全 文 ：of test compounds in a h igh2th roughpu t fo rm at.
U sing th is assay, mo re than 4 000 compounds have
been tested in the p rim ary screen ing and ten
compounds show ed po ten t ia l an t i2SA R S
inh ib it ion.
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山茱萸鞣质活性部位对佐剂性关节炎大鼠免疫功能的影响
吕晓东, 杨　胜, 齐春会, 张永祥, 茹祥斌, 周文霞, 吴　禾, 赵毅民Ξ
(军事医学科学院毒物药物研究所, 北京　100850)
摘　要: 目的　研究山茱萸免疫抑制活性部位 (鞣质活性部位, F21C) 对佐剂性关节炎 (AA ) 大鼠免疫功能的影
响。方法　运用淋巴细胞增殖反应、流式细胞技术和酶联免疫吸附试验 (EL ISA ) 观察 F21C 体内和体外对AA 大
鼠免疫功能的影响, 并与环孢素 A (C sA ) 和雷公藤多苷片 (TW ) 进行比较。结果　ig 给予 F21C (30 m gökg) 对
AA 大鼠原发性足肿胀具有明显的治疗作用, 该作用较 TW 强, 较 C sA 弱; F21C 对 AA 大鼠低下的脾细胞增殖反
应具有改善作用; 对亢进的胸腺细胞增殖反应具有抑制作用。F21C 体外对AA 大鼠低下的脾细胞产生 IgG 水平具
有明显的促进作用, 并能抑制亢进的胸腺细胞增殖反应。结论　F21C 能够治疗 AA 大鼠原发足肿胀, 该作用可能
与纠正 AA 大鼠的异常的免疫反应有关。
关键词: 山茱萸; 免疫抑制; 佐剂性关节炎; F21C
中图分类号: R 28515　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 09 1023 04
Effect of tann in from Cornus of f icina lis on imm une function of adjuvan t arthr it is ra ts
LU
　 ¨X iao2dong, YAN G Sheng, Q I Chun2hu i, ZHAN G Yong2x iang, RU X iang2b in,
ZHOU W en2x ia, W U H e, ZHAO Y i2m in
( Inst itu te of Pharm aco logy and Toxico logy, A cadem y of M ilitary M edical Science, Beijing 100850, Ch ina)
Abstract: Object　To study the therapeu t ic effect and the po ssib le m echan ism of F21C, a tann in
fract ion w ith imm uno supp ressive effect iso la ted from Cornus of f icina lis Sieb. et Zucc. , in the trea tm en t of
adjuvan t arth rit is (AA ) ra ts. M ethods　AA rat model w as rep roduced to ob serve the effect on imm une
funct ion bo th in v ivo and in v itro and compare w ith Cyclo spo rine (C sA ) and T rip tery g ium w ilf ord ii
( TW ). T he effect of F21C on jo in t sw elling and the imm une respones of AA rats w ere evaluated by
lymphocyto t ic react ion, f low cytom etry, and EL ISA. Results　F21C by ig adm in ist ra t ion to AA rats
decreased the p rim ary jo in t sw elling of AA rats, st ronger than TW and w eaker than C sA , p romo ted the
decreased sp lenocyte p ro lifera t ion induced by Con A , and inh ib ited the augm en ted thymocyte p ro lifera t ion
induced by Con A in AA rats. T he evaluat ion in v itro show ed the F21C inh ib ited the augm en ted thymocyte
p ro lifera t ion from AA rats and p romo ted the deficien t IgG p roduced by sp lenocyte from AA rats.
Conclusion　F21C has therapeu t ic effect on AA rats and the modu la t ing imm une funct ion is one po ssib le
underlying m echan ism.
Key words: Cornus of f icina lis Sieb. et Zucc. ; imm uno supp ressive; ad juvan t arth rit is (AA ) ; F21C
·3201·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 9 期 2004 年 9 月
收稿日期: 2003212214
基金项目: 国家重点基础研究发展规划项目资助 (G1999054401)
作者简介: 吕晓东 (1966—) , 男, 山东人, 医学硕士, 现为解放军 305 医院药剂科主任, 副主任药师, 主要从事中药复方研究。
T el: (010) 83086947　E2m ail: lxd3052002@yahoo. com. cn
　　类风湿性关节炎 ( rheum ato id arth rit is, RA )
是一类严重危害人类健康的多发性自身免疫性疾
病, 目前临床尚无理想的治疗方法。佐剂性关节炎
(ad juvan t arth rit is, AA ) 大鼠模型是研究 RA 及
评价防治药物的常用动物模型之一, 其病理表现与
RA 有一定的相似之处, 如病变关节肿胀、细胞免疫
功能异常等[1 ]。本研究室发现, 六味地黄汤对AA 大
鼠继发性关节肿胀具有抑制作用, 同时对AA 大鼠
紊乱的细胞免疫反应和体液免疫反应具有调节平衡
或恢复作用[2 ]。为了研究六味地黄汤免疫调节作用
的物质基础, 本研究室通过药理学与植物化学紧密
结合的方法, 在活性评价的导向下对六味地黄汤组
方的君药之一山茱萸 Cornus of f icina lis Sieb. et
Zucc. 的免疫抑制活性成分进行了追踪分离, 最终
获得了以鞣质成分为主的主要活性部位 F21C。初步
免疫药理学研究表明, F21C 对正常小鼠免疫反应具
有明显的抑制作用[3 ]。本实验以AA 大鼠为模型, 进
一步观察 F21C 对 AA 大鼠免疫功能的影响, 并与
目前常用的免疫抑制剂环孢素A (Cyclo spo rin A ,
C sA ) 和雷公藤多苷片 (TW ) 进行比较。
1　材料
111　动物:W istar 大鼠, 二级, 雌性, 体重 160～ 200
g, 购自本院动物中心。
112　药物: 山茱萸, 所用样品为炙萸肉, F12C (含鞣
质 60% ) 制备参见文献[3 ]。C sA 购自瑞士山德士制
药厂, 批号 19990801; TW 购自上海医科大学红旗
制药厂, 批号 990101
113　试剂: 伴刀豆蛋白 A (Con A )、美洲商陆
(PWM )、噻唑蓝 (M T T ) 购自 Sigm a 公司; 卡介苗
购自中国药品生物制品检定所; R PM I21640 培养粉
购自 Gibco 公司; 新生小牛血清 (N CS) 购自本院
放射医学研究所; 3H 2胸腺嘧啶脱氧核苷 (3H 2T dR )
购自中国原子能研究所同位素研究室; 补体, 新鲜豚
鼠血清, - 80 ℃ 保存; 十二烷基磺酸钠 (SD S) , 分
析纯, 购自上海新华化工厂。纯化及辣根过氧化酶标
记兔抗大鼠抗体、兔抗大鼠 IgG 抗体, 购自邦定生
物医学公司。
114　仪器: 二氧化碳培养箱, 本池理化株式会社; 液
体闪烁计数仪,L KB 公司; H itach i 20PR—5 型低温
常速离心机, 日本日立公司; 高速离心机, 本院仪器
厂;M CCö340 型酶标仪, 美国 FLOW 公司。
2　方法
211　AA 大鼠模型的移植建立: 动物随机分为 5
组, 每组 10 只, 除正常对照组外, 其余 4 组按文献
方法[4 ]制备AA 模型: 羊毛脂2石蜡油 (1∶2) 加热,
混匀, 高压灭菌后加入卡介苗 (10 m gömL ) , 配制成
弗氏完全佐剂 (CFA ) , 大鼠右足垫皮内注射, 每只
0105 mL。原发病变表现为致炎侧的关节肿胀, 继发
病变一般于致炎 12～ 14 d 后出现, 表现为非致炎侧
及双前肢的关节肿胀。3 个给药组于造模后第 2 天
分别 ig F21C (30 m gökg, 经实验证明此剂量为最佳
剂量)、ig TW (20 m gökg) 和 ip C sA (5 m gökg) ,
连续 2 周。正常对照组和模型对照组分别 ig 等量生
理盐水。造模后 14 d 取材进行实验。
212　淋巴细胞增殖实验 (3H 2T dR 掺入法)
21211　体内实验: 参见文献方法[5 ]。分别取 211 项
各实验组动物的脾脏及胸腺组织, 制备脾细胞和胸
腺细胞悬液, 调整细胞浓度为 5×106ömL , 取 011
mL 细胞悬液与等体积 R PM I21640 液或 Con A
(终质量浓度为 215 ΛgömL ) 加到 96 孔培养板内,
5% CO 2、37 ℃ 培养箱培养 54 h, 每孔加入 714×
103 Bq 3H 2T dR , 继续培养至 72 h 后用多头细胞收
集仪收集细胞于玻璃纤维滤膜上, 将滤膜于 80 ℃
烘干后用液体闪烁计数仪测 3H 2T dR 掺入值
(cpm )。
21212　体外实验: 使用模型组的脾细胞或胸腺细胞
悬液 (正常对照组除外) , 取 0105 mL 细胞悬液与等
体积 Con A (终质量浓度为 215 ΛgömL ) 加到 96
孔培养板内, 同时分别加入不同质量浓度的 F21C
(10、25、50、100 ΛgömL )。3H 2T dR 掺入值 (cpm ) 检
测方法同 21211 项。
213　脾细胞培养上清液中 IgG 水平的检测
21311　体内实验: 使用 21211 项制备的各组脾细
胞悬液, 细胞浓度为 5×106ömL , 另配制 0108 m gö
mL 的 PWM , 各取 015 mL 加入 48 孔培养板中,
5% CO 2、37 ℃ 条件下培养 5 d, 离心取上清液备用。
用纯化兔抗大鼠 IgG 抗体包被聚苯乙烯板, 依次加
入 0105 mL 脾细胞培养上清液、011 mL 酶标抗体,
反应后加入底物, 在酶联免疫检测仪上于 450 nm
处测每孔吸光度 (A ) 值。
21312　体外实验: 使用模型组的脾细胞悬液 (正常
对照组除外) , 取 015 mL 加入 48 孔培养板中, 同时
分别加入不同质量浓度的 F21C (10、25、50、100ΛgömL ) , 5% CO 2、37 ℃ 条件下培养 5 d, 离心取上
清液备用。 IgG 检测方法同 21311 项。
214　统计学处理: 实验数据均以 x ±s 表示, 组间显
著性检验采用ANOVA 检验。
3　结果
·4201· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 9 期 2004 年 9 月
311　F21C 体内对AA 大鼠免疫功能的影响
31111　F21C 对 AA 大鼠足肿胀的治疗作用: AA
大鼠致敏后, 原发侧 (右后足) 及继发侧足肿胀 (左
后足) 均非常明显。F21C 对原发侧足肿胀具有明显
的治疗作用, 对继发侧足肿胀有减轻趋势, 但无统计
学意义, C sA 对双侧足肿胀均有明显的治疗作用,
TW 对两者的治疗作用均不明显, 见表 1。
表 1　F-1C 对 AA 大鼠足肿胀的治疗作用 (x±s, n= 10)
Table 1　Therapeutic effect of F-1C on jo in t swell ing
of AA rats (x±s, n= 10)
组别
剂量ö(m g·kg- 1) 继发侧 (左足)体积ömL 　 抑制率ö% 原发侧 (右足)体积ömL 抑制率ö%
正常 - 1101±0124 - 1102±0127 -
模型 - 1168±01333 3 - 3101±01533 3 -
F21C 30 1142±0124 1515 2140±0125# # 2013
TW 20 1162±0137 316 2162±0132 1310
C sA 5 1111±0135# # 3319 2128±0130# # 2413
　　与正常组比较: 3 3 P < 0101; 　与模型组比较: # # P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs no rm al group; # # P < 0101 vs model group
31112　F21C 对 AA 大鼠脾细胞增殖反应的影响:
AA 大鼠脾细胞自发增殖反应及 Con A 诱导的脾
细胞增殖反应较正常对照组明显降低, F21C 对 AA
大鼠低下的脾细胞增殖反应具有明显的改善作用,
C sA 对AA 大鼠脾细胞增殖反应的作用与 F21C 相
似, TW 对AA 大鼠 Con A 诱导的脾细胞增殖反应
无明显影响, 但使自发增殖反应进一步降低, 见表 2。
表 2　F-1C 对 AA 大鼠脾细胞增殖反应的影响 (x±s, n= 5)
Table 2　Effect of F-1C on splenocyte prol iferation
of AA rats (x±s, n= 5)
组别
剂量ö(m g·kg- 1) 3H 2T dR 掺入值 (cpm )Con A (- ) Con A (+ )
正常 - 2 133±173 3 665±635
模型 - 1 391±2183 3 2 045±3073 3
F21C 30 1 748±139# 6 003±483# #
TW 20 899±159# # 2 114±616
C sA 5 1 644± 74# # 2 837±606#
　　与对照组比较: 3 3 P < 0101
　　与模型组比较: # P < 0105　# # P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs no rm al group
　　# P < 0105　# # P < 0101 vs model group
31113　F21C 对 AA 大鼠胸腺细胞增殖反应的影
响: 结果表明, AA 大鼠胸腺细胞自发增殖反应及
Con A 诱导的胸腺细胞增殖反应较正常对照组明
显增强, F21C 对其具有明显的抑制作用, C sA 和
TW 使其亢进的胸腺细胞增殖反应进一步增强, 见
表 3。
31114　F21C 对AA 大鼠脾细胞产生 IgG 的影响:
AA 大鼠脾细胞产生抗体 IgG 的水平较正常对照组
降低, F21C 和 C sA 对 IgG 水平无明显影响, TW 则
使低下的抗体 IgG 水平进一步下降, 见表 4。
表 3　F-1C 对 AA 大鼠胸腺细胞增殖
反应的影响 (x±s, n= 4)
Table 3　Effect of F-1C on thymocyte prol iferation
of AA rats (x±s, n= 4)
组别
剂量ö(m g·kg- 1) 3H 2T dR 掺入值 (cpm )Con A (- ) Con A (+ )
正常 - 1 502±280 32 867± 5 339
模型 - 2 088±3073 119 557±14 9033 3
F21C 30 1 641±147# 88 945± 2 487# #
TW 20 1 656±124 152 484± 8 463# #
C sA 5 5 997±749# # 183 002±18 536# #
　　与对照组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101
　　与模型组比较: # P < 0105　# # P < 0101
　　3 P < 0105　3 3 P < 0101 vs no rm al group
　　# P < 0105　# # P < 0101 vs model group
表 4　F-1C 对 AA 大鼠脾细胞培养上清液中
IgG 水平的影响 (x±s, n= 5)
Table 4　Effect of F-1C on IgG in supernatan t of
splencyte culture of AA rats (x±s, n= 5)
组别 剂量ö(m g·kg- 1) A 值 (570 nm )
正常 - 01384±01014
模型 - 01344±010223
F21C 30 01325±01016
TW 20 01303±01005# #
C sA 5 01373±01013
　　与正常组比较: 3 P < 0105; 　与模型组比较: # # P < 0101
　　3 P < 0105 vs no rm al group; 　# # P < 0101 vs model group
312　F21C 体外对AA 大鼠免疫功能的影响
31211　F21C 体外对 Con A 诱导的 AA 大鼠脾细
胞增殖反应的影响: Con A 诱导的AA 大鼠脾细胞
增殖反应较对照组明显降低, F21C 在终质量浓度
50 ΛgömL 时对 Con A 诱导的脾细胞增殖反应具有
明显的改善作用, 见表 5。
31212　F21C 体外对Con A 诱导的AA 大鼠胸腺细
胞增殖反应的影响: Con A 诱导的AA 大鼠胸腺细
胞的增殖反应较正常对照组明显亢进, F21C 在 25～
100 ΛgömL 具有剂量依赖性地抑制作用, 见表 5。
31213　F21C 体外对 AA 大鼠脾细胞培养上清液
中 IgG 水平的影响: AA 大鼠脾细胞产生 IgG 水平
较正常对照组明显降低, F21C 在 50～ 100 ΛgömL
时具有明显的改善作用, 见表 6。
4　讨论
　　本研究结果表明, AA 大鼠致敏后原发侧足肿
胀及继发侧足肿胀均非常明显, Con A 诱导的胸腺
细胞增殖反应明显增强, 脾细胞增殖反应及脾细胞
产生抗体 IgG 水平低下, 表明此AA 大鼠模型发生
·5201·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 9 期 2004 年 9 月
表 5　F-1C 体外对 Con A 诱导的 AA 大鼠脾细胞
及胸腺细胞增殖反应的影响 (x±s)
Table 5　Effect of F-1C in vitro on Con A- induced
splenocyte and thymocyte prol iferation
of AA rats (x±s)
组别
质量浓度ö(Λg·mL - 1) 3H 2T dR 掺入值 (cpm )脾细胞 (n= 3) 胸腺细胞 (n= 4)
正常 - 5 221±643 11 459±3 705
模型 - 3 153±3633 3 99 228±5 0813 3
F21C 10 3 116±423 89 408±6 605
25 3 717±407 53 835±4 382# #
50 6 690±783# # 37 603±1 625# #
100 4 531±860 4 583± 583# #
　　与正常组比较: 3 3 P < 0101; 　与模型组比较: # # P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs no rm al group; 　# # P < 0101 vs model group
表 6　F-1C 体外对 AA 大鼠脾细胞培养上清液中
IgG 水平的影响 (x±s, n= 5)
Table 6　Effect of F-1C in vitro on IgG in splencyte
culture of AA rats (x±s, n= 5)
组别 质量浓度ö(Λg·mL - 1) A 值 (570 nm )
正常 - 11235±01060
模型 - 11002±010573 3
F21C 10 11034±01038
25 11002±01036
50 11224±01013# #
100 11118±01072#
　　与正常组比较: 3 3 P < 0101
　　与模型组比较: # P < 0105　# # P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs no rm al group
　　# P < 0105　# # P < 0101 vs model group
了关节肿胀等病理变化, 并伴有免疫功能异常, 与文
献报道相符[6 ]。给药 2 周后, F21C 对AA 大鼠原发
侧足肿胀具有明显的治疗作用, 对继发侧足肿胀的
治疗作用较弱, C sA 对双侧足肿胀均具有明显的治
疗作用, TW 对二者的治疗作用均不明显。上述结果
表明, 在所观察的剂量条件下 F21C 对 AA 大鼠足
肿胀的治疗作用不如 C sA , 但优于 TW。
进一步观察口服给予 F21C 对AA 大鼠免疫功
能的影响, 结果发现, F21C 可使 AA 大鼠低下的脾
细胞增殖反应得到恢复, 抑制AA 大鼠亢进的胸腺
细胞增殖反应, 对AA 大鼠脾细胞生成 IgG 能力低
下无明显影响; TW 不影响 Con A 诱导的AA 大鼠
脾细胞增殖反应, 但使 AA 大鼠脾细胞低下的自发
增殖反应进一步降低, 使其亢进的胸腺细胞增殖反
应进一步升高, 并进一步降低AA 大鼠低下的脾细
胞产生 IgG 的水平; C sA 也可部分纠正AA 大鼠低
下的脾细胞增殖反应, 但使其亢进的胸腺细胞增殖
反应进一步加剧, 对AA 大鼠脾细胞生成 IgG 的水
平低下无明显影响。由此提示, F21C 对AA 大鼠免
疫功能异常具有双向恢复和调节作用, 而 C sA 和
TW 则为单向免疫抑制作用。
体外应用 F21C 结果表明, F21C 对 AA 大鼠
Con A 诱导的低下的脾细胞增殖反应和亢进的胸
腺细胞增殖反应均具有明显的恢复作用, 与口服给
药观察到的结果一致。当 F21C 终质量浓度为 50～
100 ΛgömL 时可使 AA 大鼠降低的脾细胞产生
IgG 的水平明显升高。上述结果进一步提示, F21C
对紊乱的免疫细胞功能具有恢复平衡或调节作用。
AA 大鼠的炎症肿胀与其紊乱的免疫功能密切
相关[7 ] , 而本研究观察到 F21C 对 AA 大鼠的免疫
功能具有改善和纠正作用, 进而可以减小因炎症反
应而造成的肿胀。因此 F21C 有望开发成免疫抑制
剂, 用于治疗 RA 等自身免疫性疾病。
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