全 文 ：图 1　绿原酸 HPLC 色谱图
F ig. 1　HPLC chromatogram of chlorogen ic ac id
瑚苷含量为 01849% , 总黄酮含量为 01516%。所测
定的 3 种主要次生代谢物桃叶珊瑚苷、绿原酸、总
黄酮的含量, 在原生皮和再生皮中均无显著差异。
通过对 3 株 17 年原生皮与 7 年再生皮的比较
分析认为, 原生皮与再生皮的厚度基本相同; 3 株中
主要次生代谢物 (药用有效成分) 的含量无显著差
异。从而可以认为, 原生皮和再生皮在药理作用方面
基本一致。
原生皮与再生皮的厚度 (总皮和内皮)之所以无
显著差异, 这主要是由于再生皮比原生皮生长迅速
的缘故。研究资料证实, 再生皮的厚度虽然在剥皮后
3 年内都比同株树上的原生皮薄, 但差距在逐年减
少。而且, 与对照 (原生皮) 同样位置的树皮厚度比
较, 再生皮只有在剥皮当年明显比对照薄, 第 2 年
就与对照相似, 第 3 年比对照还厚。可见, 新皮 (再
生皮) 的生长比原生皮快[1～ 3 ]。
所测定的 3 种主要次生代谢物桃叶珊瑚苷、绿
原酸、总黄酮的含量在原生皮和再生皮中均无显著
差异, 这是由于新生皮与原生皮结构基本相同的缘
故[1, 2 ]。虽然新皮 (再生皮) 生长的时间短, 但由于
受伤刺激, 使它生长速度快, 很快就与原生皮相连相
通, 形成了一个整体的营养运输通道, 次生代谢物的
合成积累自然就达到了一致。
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真菌诱导子对长春花愈伤组织中吲哚生物碱积累的影响
张向飞, 张荣涛, 王宁宁, 王　勇, 王淑芳Ξ
(南开大学生命科学学院, 天津　300071)
摘　要: 目的　研究分别来源于镰刀菌 F usarium solan i 和黑曲霉 A sp erg illum nig er 的真菌诱导子 (fungal elici2
to rs) 对长春花愈伤组织中吲哚生物碱积累的影响。方法　用真菌诱导子对长春花愈伤组织进行诱导处理后提取
吲哚总碱, 并用 R P2H PL C 法测定其中阿玛碱和长春质碱含量。结果　两种真菌诱导子对吲哚总碱及其中阿玛碱
和长春质碱的积累均有较明显的正向调节作用, 并且确立了真菌诱导子最佳处理时间。结论　这两种真菌诱导子
对长春花愈伤组织中吲哚生物碱的积累有显著影响。
关键词: 长春花; 真菌诱导子; 阿玛碱; 长春质碱; 愈伤组织
中图分类号: R 28216　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 02 0201 04
Effects of funga l el ic itors on accum ula tion of indole a lka lo ids
in Ca tha ran thus roseus ca ll i
ZHAN G X iang2fei, ZHAN G Rong2tao , W AN G N ing2n ing, W AN G Yong, W AN G Shu2fang
(Co llege of L ife Science, N ankaiU niversity, T ian jin 300071, Ch ina)
·102·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 2 期 2004 年 2 月
Ξ 收稿日期: 2003205212
基金项目: 天津市自然科学基金资助项目 (013609211)
作者简介: 张向飞 (1978—) , 女, 山东淄博人, 现为南开大学植物学专业硕士研究生。T el: (022) 23503714
Abstract: Object　To invest iga te the effects of fungal elicito rs derived from the fungi F usa rium solan i
and A sp erg illum n ig er on the accum u lat ion of indo le a lkalo ids in Ca tha ran thus roseus calli. M ethods　T he
to ta l indo le a lkalo id w as ex tracted after the calli w ere trea ted w ith fungal elicito rs. T hen, the determ ina2
t ion of a jm alicine and catharan th ine w as carried ou t by R P2H PL C. Results　T he tw o fungal elicito rs st im 2
u la te the accum u lat ion no t on ly the to ta l indo le a lkalo id bu t the ajm alicine and catharan th ine. T he op t im al
expo su re t im e of the tw o fungal elicito rs fo r d ifferen t k inds of indo le a lkalo id w as invest iga ted. Conclusion
T he tw o fungal elicito rs have obviou s effect on the accum u lat ion of indo le a lkalo id in C. roseus calli.
Key words: Ca tha ran thus roseus (L. ) G. Don; fungal elicito r; a jm alicine; ca tharan th ine; ca llu s
　　长春花 Ca tha ran thus roseus (L. ) G. Don 是夹
竹桃科长春花属一种重要的药用植物, 它的次生代
谢产物中含有 100 多种吲哚生物碱, 其中多数具有
生物活性。如阿玛碱 (a jm alicine) 可用于治疗高血
压、心律不齐等疾病; 长春碱 (vinb last ine) 和长春
新碱 (vincrist ine) 是目前应用最广泛的天然植物抗
肿瘤药物; 而长春质碱 ( ca tharan th ine )、文多灵
(vindo line) 则是长春碱和长春新碱的合成前体[1 ]。
目前这些药用成分主要从天然植物中获取, 但在植
物中的含量极低, 远远满足不了市场需求。因此利用
长春花的组织培养技术生产吲哚生物碱类药用成分
被认为是一条很有希望的替代途径。这方面工作国
外已取得很大进展, 如加拿大用长春花愈伤细胞生
产阿玛碱已达到中试水平。
近年来, 利用诱导子 (elicito r) 对长春花细胞
培养物进行诱导处理, 刺激吲哚生物碱的产生, 倍受
国内外关注。诱导子种类很多, 包括一些生物多为真
菌诱导子 (fungal elicito r) 或非生物分子[2 ] , 它们能
够通过信号传导途径, 刺激植物发生防御反应, 诱导
特定次生代谢产物形成和积累。真菌诱导子来源于
真菌, 通过所含葡聚寡糖调节次生代谢相关酶活性,
进而影响生物碱的积累。E ilert 等人研究了不同来
源真菌诱导子对长春花愈伤细胞吲哚生物碱含量的
影响, 效果很好[2, 3 ]。本室也曾研究了来源于大丽花
轮枝孢菌 V erticillium d ah liae 的真菌诱导子对长
春花冠瘿细胞吲哚生物碱含量的影响[4 ]。为筛选出
更佳效果的真菌诱导子, 在原有工作的基础上, 进一
步探讨了 Fu s 诱导子 ( Fu s elicito r ) (来源于
F usa rium solan i 的诱导子) 和 A sp 诱导子 (A sp
elicito r ) (来源于 A sp erg illum n ig er 的诱导子) 对
长春花愈伤组织生长及吲哚生物碱积累的影响, 为
以后工业化生产长春花吲哚生物碱类药用有效成分
提供理论和实践依据。
1　材料、仪器与药品
111　材料
11111　长春花愈伤组织的培养: 长春花愈伤组织由
本室选育。将继代 12 次的愈伤组织培养 20 d 后, 由
M S 固体培养基转入含有 50 mL M S 培养液的 250
mL 三角瓶中进行摇床 (80～ 100 röm in) 培养, 接
种量为 115～ 2 gö瓶, 培养液中还含 NAA、2, 42D、
KT 各 1 m göL , 3% 蔗糖, pH 6. 0 (灭菌前) , 26 ℃～
28 ℃ 光培养。
11112　真菌诱导子的制备: 参考 E ilert 方法[2 ] , 将
真菌接种于同上的M S 培养液中, 与愈伤组织在相
同条件下培养 7 d 后, 高压灭菌, 高速匀浆, 定容至
5 mL , 3 000 röm in, 离心 15 m in, 取上清液备用。
112　仪器与药品: L C—4A 高效液相色谱仪; SPD—
2A S 紫外检测仪; A naster 色谱数据工作站。R P2
H PL C 用甲醇为色谱纯, 其他试剂均为分析纯, 水为
去离子水, 长春质碱对照品由上海康爱生物制品有限
公司提供, 阿玛碱对照品为 Sigm a 公司产品。
2　方法
211　愈伤组织生长的测定: 收获悬浮培养的愈伤组
织细胞, 真空抽滤至不滴水后称鲜重 (FW ) ; 然后
80 ℃ 烘至恒重, 称干重 (DW )。
212　吲哚生物碱的提取及含量测定: 按前文[5 ]方法
提取吲哚总碱, 并称质量; 然后将吲哚总碱用甲醇定
容至 1 mL , 过 0122 Λm 滤膜, 再采用 R P2H PL C 对
其中的阿玛碱及长春质碱进行定量分析。色谱条件:
K rom asil OD S C 18 (250 mm ×4. 6 mm , 7 Λm ) 柱;
检测波长 284 nm ; 流动相: 甲醇201005 mo löL
N H 4H 2PO 4 (7∶3, pH 7. 0) ; 流速 110 mL öm in; 柱温
28 ℃; 分析图谱见图 1。长春质碱和阿玛碱的峰面积
与浓度 (0105～ 15 m göL ) 呈线性关系, 回归方程分
别为: Y = 8 560 X - 113. 78, r = 0. 999 2, R SD =
1. 65% ; Y = 8 031. 3 X - 52812, r= 0. 999 3, R SD =
1. 83%。所有数据均为 3 次平行重复测定的结果,
标准偏差不超过 10%。
3　结果与讨论
311　愈伤组织生长及吲哚总碱积累的动态变化: 每
4 天收获一次愈伤组织, 按前述方法称质量, 并测其
吲哚总碱含量, 结果如图 2 所示: 液体培养的愈伤组
·202· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 2 期 2004 年 2 月
12长春质碱　22阿玛碱
12catharan th ine　22ajm alicine
图 1　吲哚生物碱对照品 (A) 及样品 (B) 的色谱图
F ig. 1　Chromatogram of reference substance (A) and
sample (B) of indole a lka lo ids separated
by RP-HPLC
织生长周期较短, 初期生长迟缓, 8 d 左右生长速度
迅速增加, 20 d 达到最大生物产量。在培养的前期
阶段吲哚总碱含量变化不大, 这是因为这段时期愈
伤组织以生长为主, 次生代谢水平较低。16 d 后总
碱含量迅速增加, 24 d 达最大值 58167 m gög DW。
○2鲜重　Ξ 2干重　△2总碱
○2fresh w eigh t　Ξ 2dry w eigh t　△2to tal alkalo id
图 2　愈伤组织生长及吲哚总碱的动态变化
F ig. 2　K inetics of growth and accumulation
of tota l indole a lka lo id in ca ll i
312　真菌诱导子对吲哚生物碱含量的影响: 愈伤组
织培养至 18 d 时, 其培养液中各加入 5 mL 真菌诱
导子, 对照加 5 mL 水, 每隔 2 h 取材一次, 称重, 并
测其吲哚总碱及其中阿玛碱和长春质碱含量。结果
表明: 真菌诱导子对组织生长影响不大, 但吲哚总碱
及其中阿玛碱、长春质碱含量均有较明显的提高, 而
对照组吲哚生物碱含量无多大变化。
31211　真菌诱导子对吲哚总碱含量的影响: 结果如
图 3 所示, 用 A sp 诱导子处理 16 h, 总碱含量达最
大值 7313 m gög DW ; 而用 Fu s 诱导子处理需 22
h, 效果最好, 总碱含量可达 8314 m gög DW , 两种真
菌诱导子均使总碱含量提高了1倍多 , 其中Fu s诱
△2Fus 诱导子　○2对照品　□2A sp 诱导子
△2Fus elicito r　○2reference substance　□2A sp elicito r
图 3　真菌诱导子对吲哚总碱含量的影响
F ig. 3　Effect of fungal el ic itors on tota l
indole a lka lo ids conen t in ca ll i
导子处理效果更好。
31212　真菌诱导子对阿玛碱含量的影响: 结果见图
4, Fu s 诱导子处理 12 h, 阿玛碱含量即达到最大值,
而用 A sp 诱导子处理, 需 16 h 阿玛碱含量才达到
最大值, 与对照相比, 其阿玛碱含量分别增加了 113
和 116 倍。由图 3, 4 可以看出: 经 Fu s 诱导子和
A sp 诱导子诱导处理的长春花愈伤组织中阿玛碱含
量达最大值时, 其吲哚总碱含量仍在继续增加; 而当
总碱含量达最大值时, 阿玛碱已有部分发生转化。
△2Fus 诱导子　○2对照品　□2A sp 诱导子
△2Fus elicito r　○2reference substance　□2A sp elicito r
图 4　真菌诱导子对阿玛碱含量的影响
F ig. 4　Effect of fungal el ic itors on ajmal ic ine con ten t
31213　真菌诱导子对长春质碱含量的影响: 如图 5
所示, Fu s 诱导子对长春质碱的诱导效果较好, 用
Fu s 诱导子处理 16 h, 长春质碱含量可达 01053
m gög DW , 比对照增加了 218 倍; A sp 诱导子处理
22 h, 长春质碱含量也比对照增加了 115 倍。这两种
真菌诱导子对长春质碱的最佳处理时间与对吲哚总
碱的最佳处理时间一致。
　　以上研究结果表明: Fu s 诱导子和A sp 诱导子
·302·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 2 期 2004 年 2 月
△2Fus 诱导子　○2对照品　□2A sp 诱导子
△2Fus elicito r　○2reference substance　□2A sp elicito r
图 5　真菌诱导子对长春质碱含量的影响
F ig. 5　Effect of fungal el ic itors on catharan th ine con ten t
对吲哚总碱及其中阿玛碱、长春质碱的积累均有不
同程度的正向调节作用, 并且不同的真菌诱导子对
不同的吲哚生物碱的最佳处理时间不同。Fu s 诱导
子对长春质碱的诱导效果最好, 最佳处理时间 16
h, 可使其含量比对照增加近 3 倍。有关 Fu s 诱导子
提高长春花愈伤组织中长春质碱含量的研究, 国外
已有报道[6 ] , 但国内尚未见到相关报道。长春质碱不
仅本身具有治疗糖尿病及抗菌、止血的功效, 而且还
是抗癌药物长春碱、长春新碱的合成前体, 因此, 长春
质碱的增产研究具有很高的应用价值。
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盐生肉苁蓉愈伤组织培养与苯乙醇苷类化合物合成的研究
郭志刚, 于金梅, 刘瑞芝, 巨　勇3 , 肖　强Ξ
(清华大学 化工系, 北京　100084)
摘　要: 目的　利用肉苁蓉组织培养技术生产苯乙醇苷类活性成分。方法　研究碳源、生长素和培养条件对细胞中
松果菊苷、洋丁香酚苷 (类叶升麻苷)和 2′2乙酰基洋丁香酚苷 3 种苯乙醇苷类化合物合成的影响。结果　葡萄糖有
利于上述 3 种成分的合成, 62BA 1 m göL 与 IAA 1 m göL 或 62BA 1 m göL 与 2, 42D 2 m göL 的激素配比有利于松
果菊苷和洋丁香酚苷 (类叶升麻苷)的积累。15 ℃ 黑暗和 25 ℃ 光照处理可以促进松果菊苷和洋丁香酚苷 (类叶升
麻苷)的积累。其中 IAA 2 m göL 与 62BA 1 m göL、25 ℃ 黑暗条件下培养时 3 种苯乙醇苷类的总产量达到 1 93717
m göL。盐生肉苁蓉愈伤组织中的主要成分与天然肉苁蓉基本相同, 而且愈伤组织中的松果菊苷、洋丁香酚苷 (类叶
升麻苷)和 2′2乙酰基洋丁香酚苷含量高于天然肉苁蓉。结论　盐生肉苁蓉的愈伤组织或细胞可以代替肉苁蓉生产
苯乙醇苷类活性成分。
关键词: 盐生肉苁蓉; 愈伤组织培养; 苯乙醇苷
中图分类号: R 282113　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 02 0204 04
Stud ies on culture of C is tanche sa lsa ca llus and syn thesis of phenylethano id glycosides
GUO Zh i2gang, YU J in2m ei, L IU R u i2zh i, JU Yong, X IAO Q iang
(D epartm ent of Chem ical Engineering, T singhua U niversity, Beijing 100084, Ch ina)
Key words: C istanche sa la (C. A. M ey. ) Ben th. et Hook. f. ; ca llu s cu ltu re; phenylethano id glyco sides
　　肉苁蓉是一味传统中草药, 具有补肾、益精、强 筋健髓之功效, 主治下部虚损、老年血液枯槁, 也常
·402· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 2 期 2004 年 2 月
Ξ 收稿日期: 2003206220
作者简介: 郭志刚 (1958—) , 男, 内蒙古赤峰市人, 1993 年获日本爱媛大学生物资源生产学博士学位, 现任清华大学化工系副教授, 从事
药用植物细胞工程教学和研究工作。先后在国内外学术杂志和学会上发表论文 50 余篇, 出版书籍 4 册近百万字。获得国家发
明专利 2 项, 公开专利 1 项, 正在申请发明专利 2 项。T el: (010) 62785603　E2m ail: guozh ig@ tsinghua. edu. cn3 本校化学系