型
组，表明肿瘤增殖受到了抑制。同时，阿魏酸钠组比
模型组微血管计数显著减少，说明阿魏酸钠抑制了
小鼠体内H：：肿瘤的生长和血管生成。但是，本实验
并不能证实白芍总苷具有抑制肿瘤生长及肿瘤血管
生成的作用，但也没有证据表明白芍总苷有促进肿
瘤生长的作用。
为了进一步分析阿魏酸钠抑制血管生成的作用
是否通过对H：。肿瘤细胞的直接细胞毒作用而实现
的，采用MTT法来验证阿魏酸钠是否对体外培养
的H。：肿瘤细胞具有直接的细胞毒作用。结果阿魏
酸钠组的质量浓度即使达到了160／*g／mL，其肿瘤
细胞的A值尚与模型组无显著性差异。说明阿魏酸
钠对肿瘤细胞不具有直接的细胞毒作用，阿魏酸钠
对整体动物肿瘤模型的肿瘤生长抑制作用是通过抑
制肿瘤血管生成实现的。
免疫组织化学发现，阿魏酸钠各剂量组均能有
效地抑制肿瘤组织的VEGF表达。VEGF是最重要
的促血管生成因子，能通过其受体KDR／Flk一1有
效激活胞外信号调节激酶(ERK)，从而刺激内皮细
胞DNA合成印]，也能够通过PI一3K通路激活抗凋
亡激酶Akt／PKB而发挥抗凋亡作用[10|。结合阿魏
酸钠组肿瘤组织微血管密度降低的结果，说明阿魏
酸钠可能是通过抑制肿瘤细胞VEGF的分泌来抑
制体内H。。肿瘤的生长及血管生成。
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槟榔碱对骨髓细胞内DNA的影响
季宇彬，李连闯，于 蕾
(哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，黑龙江哈尔滨 150076)
摘 要：目的通过体内骨髓细胞实验，探讨槟榔碱对DNA的损伤作用机制。方法采用AO探针标记，激光共聚
焦技术检测槟榔碱对骨髓细胞内DNA和RNA的影响；采用流式细胞仪测定槟榔碱对骨髓细胞周期的影响。结果
给予槟榔碱20、10、5mg／kg剂量的染毒组，骨髓细胞内RNA／DNA的荧光像素比值明显高于空白对照组，差异非
常显著(P率有非常显著降低(PDNA有一定的损伤作用，具有一定的遗传毒性。
关键词：槟榔碱；激光共聚焦；流式细胞仪；DNA；RNA；细胞周期
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)04—0573—03
收稿日期：2006—10—30
作者简介：季宇彬(1956一)，男，辽宁省人，教授，博士，多年来一直致力于中药药理、肿瘤药理、分子药理学研究。
万方数据
·574· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月
EffectsofarecolineonDNAinbonemarrowcells
JIYu—bin，LILian—chuang，YULei
(ResearchCenteronLifeSciencesandEnvironmentalScience，HarbinUniversityofCommerce，Harbin150076，China)
Abstract：ObjectiveTos udythemechanismofarecolineondamagetoDNAthroughthebone
marrowcellexperimentinvivo．MethodsLaserConfocalMicroscopewasadoptedomeasureDNAand
RNAofthebonemarrowcellsmarkedbyAOprobe．Influencesofare olineoncellcyclew reobservedby
theFlowCytometer．ResultsInjec ionofarecolineto20，10，and5 mg／kgposologicgroup，the
fluorescencepixelratioapparentlyhigherthanthatinblankcontrolgroupofthebonemarrowcellinside
RNA／DAN．thediff rencewasignificant(Pcontrolgroup，Go／Glpercellratiohadgotparticularlyincrease(Pparticularlydecrease(PConclusionThearecolinehavegotdefinitedamageactionDNAinbonemarrowcellofmiceand
possessedomegeneticoxicity．
Keywords：arecoline；laserconfocalmic oscope；FlowCytometer；DNA；RNA；cellcycle
咀嚼槟榔习惯与口腔黏膜下纤维性变的发生密
切相关，有实验研究表明，用槟榔制剂涂在大鼠的口
腔黏膜上，88％的实验鼠均发现口腔黏膜下纤维性
变，且有恶变倾向。由此可见，嚼食槟榔危害健康，尤
其是可增加罹患口腔癌的危险。用槟榔水提取物给
大鼠SC，全部动物都发生恶性纤维间质瘤，因而认
为槟榔碱的水解物可能是致癌物质。自槟榔中分离
出的生物碱以槟榔碱的量最多，是槟榔的主要成分，
有毒性。此外，尚含有少量槟榔次碱和去甲基槟榔次
碱及更少的去甲基槟榔碱、槟榔副碱和异去甲基槟
榔次碱等口]。槟榔碱为无旋光性、无色油状液体，无
臭，味苦，其性质不稳定，具有挥发性，常制成槟榔碱
的氢溴酸盐或无机盐，是一种M、N受体激动剂。药
理毒理试验证实，槟榔碱有M一胆碱反应和拟副交
感神经毒理作用等几种毒副反应，并较毛果芸香碱、
毒扁豆碱及蝇蕈为强。在前期实验中发现，槟榔碱有
致微核突变和染色体畸变的作用，本实验研究旨在
探讨槟榔碱对DNA的损伤作用机制。
1材料
1．1 药品和试剂：氢溴酸槟榔碱(质量分数
98％)，购于中国药品生物制品检定所；荧光探针为
0．01％的吖啶橙(AO)，购于Sigma公司；PI，
SigmaP4170；PBS、TritonX一100，武汉博士德生物
工程有限公司；Rnaes，SigmaR4875。
1．2 主要仪器：SP一2激光扫描共聚焦显微镜，
Leica；流式细胞仅，Beckman—Coulter公司；C02培
养箱，三洋公司；LD。一2A型台式低速离心机，北京
医用离心机厂；SartoriusBSll0S型万分之一电子
天平，德国。
2实验方法
2．1 实验动物的分组及染毒：小鼠40只，随机分
成4组，每组10只，雌雄各半，采用ip给药对小鼠
进行染毒，各组染毒剂量分别为20、10、5mg／kg
(相当于1／4LD。。、1／8LD。。、1／16LD5。)，另设空白
对照组(生理盐水)。槟榔碱不同剂量染毒组连续染
毒14d，每天上午9点ip一次。实验组于末次染毒
后禁食、自由饮水，24h内进行实验。
2．2激光扫描共聚焦显微镜测定槟榔碱对骨髓细
胞内DNA、RNA的影响：取小鼠股骨的骨髓细胞，
滤过，离心，制备人工贴壁细胞，采用荧光探针AO
染色，置激光扫描共聚焦显微镜上观察，使用488
nm氩离子激光激发荧光染料AO[2]。每张标本，选
取10个细胞，激光扫描共聚焦自动处理得出RNA／
DNA的荧光像素比值，做统计学处理。
2．3 流式细胞仪测定槟榔碱对骨髓细胞周期的影
响：取小鼠股骨的骨髓细胞，滤过，离心，制备细胞悬
液，PI染色，用流式细胞仪测定骨髓细胞周期，激发
光波长为488nm，发射光波长大于630nm。每份样
品选取10000个细胞，做统计学处理。
2．4数据处理：对所有数据进行方差分析，结果均
以至±s表示。
3 结果
3．1 激光扫描共聚焦显微镜测定槟榔碱对骨髓细
胞内DNA、RNA的影响：结果表明(表1)，给予槟
榔碱20、10、5mg／kg剂量的染毒组RNA／DNA的
荧光像素比值明显高于空白对照组，差异非常显著
(PDNA呈绿色荧光，细胞内RNA呈红色荧光，染毒
后RNA荧光强度明显增强，而DNA荧光强度明
显降低。用激光扫描共聚焦显微镜重建骨髓细胞的
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月·575·
扫描图可以明显显示出这种差异。
3．2 流式细胞仪测定槟榔碱对骨髓细胞周期的影
响：结果表明(表2)，给予槟榔碱20、10、5mg／kg
剂量的染毒组小鼠骨髓细胞周期与空白对照组相
比，G。／G。期细胞比率非常显著增加(P<0．0i)，S
期细胞比率非常显著降低(P胞比率非常显著降低(P表1 槟榔碱对小鼠骨蕊细胞内DNA和RNA的影响(；士s)
Table1 EffectofarecolineonDNAandRNAinbone
marrowcellsofmice(；士s)
与空白对照组比较：一P’’P表2槟榔碱对骨髓细胞周期的影响(z士s)
Table2 Effectofarecolineoncellcycleinbone
marrowcellsofmice(；土s)
剂量／ 细胞数／ 细胞周期／％
删(mg．kg—t)个—面丁——1———丽
空白对照
槟榔碱
10000
10000
10000
10000
与空白对照组比较：一P。’P4讨论
激光共聚焦扫描显微镜是利用荧光探针渗透到
细胞内部，有选择地与活细胞的不同成分结合；以激
光共聚焦扫描细胞；使用计算机对获得的细胞荧光
强度进行量和形态的分析，不仅能得到较光学显微
镜分辨率高的细胞形态和组分分布的清晰图像，而
且可动态观察细胞内代谢的变化[3]。本实验所采用
的荧光探针为AO，它可以在使用某一浓度时对活
细胞进行染色。一般使用的浓度介于l：1000和
1：500，本研究使用的浓度为1：1000 。AO染料
具有可以被可见光激发及激光淬灭率低的特点。本
实验通过激光共聚焦扫描显微镜扫描结果，可以观
察到ip槟榔碱染毒两周后，随着染毒剂量的增加，
20、10、5mg／kg染毒剂量组的RNA与DNA比值
与空白对照组相比均有显著上升，RNA的量明显
增加，DNA的量明显降低，提示可能是槟榔碱干扰
DNA的模板功能，与DNA共价结合引起复制期间
核苷酸错配，或是与DNA发生交联，还可能是引起
DNA断裂，从而阻断DNA复制，RNA与DNA的
荧光像素比值明显高于空白对照组(P明槟榔碱对小鼠骨髓细胞内DNA和RNA的量有
明显的影响，提示槟榔碱对DNA合成有一定的抑
制作用。
细胞周期检测是研究外来化合物致毒作用机制
的重要手段，流式细胞术是细胞周期检测最有效的
常用方法[4]。细胞周期有两个主要限制点，即G，／S
限制点(控制细胞从G，期进入S期，能防止受损的
碱基复制，修复染色体中的突变)和G。／M限制点
(tt“细胞”一分为二的控制点，能使细胞在进入分裂
期之前修复已复制好的DNA上出现的损伤)。通过
限制点后，刺激信号被去除，细胞仍然会开始DNA
复制[5]。本实验将小鼠骨髓细胞作为研究对象，利用
流式细胞仪，对其细胞周期做了研究。20、10、5rag／
kg染毒剂量组染毒后的小鼠骨髓细胞在G，期细胞
比率有非常显著增加(P率有非常显著降低(P髓细胞增长阻滞在G。期，影响S期DNA的合成，
从而减少进入G。／M期细胞数。进入S期细胞的减
少会使有丝分裂和细胞增殖数量降低，表明槟榔碱
已经对小鼠骨髓细胞的增殖能力造成抑制作用。骨
髓细胞周期也是反映造血系统造血动能的重要指
标，细胞周期的分布情况可反映骨髓增生程度[6]。本
实验中骨髓细胞在G，期发生阻滞，而骨髓细胞周期
发生G。期阻滞是机体对外界刺激的一个保护性反
应，可提供充足的时间来促使受损伤DNA的合成
和复制并于S期前得以修复。综上所述，槟榔碱对小
鼠骨髓细胞的DNA有一定的损伤作用，具有一定
的遗传毒性。
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万方数据
槟榔碱对骨髓细胞内DNA的影响
作者： 季宇彬， 李连闯， 于蕾， JI Yu-bin， LI Lian-chuang， YU Lei
作者单位： 哈尔滨商业大学,生命科学与环境科学研究中心,黑龙江,哈尔滨,150076
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(4)
被引用次数： 1次

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