全 文 ：　[收稿日期] 2007 - 01 - 11
　[基金项目] 华南师范大学广东省植物发育生物工程重点实验室开放基金资助项目(410142)
　[第一作者简介] 李德明(1972 -),男 ,湖北武汉市人 ,农学博士 ,讲师 , 主要从事植物矿质营养 、逆境生理生化及发育生理和园林植物
应用教学与研究.
蓝猪耳胚囊结构观察方法的比较
　　李德明　 长江大学园艺园林学院 , 湖北 荆州 434025;华南师范大学生命科学学院 , 广东省植物发育生物工程重点实验室 , 广东 广州 51 0631
　　张秀娟　(长江大学园艺园林学院 , 湖北 荆州 434025)
　　宾金华　(华南师范大学生命科学学院 ,广东省植物发育生物工程重点实验室 , 广东 广州 51 0631)
[ 摘要]采用不同显微镜和染料对蓝猪耳(Torenia fournieri Lind.)胚囊结构进行了比较观察。结果表明, Leica
DM5000B显微镜和 Leica DMI 4000B荧光显微镜不适合观察 、拍摄胚囊超微结构 , Leica DMRXA 显微镜基本
符合要求 ,激光共聚焦显微镜效果最好。普通显微镜下即可观察到未染色材料的胚囊 ,染色后效果更佳。爱
氏苏木精染色 ,胚囊着色浅且不均匀;曙红 Y 染色 ,需在荧光显微镜下观察 、拍照。荧光染料(DAPI、鬼笔环
肽 、碘化丙啶和罗丹明)染色后 ,采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察胚囊结构特征 ,效果良好。
[ 关键词] 蓝猪耳(Torenia fournieri Lind.);胚囊;荧光显微镜;激光共聚焦扫描显微镜;染料
[ 中图分类号] Q944. 45;Q949. 777. 8 [ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1673 - 1409(2007)02 - S066 - 04
蓝猪耳(Torenia f ournieri Lind. )为玄参科蓝猪耳属(翼萼属)一年生草本植物 ,因其胚囊裸露 ,是研
究花器官发育和授粉受精过程的理想模式植物。胚囊是被子植物的雌配子体 ,是其有性生殖中的重要载
体[ 1] 。随着研究手段的不断完善 ,观察胚囊结构有多种方法[ 2 ～ 6] 。由于蓝猪耳胚囊裸露[ 7] 、不太适合固定
后切片观察分析 ,故所选用的观察方法多为活体染色后观察拍照 。自 2005年 10月至 2006年 10月 ,采用
解剖后直接在体视或荧光显微镜下观察 、爱氏苏木精染色观察 、番红染色观察 、曙红 Y 染色观察 、4’ , 6-二
联脒-2-吲哚苯(4’ ,6-Diamidine-2-pheny lindole dihydrochloride ,简称 DAPI)染色荧光显微镜观察 、鬼笔环
肽与碘化丙啶(propidium iodide ,简称 PI)等荧光染料联合染色后观察等多种方法对蓝猪耳胚囊结构进行
了观察拍照。
1　材料与方法
1. 1　蓝猪耳胚囊直接观察
参照余炳生等的方法[ 8] ,适当改进。
取开放前 1 d的花蕾用眼科镊子剥去萼片→以微解剖针和尖嘴眼科镊子去花冠和退化雄蕊→以眼科
手术剪去柱头和子房上部(无胎座部分)→用注射器针头锋利面切开子房壁 ,尽可能地去掉子房壁→取凹
玻片 ,在凹槽中滴入子房解剖液或无菌水→以尖嘴镊子夹住花梗 ,用注射器针头锋利面从胎座上切下胚
珠 ,使之散落到子房解剖液或无菌水中→盖上盖玻片即可进行胚囊观察或拍照(以 Leica DMRXA 自动生
物显微镜观察)。
1. 2　蓝猪耳胚囊爱氏苏木精染色观察
参照周江菊等[ 9] 和杨鹭生等[ 6] 的方法适当改进 。
取开放前 1 d花朵用 FAA Ⅱ固定子房 24 ～ 48 h ,用 50%酒精洗 2 次(每次 1 h), 70%酒精保存(4
℃),倾去酒精 ,用爱氏苏木精工作液染色 2 ～ 3 d ,加蒸馏水浸洗 ,换数次至水中无浮色。换自来水使子房
变蓝色 ,然后用 1%钾矾分色 10 s ,经自来水冲洗 30 min后用蒸馏水冲洗 3次 ,换入 30%酒精 ,梯度酒精
逐级脱水至 100%酒精 ,用水杨酸甲酯对子房进行透明。在 1滴水杨酸甲酯中解剖染色后的子房 ,分别在
66 长江大学学报(自科版) 农学卷　2007年 6月第 4卷 第 2期Journal of Yangtze University(Nat Sci Edit) Agri Sci V　Jun. 2007 , Vol. 4 No. 2
普通显微镜和微分干涉差显微镜下观察胚囊并拍照。
1. 3　蓝猪耳胚囊曙红 Y染色观察
胚囊曙红 Y 染色操作参照余炳生等的方法[ 8] 。蓝猪耳子房用 FAA 固定后用 50%酒精冲洗 2次 ,每
次 10 min→冲洗后的子房可在 50%酒精中解剖也可转入 70%酒精中在 4 ℃条件下保存→ 70%、50%、
30%、10%酒精复水(每步 10 min)→至蒸馏水→ 2%钾矾(硫酸铝钾)媒染 1 h→ 4%蔗糖曙红 Y溶液染
色 10 ～ 12 h→染色后即用2%钾矾分色1 h→流水冲洗 2 ～ 3次 ,每次1 h→ 100%酒精中过夜→50%水杨
酸甲酯(V水杨酸甲酯∶V 无水乙醇=1∶1)过渡 1 ～ 2 h→纯净水杨酸甲酯透明 1 h 以上→微分干涉差
(DIC)显微镜(Leica DM5000B型显微镜或 Leica DMRXA自动生物显微镜)或激光共聚焦显微镜观察拍照 。
1. 4　蓝猪耳胚囊 DAPI染色后荧光显微镜观察
参照Wallw o rk等[ 5]的方法以及 Roche 公司 DA PI产品使用说明书进行 ,具体操作如下:
在暗处以超纯水将 DAPI(购于 Roche公司)配成 1 mg L - 1母液 ,避光(锡纸包装),贮藏于 - 20 ℃
～ - 30 ℃冰箱→以 TAN 缓冲液配制 DAPI工作液(工作液中 DA PI浓度为 3 μg L - 1), TAN缓冲液组
成为:15%蔗糖 ,20 mmol /L T ris-HCl(pH 7. 65),0. 5 mmol /L EDTA ,1. 2 mmol /L 亚精胺 , 7 mmol /L 2-
巯基乙醇 ,0. 4 mmol /L PMSF(先用 DMSO或乙醇溶解),DA PI工作液避光 4 ℃保存→开启荧光显微镜 ,
打开荧光发射灯(不少于 15 min)→按前面介绍的胚囊直接观察法剥除蓝猪耳子房壁 ,露出胎座→关闭室
内灯光 ,仅用不太明亮的散射光即可→在凹玻片凹槽中滴一滴子房解剖液 ,子房解剖液组成为:0. 5 mg
L -1HEPES ,10 mg L - 1KCl ,0. 025 mg L - 1CaCl2 ,0. 026 mg L - 1MgCl2 ,3%蔗糖 ,pH 7. 0 ,迅速在子
房解剖液中从胎座上割下胚珠→略吸除子房解剖液 ,滴加 DAPI工作液后用盖玻片盖凹玻片凹槽 ,置暗室
孵育 2 ～ 10 min(根据试验结果调整孵育时间)→选择 385 nm 波长在荧光显微镜下对经 DAPI染色后的
蓝猪耳胚囊观察并拍照。
1. 5　蓝猪耳胚囊荧光染料染色后激光共聚焦显微镜观察拍照
参照陈素红等[ 7] 、袁明等[ 10]和白君[ 11] 的方法 。
配制 4 μmol L - 1A lexa 488 -鬼笔环肽与 20μg mL - 1 PI 共注射液以及 1. 5 mg L - 1罗丹明(用专
用缓冲液:20 mmol L -1Glu ,2 mmol L - 1 MgCl2 ,pH 6. 9配制)→按 1. 1方法去子房壁 ,露出胎座→按袁明
等的方法进行胚囊显微注射或按白君和陈素红等的方法进行酶解法获得胚囊后孵育染色→采用 Leica TCS
SP2或伯乐公司 MRC600激光共聚焦扫描显微镜观察并记录。
2　结果与分析
各种观察方法的照片见图 1 ～ 5。
图 1　胚囊未染色 Leica DM5000B型
微分干涉差显微镜照片
Figure 1　The photo of non-staining embryo sac taken by Leica
DM5000B differential interference contrast(DIC) microscope
图 2　胚囊爱氏苏木精染色后 Leica DM5000B型
微分干涉显微镜照片
Figure 2　The photo of Ehrl ich’ s hematoxylin staining
embryo sac taken by Leica DM5000B differential
interference contrast microscope
67 第 4 卷 第 2 期 李德明等:蓝猪耳胚囊结构观察方法的比较 　
图 3　胚囊曙红 Y染色后 Leica DM5000B型显微镜或 Leica DMRXA自动生物显微镜照片
Figure 3　The photos of eosin Y staining embryo sac taken by Leica DM5000B differential interference
contrast microscope or Leica DMRXA automatic bio-microscope
图 4　胚囊 DIPI染色后 Leica DM5000B型微分干涉显微镜照片
Figure 4　The photo of DIPI staining embryo sac taken by Leica DM5000B differential interference contrast microscope
图 5　胚囊荧光染料(Alexa 488 - 鬼笔环肽 、PI或罗丹明)染色后激光共聚焦扫描显微镜照片(其中红色发光团为卵核)
Figure 5　The photos of fluorescence dye(Alexa 488-phalloidin, propidium or Rhodamine )
staining embryo sac taken by laser scanning confocal microscope(LSCM)(Red br ight spot is ovum)
2. 1　显微镜的选择
对照图 1与图 2 ,结果显示图 1即可反映出蓝猪耳胚囊结构特征。若仅观察子房发育程度 ,采用普通
体视镜(20倍)即可达到明确蓝猪耳胚珠区域的目的 。对照各种染色后采用不同型号显微镜观察拍照的
效果 ,发现 Leica DM5000B型非荧光显微镜以及微分干涉差显微镜和 Leica DM I 4000B 型荧光显微镜精
68 　 长江大学学报(自科版)农学卷 2007年 6 月
度均达不到清晰拍摄蓝猪耳胚囊超微结构的要求 ,采用 Leica DMRXA 自动生物显微镜才基本能照出符
合要求的胚囊结构照片。结果表明 ,要清晰地显示出蓝猪耳胚囊内部微管 、微丝的衍化 ,以使用激光共聚
焦显微镜观察 、拍摄彩色照片效果最好 。
2. 2　不同染色方法的比较
试验采用了多种染色方法(爱氏苏木精染色 、番红染色 、曙红 Y染色 、DIPI及鬼笔环肽 、碘化丙啶和罗
丹明等染色)。从确定胚囊轮廓出发 ,普通显微镜下活体材料不经染色即可观察到胚囊 ,但胚囊内部结构
的观察以染色后为佳 。所用染料中爱氏苏木精(染细胞核成蓝色)染后 ,胚囊着色较浅且着色不均匀(图
2)。可能的原因是整染后换自来水冲洗时水质偏酸或冲洗时间控制不当。有研究表明 ,冲洗液偏酸虽易
于分色 ,但导致染色浅 ,若为避免分色而缩短冲洗时间则胚囊中会含有许多染料颗粒 ,即染色不均匀[ 11] 。
对比图 3A与图 1 ,曙红 Y 染色后蓝猪耳胚囊内部重要结构(七细胞八核以及中央细胞中的微管 、微丝)显
示出的对比效果并不突出 。图片效果不佳的原因在于曙红 Y 染色后选用的显微镜不合适。曙红 Y为传
统的吖啶类荧光染料[ 12] ,氨基吖啶能优先和细胞核成分结合 ,在非荧光显微镜下 ,曙红 Y染色后的胚囊观
察结果与不染色基本相同 ,但在荧光显微镜下 ,经曙红 Y染色后的蓝猪耳胚囊应该能够呈现出特有的结
构及极性特征。借助荧光染料和各种荧光显微镜或激光共聚焦显微镜 ,能更好地探讨胚囊超微结构的极
性衍变及其演变机理 。DAPI是一种灵敏度高 、特异性强的 DNA 荧光染料 ,不仅对细胞核和染色体 ,而且
对细胞质 DNA 都有极好的荧光染色效果 ,是一种很有价值的探测 DNA 的指示剂。DAPI与 DNA 复合
物发出的荧光为稳定的浅蓝色 ,适合于显微照相[ 13] 。标记活体植物细胞常用的荧光标记为鬼笔环肽[ 14] ,
它可专一地标记肌动蛋白微丝 ,罗丹明则可标记微管蛋白 ,可用于显示胚囊中的微管结构[ 15] ,细胞骨架主
要是由微管 、微丝 、中间丝和微梁网络组成[ 12] 。对微管 、微丝进行标定则有助于研究胚囊细胞骨架的变
化 ,从而揭示蓝猪耳胚囊超微结构 。
[参考文献]
[ 1]杨弘远 ,周　嫦.植物有性生殖实验研究四十年[ M] .武汉:武汉大学出版社 , 2001. 293.
[ 2]杜　中 ,赵世绪 ,凌祖铭.观察植物胚胎发育的简便方法[ J] .植物杂志, 1996 ,(4):40.
[ 3]刘向东 ,徐是雄 ,卢永根.水稻胚囊壁的形成与发育观察[ J] .植物学报, 1997 , 39(11):985～ 990.
[ 4]胡宝忠 ,李桂琴 ,桂明珠 ,等.杏大小孢子与雌雄配子体发育[ J] .东北农业大学学报 , 1997 , 28(2):179～ 185.
[ 5]Wallw ork M A B , Sedgley M . Early Events in th e Penet ration of th e Em bryo Sac in Torenia fournier i(Lind)[ J] . Annals of Botany ,
2000 , 85:447～ 454.
[ 6]杨鹭生 ,李国平.被子植物胚囊结构的观察方法[ J] .实验室研究与探索, 2004 , 23(2):9～ 11.
[ 7]陈素红 ,扬延红 ,廖景平 ,等.蓝猪耳卵细胞和合子的分离[ J] .植物生理与分子生物学报 , 2005 , 31(4):383～ 388.
[ 8]余炳生 ,张　仪.生物学显微技术[ M] .北京:北京农业大学出版社 , 1989. 32～ 76.
[ 9]周江菊 ,陈良碧 ,龙跃生.双低温敏核不育水稻低温条件下花粉发育的细胞学观察[ J] .生命科学研究 , 2001 , 5(2):160～ 162.
[ 10] 袁　明 ,傅　缨 ,王　凤 ,等.蓝猪耳受精过程中中央细胞和初生胚乳细胞中微丝骨架的组装和细胞核的迁移[ J] . 中国科学(C 辑),
2002 , 32(1):13～ 24.
[ 11] 白　君.蓝猪耳受精过程中胚囊细胞微丝骨架的动态研究[ D] .北京:中国农业大学硕士论文 , 2005. 2～ 14.
[ 12] 赵荣华.爱氏苏木精整体染色制片复杂法的一些改进[ J] .生物学通报, 1994 , 29(4):43.
[ 13] 王春梅 ,黄晓峰 ,杨家骥 ,等.激光扫描共聚焦显微镜技术[ M ] .西安:第四军医大学出版社 , 2004. 181.
[ 14] 朱　澄 ,林辰涛.一种新型 DNA 荧光染料 DAPI 的光学特性及应用[ J] .武汉植物研究 , 1986 ,(4):91～ 102.
[ 15] Vals ter A H , H epler P K. Caf feine inhibit ion of cy tokinesi s:effect on the p hragm oplast cytoskeleton in living Tradescan tia s tamen hair
cel ls[ J] . Protoplasma , 1997 , 106:155～ 166.
69 第 4 卷 第 2 期 李德明等:蓝猪耳胚囊结构观察方法的比较 　
are 98. 9%, 95. 1% and 90. 2%. It indicated that secondary structure and antigenic deter-
minant s exist betw een three st rains type Ⅰ pili and human Escherichia coli (pSH2)
have most similarity.
Key words:Avian Escherichia coli ;human Escher ichia coli ;type Ⅰ pili;Homology
066 Comparison of Observation Techniques of Torenia(Torenia f ournieri Lind.)Embryo Sac
LI De-ming 　 Col lege o f Hort icul tur e an d Gardening ,Y ang tz e Un iver sity , J inzhou , Hubei 434025 , China;Key Labora tory o f B iotechnolog y f or P lant Development , Col lege o f Li fe S cience , South Ch ina
Normal Universi ty , Guang zhou , Guangdong 510631 , China
ZHANGXiu-juan　(Co llege o f Hor ticu lture and Ga rdenin g ,Yang tz e Universi ty , J in zhou , H ubei 434025 , Ch ina)
BINJin-hua 　 Key Laboratory o f Biotech no logy f or Plant Development , Col leg e o f Li fe S cience , Sou th ChinaNorma l Universi ty , Guangzhou , Guangdong 510631 , China
Abstract:Taking different s taining methods and microscopes to study the embryo sac of
torenia , the results showed that Leica DM5000B differential interference cont rast(DIC)
microscope and Leica DM5000B fluorescence microscope are not suitable to observe or
take ultras tructure photo of embry o sac clearly , and that Leica DM RXA microscope can
be merely satisfactory. But the laser scanning confocal microscope(LSCM) is the best
choice. The embryo sac could be observed by ordinary microscope , but the effect w ould
be better if it be s tained. By Ehrlich ’ s hematoxylin staining , the embry o sac can be
stained lightly. Stained by eo sin Y , the inner structure could get appropriate effect by
f luo rescence micro scope. Stained by fluorescence dye , such as DAPI , Alexa 488-phalloi-
din , propidium and rhodamine , the character of embryo sac s tructure could be observed
and photo can be taken clearly by fluorescence microscope or LSCM .
Key words:Torenia f ournieri Lind. ;embryo sac;fluo rescence microscope;laser scanning
confocal micro scope;dye
073 Stimulation Effects of Ion Beam Implantation on Liquorice
ZHANGXiang-sheng 　(Col leg e o f Li fe S ciences ,Yangtze Universi ty , J ingzhou Hubei , 434025 , Ch ina)
Abstract:A series of doses of 30 keV N+ were implanted into liquorice(Glycyrrhiza
uralensis) seeds. The results showed that the germination rate showed “ cradle curve”
characteris tics w ith the inflexion at fluence of 4×1016 ion /cm 2 . Ion implantation had no-
table s timulation effects in shoot height , taproot leng th , lateral root number and total dry
weight of 30-day-old seedlings.
Key words:ion beam implantation;liquo rice (Gly cy rrhiza uralensis);stimulation effects
081 Application of Set Pair Analysis Model in Assessment of Regional Soil Environmental Quality
LI Fan-xiu , MEI Ping 　(Collegeo f Chemical &Environmental Engineer ing ,Yang tze Universi ty , Jingzhou , H ubei 434023, China)
XUE Fa-sheng 　(Qianj iang Environmenta l Moni tor ing S tation o f Hubei P rovince , Qianj iang , H ubei 433100 , Ch ina)
Abstract:A method of evaluating regional soil environmental quality w as presented by
means of set pair analy sis(SPA) method. The model w as used to assess 10 regional ag-
ricultural soil polluting levels of Shanghai suburbs with more satisf acto ry results com-
pared w ith the fuzzy comprehensive method. This model w as perfect. The evaluating re-
sult w as more reasonable and its resolving power was hig her. Thus , a simple and effective
evaluation method was provided for evaluation of regional soil pollution from heavy metals.
Key words:set pair analysis (SPA);soil environmental quality;evaluation model;heavy
metal pollution
084 Distribution Characteristics of Different Types of Nitrogen in Surface Waters of Jingzhou
QIN Qiao-yan　(Co llege o f Ag ronom y , Yangtz e Universi ty , J in gzhou , H ubei 434025 , Ch ina)
JIA Chen-zhong 　(Col leg eo f Chem ist ry an d Environment Eng ineerin g , Y angtz e Universi ty , J ingzhou , H ubei 434023 , Ch ina)
JIN Wei-bin　(Col leg e o f A gronomy , Yang tz e Univer sity , Jing zhou , Hubei 434025 , China)
ZENGLing-jun　(Co llege o f Chemis tr y an d Environment Engineer ing , Y angtz e Universi ty , J in gzhou , H ubei 434023 , Ch ina)
Abstract:The content and dis tribution characteristics of different types of nit rogen were
studied in the surface waters of Jingzhou. The result s showed that the surf ace waters of
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