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66 中国科学 C 辑 生命科学 2006, 36 (1): 66~75




SCIENCE IN CHINA Ser. C Life Sciences
NO通过水杨酸(SA)或者茉莉酸(JA)信号途径介导
真菌诱导子对粉葛悬浮细胞中葛根素生物合成的
促进作用*
徐茂军①** 董菊芳① 朱睦元②
(① 浙江工商大学生物工程系, 杭州 310035; ② 浙江大学植物生理与生物化学国家重点实验室, 杭州 310012)
摘要 一氧化氮 (NO)是近年来发现对植物细胞次生代谢产物合成具有调控作用的一种新型
信号分子. 为了研究 NO 对植物细胞次生代谢调控的信号转导机理, 考查了在真菌诱导子作用下
粉葛悬浮细胞中 NO, 水杨酸(SA), 茉莉酸(JA)及葛根素含量的变化情况. 试验结果表明, 真菌诱
导子可以诱发粉葛细胞的 NO迸发、SA合成和葛根素含量增加, 但细胞中 JA水平未发生明显变
化. NO猝灭剂 cPITO可以阻断真菌诱导子对粉葛细胞中 SA和葛根素合成的促进作用, 说明 NO
是介导真菌诱导子诱发粉葛细胞中葛根素和 SA 生物合成所必需的上游信号分子. 在缺乏 SA 积
累能力的 NahG转基因粉葛细胞中, 真菌诱导子虽然不能促进 SA 积累 , 但仍然可以诱发 NO
迸发和葛根素生物合成, 并且促进细胞中 JA的合成积累. cPITO可以抑制真菌诱导子对 NahG转
基因粉葛细胞中 JA合成的诱导作用, 说明 JA是作用于 NO下游的信号分子. JA合成抑制剂 IBU
和 NDGA可以抑制外源NO对 NahG转基因粉葛细胞中葛根素生物合成的促进作用, 说明 NO依
赖 JA诱发NahG转基因粉葛细胞中葛根素的生物合成. 外源 SA处理可以显著降低真菌诱导子对
NahG转基因粉葛细胞中 JA合成的促进作用, 并逆转 IBU和 NDGA对 NO和真菌诱导子诱发葛
根素合成的抑制作用, 说明 SA可以抑制细胞中 JA的生物合成; 而且当 JA合成受到抑制时, SA
可以替代 JA 介导 NO 和真菌诱导子对葛根素合成的促进作用. 由于真菌诱导子可以促进野生型
粉葛细胞中SA的生物合成, 我们推测在野生型粉葛细胞中, 真菌诱导子可能通过诱发SA合成积
累抑制了其对细胞中 JA合成的促进作用, NO可能主要通过 SA信号途径介导真菌诱导子对细胞
中葛根素生物合成的促进作用. 而在 SA积累受阻的NahG转基因粉葛细胞中, NO则通过激活 JA

收稿日期: 2005-06-23; 接受日期: 2005-10-08
* 国家自然科学基金项目(批准号: 30572331)和浙江省自然科学基金项目(批准号: 302785)资助
** E-mail: maojunxu@163.com






第 1 期 徐茂军等: NO 通过 SA 或 JA 介导真菌诱导子诱导粉葛细胞中葛根素合成 67



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的生物合成并依赖 JA信号途径介导真菌诱导子促进粉葛细胞中葛根素的生物合成.
关键词 一氧化氮 水杨酸 茉莉酸 真菌诱导子 葛根素
高等植物是植物药的重要来源. 虽然植物是一
种可再生资源, 但是由于受到栽培困难、生长速度
慢、无计划采伐以及近年来对天然植物药需求不断增
加等因素的影响使某些植物药的供需矛盾日益突
出[1]. 以细胞全能性为基础建立起来的植物细胞培养
技术为植物药生产提供了一条新途径. 由于利用植
物细胞培养法生产植物天然活性物质具有不受气候、
病虫害等自然条件的影响, 而且不占用土地, 不消耗
自然资源, 因而被认为是解决植物药生产与天然植
物资源可持续发展之间矛盾的一种新型生物技术 .
在经过多年的研究探索后, 一些天然植物活性产物,
如紫草宁、小孽碱等已可以采用细胞培养法生产[2].
然而, 目前能够利用细胞培养法产业化生产的植物
活性物质的种类和数量都非常有限. 制约细胞培养
法产业化应用的关键问题之一是普遍存在的培养细
胞中次生代谢产物的低产现象. 因此, 进一步深入研
究植物细胞中次生代谢产物合成的高产调控机理具
有重要的理论和实际意义.
由于包括植保素在内的许多次生代谢物质在植
物体内的主要功能之一是提高植物对病原物的抗性,
因此在受到病原物浸染时植物体内的防御性次生物
质的合成显著加强[3]. 诱导子是来源于微生物的一类
化学物质, 具有诱导植物细胞中防卫基因表达、诱发
植物过敏反应和促进植物细胞中特定次生代谢产物
的合成等多种功能[4]. 利用微生物诱导子激活植物细
胞中的次生代谢途径已成为提高植物细胞中目标产
物产量的常用策略之一 [5,6]. 研究表明, 在微生物诱
导子处理下植物细胞可以活化许多与信号转导有关
的生化事件, 如离子跨膜运输、活性氧(ROS)合成、
蛋白质磷酸化和脱磷酸化以及茉莉酸(JA)和水杨酸
(SA)的合成积累等[7~9]. 然而, 目前对真菌诱导子促
进植物细胞中次生代谢产物合成的信号转导等分子
机制尚不十分清楚.
一氧化氮(NO)是近年来发现的一种新型植物信
号分子[10]. 研究表明, NO 在植物体内具有促进种子
萌发及植株根和叶的生长发育以及诱发防御基因活
化和植物细胞过敏性死亡等多种功能 [11~13]. 最近的
一些研究报道表明 NO 可以诱发大豆和烟草细胞中
植保素合成基因的表达[14,15]. 在前期试验中发现, NO
可以诱发长春花等植物细胞中次生代谢产物合成积
累[16]. 最近的研究结果还表明, 以桔青霉(Penicillium
citrinum)细胞壁制备的真菌诱导子可以诱发红豆杉
等植物细胞的 NO 迸发, 而 NO 专一性猝灭剂 cPITO
不仅可以抑制红豆杉等细胞的 NO 迸发, 还能够阻断
真菌诱导子对红豆杉等细胞中次生代谢产物生物合
成的促进作用[17,18]. 这些结果暗示, 在植物细胞中可
能存在着一条由 NO 介导的次生代谢产物合成信号
调控途径. 然而, 目前对 NO 信号途径的组成及其与
其他信号转导途径之间的关系等问题目前尚不清楚.
除了 NO 外, JA 和 SA 也是植物体内的两类常见信号
分子. JA 以及茉莉酸甲酯(MeJA)还是一类常用的促
进植物细胞次生代谢产物合成的化学诱导物[19]. 研
究表明, 在真菌诱导子处理下烟草等植物细胞中的
JA 水平可以快速升高[20]. 真菌诱导子和 JA 衍生物可
以诱发欧芹细胞中苯丙烷代谢基因的表达, JA 生物
合成抑制剂 IBU 和 NDGA 能够阻断真菌诱导子对苯
丙烷合成代谢基因表达的促进作用[21]. 真菌诱导子
还可以诱发长春花细胞中 JA 生物合成和萜类生物碱
合成酶基因的表达, JA 抑制剂能够抑制真菌诱导子
对萜类生物碱合成酶基因表达的促进作用[22]. 在水
稻等植物细胞中也有类似的研究报道 [23,24]. 这些试
验结果表明, JA 是介导真菌诱导子诱发植物细胞中
次生代谢产物合成所必需的信号分子. SA 作为植物
体内对 JA 具有拮抗作用的一种信号分子, 在植物的
抗逆反应及次生代谢调控中也具有十分重要的作
用[25,26].
虽然目前的研究结果表明 NO, SA 以及 JA 均可
参与植物细胞次生代谢产物合成的调控作用, 但是
对 NO, SA 和 JA 在植物细胞次生代谢调控中的相互
关系目前尚不清楚. Durner 等人[15]的试验结果表明






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NO 可以诱发烟草等植物细胞中 SA 合成积累, 而 Xu
等人[16]的试验结果表明, NO 对长春花细胞中生物碱
合成的促进作用可以被 JA 合成抑制剂 IBU 阻断. 这
些试验结果表明植物细胞中 NO, SA 及 JA 之间可能
存在着复杂的相互关系. 本文以野生型粉葛细胞和
缺乏 SA 积累能力的 NahG 转基因粉葛细胞为材料,
系统地探讨了 NO, SA 及 JA 在介导粉葛细胞葛根素
生物合成中的信号转导关系.
1 材料与方法
1.1 粉葛悬浮细胞系
粉葛(Pueraria thomsonii Benth)植株采自浙江天
目山. 粉葛愈伤组织的诱导按下述方法进行: 植株幼
茎经自来水反复冲洗干净后, 用蒸馏水冲洗, 剪成 3
cm 左右的小段, 分别用 75%酒精浸泡 10~20 s 和
0.1% HgCl2 溶液浸泡 10~20 min, 经无菌水浸洗后,
在无菌滤纸上切割成 0.5 cm 左右的小段, 接种于 MS
培养基[27](1×10−5 mmol/L 2,4-D 和 2×10−6 mmol/L BA,
7.5 g/L 琼脂, PH 5.8, 121℃灭菌 15 min)上, 25℃暗培
养. 一周后将诱导的愈伤组织转接到新鲜的 MS 培养
基上, 继代培养 2 个月后, 再转接到 MS 液体培养基
上(2×10−5 mmol/L 2,4-D 和 3×10−6 mmol/L BA), 25℃
转速 120 r/min 下黑暗振荡培养, 每 10 天按 1:15(接
种量 10 mL)的体积转接 1次. 实验所用的粉葛悬浮细
胞已经过 30 次左右的继代培养, 具有稳定的形态特
征和生长速率.
1.2 NahG转基因粉葛悬浮细胞系
细菌 NahG cDNA 由 Gorge M. Mueller 博士
(University of Washington at Seattle)提供, 带有潮霉
素分解酶基因的 pER8 启动子由 Dr. Zuo Jianru (The
Rockefeller University)提供. 将 NahG cDNA 克隆至
pER8的多克隆位点(Xho I/Spe I), 构建 pER8-NahG表
达载体. 采用农杆菌介导法将 pER8-NahG 导入上述
粉葛愈伤细胞. 经选择性培养基(20 μg/L 潮霉素)筛
选和 Southern blotting检测表明 pER8-NahG已经整合
至粉葛细胞染色体中. 按照第 1.1 小节描述的方法构
建转 NahG 基因的粉葛悬浮细胞系.
1.3 桔青霉诱导子的制备
将桔青霉菌丝接种于改良的 PDA 培养基(100.0
g/L 土豆, 20.0 g/L 葡萄糖, 3.0 g/L KH2PO4, 1.5 g/L
MgSO4, 1.0 mg/L VB1), 25℃黑暗下培养, 7 天后取 2
cm3 左右的长满菌丝的培养基置于 PDA 液体培养基
中, 25℃下 150 r/min 黑暗振荡培养, 5 天后过滤取菌
丝, 参照文献[28]的方法制备真菌细胞壁诱导子, 以
葡萄糖为标准, 用蒽酮比色法定糖.
1.4 NO测定
培养细胞中NO浓度测定按文献[29,30]方法进行.
在酸性条件下将 NO 氧化成亚硝酸盐, 利用 Greiss 试
剂(1%对氨基苯磺酸, 0.1%N-萘基-乙二胺, 5%磷酸)
测定所生成的亚硝酸盐含量推算细胞中 NO 浓度. 不
同处理的粉葛悬浮细胞经 0.22 μm 微孔滤膜过滤后,
取 1 mL 滤液加入 1 mL Greiss 振荡混匀, 室温下放置
30 min 后在 550 nm 处测定吸光度值, 根据吸光度值
利用NaNO2标准曲线计算NO的含量. 同时参照文献
[30]描述的血红蛋白分析法测定不同处理的粉葛细胞
悬浮液中 NO 含量.
1.5 JA测定
取 20 g 左右新鲜细胞加入无水甲醇(1 mL·g−1 鲜
重 )于冰浴中研细 . 室温下放置 20 min 后 4℃下
12000× g 离心 15 min, 取上清液真空浓缩后加入 100
μL 甲醇溶解. 提取液中 JA 含量测定参照 Alami 等
人[31]的方法.
1.6 SA测定
细胞中 SA 提取及含量测定参照 Meuwly 和
Metraux[32]的方法进行.
1.7 LOX测定
取 20 g左右新鲜细胞加入 20 mL 50 mmol/L磷酸
钾缓冲液 (pH 7.0, 同时含有 1% polybinylpoly-
pyrrolidone(w/v)和 10 mmol/L mercaptoethanol). 于冰
浴中研细后, 4℃下 12000× g 离心 30 min, 取上清液
参照 Fournier 等人[33]的方法测定 LOX 活性. 提取液
中蛋白质含量参照 Bradford [34]报道的方法测定.






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1.8 葛根素含量测定
不同处理的粉葛细胞经 55℃真空干燥后研细,
加入无水甲醇(10 mL/g), 室温下提取 40 min, 10000×
g 离心 10 min. 提取液中葛根素含量参照文献[35]的
方法测定.
2 结果
2.1 真菌诱导子诱发粉葛悬浮细胞 NO迸发、SA
积累和葛根素合成
NO 迸发是红豆杉等植物细胞在真菌诱导子处理
下出现的早期反应之一[17,18]. 本文的试验结果表明,
以桔青霉细胞壁制备的真菌诱导子不仅可以诱发粉
葛细胞中的 NO 迸发, 同时还可以促进细胞中 SA 和
葛根素含量增加. 如图 1 所示, 细胞中 NO 含量在真
菌诱导子处理后迅速开始增加, 并在 5 h 左右时达到
最高; SA 含量开始增加以及达到最高峰的时间均晚
于 NO, 在真菌诱导子处理 7 h 后开始增加, 并在 14 h
左右时达到最高; 葛根素含量增加是粉葛细胞在真
菌诱导子处理下最晚出现的反应, 在处理 10 h 后才
开始增加.

图 1 真菌诱导子对粉葛悬浮细胞的 NO, SA, JA 和葛根素
含量的影响
试验材料为 4天龄的细胞. 诱导子浓度为 60 (μg glc equ)/mL, 所示数
值为 4 次实验的平均值( SEX + )
2.2 真菌诱导子诱发粉葛细胞中 SA和葛根素合
成积累对 NO的依赖性
由于真菌诱导子能够诱发粉葛细胞的 NO 迸发,
以及 SA 和葛根素的合成积累, 而且从时间顺序上看,
SA 和葛根素的合成积累晚于 NO 迸发(图 1), 因而促
使我们进一步深入探讨 SA 及葛根素合成积累和 NO
迸发之间的关系 . cPITO(2-4-carboxyphenyl-4,4,5,5-
tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide)是一种 NO 专
一性猝灭剂, 被广泛应用于动、植物细胞中 NO 的淬
灭实验[15,18]. 本文试验结果表明, cPITO 能够有效地
去除粉葛细胞中的 NO(图 2). PBITU 是哺乳动物一氧
化氮合酶(NOS)的一种专一性抑制剂 . 图 2 表明 ,
PBITU 对真菌诱导子诱发粉葛细胞中 NO 合成也具
有明显的抑制作用. 为了研究真菌诱导子处理下粉
葛细胞中 SA 积累、葛根素合成及 NO 迸发之间的关
系, 我们测定了 cPITO 和 PBITU 对真菌诱导子诱发
粉葛细胞中 SA 积累及葛根素合成的影响. 在对粉葛
细胞进行真菌诱导子处理前 20 min 分别加入 cPITO
和 PBITU. 试验结果显示 cPITO 和 PBITU 处理可以
显著降低真菌诱导子对粉葛细胞中 SA 和葛根素合成
的促进作用(图 3), 表明 NO 抑制剂可以阻断真菌诱
导子诱发粉葛细胞中 SA 和葛根素的生物合成. 硝普
钠(SNP)是一种常用的 NO 供体. 试验结果表明 SNP
单独处理也可以引起粉葛细胞中 SA 和葛根素含量显
著增加(图 3), 这说明外源 NO 单独处理也可以诱发
细胞中 SA 和葛根素生物合成. 综上所述, 粉葛细胞
中 SA 和葛根素的生物合成依赖于 NO, 即 NO 是 SA
和葛根素生物合成所必需的上游信号分子. PBITU 对
细胞中SA合成的抑制作用可以被SNP逆转(图 3), 进
一步验证了上述结论.
2.3 真菌诱导子诱发 NahG 转基因粉葛细胞中
NO迸发及葛根素合成积累
试验结果表明, NO迸发和SA合成积累是粉葛细
胞在真菌诱导子作用下出现的两个早期反应, 并且
SA 是位于 NO 下游的信号分子. 为了进一步探讨 NO
是否通过 SA 介导真菌诱导子对粉葛细胞中葛根素合
成的促进作用 , 我们构建了缺乏 SA 积累能力的
NahG 转基因粉葛细胞, 并测定了在真菌诱导子作用
下 NahG 转基因粉葛细胞中 NO 和葛根素的含量(图
4). 有趣的是, 真菌诱导子虽然不能诱发 NahG 转基
因粉葛细胞中 SA 的生物合成, 但是仍然可以诱发细






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图 2 PBITU 和 cPITO 对粉葛细胞中 NO 的抑制作用
试验材料为 4 天龄的细胞, PBITU 和 cPITO 的添加时间为真菌诱导
子和 SNP 处理前 20 min. NO 的测定时间为诱导子处理后 5 h. 所示
数值为 4 次实验的平均值 ( SEX + ). 诱导子浓度为 60 (μg glc
equ)/mL, 对照组细胞加入等体积的水 . A 示诱导子; B 示诱导子
+cPITO(20 mmol/L); C 示诱导子+PBITU(20 mmol/L); D 示 SNP
(5 mmol/L)+cPITO(20 mmol/L); E 示对照


图 3 抑制剂对真菌诱导子和 NO 诱发野生型粉葛细胞中
葛根素及 SA 合成积累的影响
试验材料为 4 天龄的细胞, 各种抑制剂的添加时间为真菌诱导子和
SNP 处理前 20 min. SA 的测定时间为诱导子或 NO 处理后 14 h, 葛
根素的测定时间为诱导子或 NO 处理后 22 h. 所示数值为 4 次实验的
平均值( SEX + ). 诱导子浓度为 60 (μg glc equ)/mL, 对照组细胞加
入等体积的水. A 示诱导子; B 示诱导子+cPITO(20 mmol/L); C 示诱
导子+PBITU(20 mmol/L); D 示 SNP(5 mmol/L); E 示诱导子
+PBITU(20 mmol/L)+SNP(5 mmol/L); F 示对照
胞的NO迸发和葛根素合成积累(图 4), 暗示在NahG
转基因粉葛细胞中真菌诱导子可能通过一条不依赖
SA 的信号途径诱发葛根素的合成.

图 4 真菌诱导子诱发 NahG 粉葛细胞的 NO 迸发, JA 积累
与葛根素生物合成
试验材料为 4 天龄的细胞. 诱导子浓度为 60 (μg glc equ)/mL, 所示数
值为 4 次实验的平均值( SEX + )
2.4 NO和 JA参与真菌诱导子对 NahG转基因粉
葛细胞中葛根素生物合成的促进作用
试验结果表明, 虽然真菌诱导子不能促进 NahG
转基因粉葛细胞中 SA 的合成, 但仍然可以诱发细胞
中 NO 迸发和葛根素的合成, 说明在 NahG 转基因粉
葛细胞中真菌诱导子对葛根素生物合成的促进作用
不依赖于 SA 信号途径. 为了进一步探讨真菌诱导子
诱发NahG转基因粉葛细胞中葛根素生物合成的信号
途径, 我们测定了真菌诱导子处理下 NahG 转基因粉
葛细胞中 JA 含量的变化情况. 试验结果表明, 真菌
诱导子可以诱发 NahG 转基因粉葛细胞中 JA 的合成
积累(图 4). 图 4 同时表明, 真菌诱导子对 NahG 转基
因粉葛细胞中 NO 迸发和 JA 积累的诱发作用均早于
对葛根素合成的促进作用, 因而促使我们进一步探
讨 NO 和 JA 是否是真菌诱导子促进 NahG 转基因粉
葛细胞中葛根素合成所必需的上游信号分子. 为此,
我们分别考查了 NO 和 JA 抑制剂对 NahG 转基因粉
葛细胞中葛根素生物合成的影响 . 试验结果表明 ,
cPITO 和 PBITU 以及 JA 合成抑制剂 IBU 和 NDGA
均可以阻断真菌诱导子对NahG转基因粉葛细胞中葛
根素生物合成的促进作用(图 5 中 B, C, E 和 F); 而外






第 1 期 徐茂军等: NO 通过 SA 或 JA 介导真菌诱导子诱导粉葛细胞中葛根素合成 71



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图 5 抑制剂对 NahG 转基因粉葛细胞中葛根素合成的影响
试验材料为 4 天龄的细胞; 真菌诱导子和 SNP 处理前 20 min 添加各种抑制剂. 葛根素的测定时间为诱导子或 SNP 处理后 20 h. 所示数值为 4 次
实验的平均值. Bar=SE. 诱导子浓度为 60 (μg glc equ)/mL, 对照组细胞加入等体积的水. A 示诱导子; B 示诱导子+cPITO(20 mmol/L); C 示诱导子
+PBITU(20 mmol/L); D 示诱导子+PBITU(20 mmol/L)+SNP(5 mmol/L); E 示诱导子+IBU(0.5 mmol/L); F 示诱导子+NDGA(0.5 mmol/L); G 示诱导子
+IBU(0.5 mmol/L)+MJ(5 μmol/L); H 示诱导子+NDGA(0.5 mmol/L)+MJ(5 μmol/L); I 示 SNP(5 mmol/L); J 示 SNP(5 mmol/L)+IBU(0.5 mmol/L); K 示
SNP(5 mmol/L)+NDGA(0.5 mmol/L); L 示诱导子+IBU(0.5 mmol/L)+SA(15 μmol/L); M 示诱导子+NDGA(0.5 mmol/L)+SA(15 μmol/L); N 示 SNP(5
mmol/L)+IBU(0.5 mmol/L)+SA(15 μmol/L); O 示 SNP(5 mmol/L)+NDGA(0.5 mmol/L)+SA(15 μmol/L); P 示对照

源 NO 和 JA 供体可以分别逆转 NO 和 JA 抑制剂对葛
根素生物合成的抑制作用(图 5 中 D, G 和 H). 该结果
表明, NO 和 JA 是真菌诱导子诱发 NahG 转基因粉葛
细胞中葛根素生物合成所必需的信号分子.
2.5 NahG转基因粉葛细胞中 JA生物合成对 NO
的依赖性
试验结果虽然表明 NO 和 JA 是介导真菌诱导子
诱发NahG转基因粉葛细胞中葛根素生物合成的两个
必需信号分子, 但是对 NO 和 JA 之间的关系尚不清
楚. 为了进一步研究 NO 迸发和 JA 生物合成之间的
关系, 分别考查了 cPITO和 PBITU对NahG转基因粉
葛细胞中 JA 生物合成的影响. 由图 6(a)可见, cPITO
和 PBITU 可以抑制真菌诱导子对 NahG 转基因粉葛
细胞中 JA 生物合成的促进作用, 表明 NahG 转基因
粉葛细胞中 JA 的生物合成依赖于真菌诱导子诱发产
生的 NO, 即 JA 是作用于 NO 下游的一个信号分子.
LOX是植物细胞中 JA合成代谢途径中重要的关
键酶之一[36]. 本文试验结果表明, 真菌诱导子可以显
著提高NahG转基因粉葛细胞中LOX的活性(图 6(b)),
这说明真菌诱导子可以激活 JA 生物合成代谢途径.
有趣的是, 真菌诱导子虽然不能促进野生型粉葛细
胞中 JA 的合成(图 1), 但仍可以诱导细胞中 LOX 活
性提高(图 6(b)). cPITO 和 PBITU 可以抑制真菌诱导
子对粉葛细胞中 LOX活性的诱导作用(图 6(b)), 表明
真菌诱导子对细胞中 JA 生物合成途径的促进作用依
赖于细胞中的 NO.
2.6 NO依赖 JA诱发 NahG粉葛细胞中葛根素的
生物合成
以 SNP 为 NO 供体, 考查了外源 NO 对 NahG 转
基因粉葛细胞中 JA 和葛根素生物合成的影响. 结果
表明, 外源 NO 处理也可以提高 NahG 转基因粉葛细
胞中 JA 含量和 LOX 的活性(图 6)并诱发 NahG 转基
因粉葛细胞中葛根素的合成积累(图 5中 I); JA合成抑
制剂 IBU 和 NDGA 可以抑制 NO 对 NahG 转基因粉
葛细胞中葛根素生物合成的促进作用(图 5 中 J 和 K).
上述试验结果表明, NO 可以激活 NahG 转基因粉葛
细胞中 JA 的生物合成途径并且依赖 JA 诱发细胞中
葛根素的合成.






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图 6 抑制剂对 NahG转基因粉葛细胞中 JA含量(a)和 LOX
活性(b)的影响
试验材料为 4 天龄的细胞; 真菌诱导子和 SNP 处理前 20 min 添加各种
抑制剂. JA 含量和 LOX 活性的测定时间为诱导子或 SNP 处理后 14 h.
所示数值为 4 次实验的平均值. Bar=SE. 诱导子浓度为 60 (μg glc
equ)/mL, 对照组细胞加入等体积的水 . 1 示诱导子; 2 示诱导子+
cPITO(20 mmol/L); 3 示诱导子+PBITU(20 mmol/L); 4 示 SNP(5
mmol/L); 5 示诱导子+cPITO(20 mmol/L)+SNP(5 mmol/L); 6 示诱导子+
PBITU(20 mmol/L)+SNP(5 mmol/L); 7 示 SA(15 μmol/L)+诱导子; 8 示
SA(15 μmol/L); 9 示对照
2.7 SA对 JA合成的抑制作用
图 1 表明真菌诱导子可以诱发野生型粉葛细胞
中 SA的合成积累, 但细胞中 JA水平未出现显著上升.
而在 SA 积累受阻的 NahG 转基因粉葛细胞中, 真菌
诱导子可以显著的提高细胞中 JA 的水平(图 4). 这些
试验结果暗示在粉葛细胞中 SA 和 JA 的生物合成可
能具有某种拮抗关系. 为了研究 SA 对粉葛细胞中 JA
生物合成的影响, 我们考查了外源 SA 对 NahG 转基
因粉葛细胞中 LOX 活性及 JA 含量的影响. 实验结果
表明, 外源 SA 可以显著降低 NahG 转基因粉葛细胞
中 JA 水平(图 6), 这说明 SA 能够抑制粉葛细胞中 JA
的生物合成. 因此,推测真菌诱导子可能通过诱发野
生型粉葛细胞中 SA 的合成积累并抑制了其对细胞中
JA 生物合成的促进作用, 并导致在真菌诱导子处理
下野生型粉葛细胞中 JA 含量保持比较恒定的低水平
而未出现显著上升. 试验中还发现, 外源 SA 虽然可
以抑制 NahG 转基因粉葛细胞中 JA 的合成积累, 但
却不影响细胞中 LOX 活性(图 6(b)), 暗示 SA 可能通
过抑制 JA 生物途径中其他酶的活性降低细胞中 JA
合成水平.
2.8 野生型粉葛细胞中NO信号途径对 JA的部分
依赖作用
第 2.7 小节试验结果虽然表明真菌诱导子可能通
过诱发 SA 的积累抑制野生型粉葛细胞中 JA 的合成,
使野生型粉葛细胞中 JA 的含量未出现大量增加, 但
是图 1 同时表明, 在真菌诱导子处理下野生型粉葛细
胞中 JA 的含量仍然可以保持在约 2 ng/g 的水平(图
1). 由于以前的许多研究报道表明 JA 可以促进植物
细胞中次生代谢产物的合成 [37~39], 而且本文的实验
结果也表明外源 MeJA 可以促进野生型粉葛细胞中
葛根素的合成积累(图 7). 因此, 我们进一步考查了
野生型粉葛细胞中的 JA 在 NO 介导真菌诱导子诱发
葛根素生物合成的信号转导途径中的作用. 结果表
明, JA 合成抑制剂 IBU 和 NDGA 可以部分抑制真菌
诱导子和 SNP 对野生型粉葛细胞中葛根素生物合成
的促进作用(图 7), 这说明真菌诱导子和 NO 对野生
型粉葛细胞中葛根素生物合成的促进作用部分依赖
于 JA. 图 7 同时表明, 真菌诱导子和 NO 对葛根素合
成的促进作用受 IBU 和 NDGA 的抑制作用并不十分
明显, 因此推测在野生型细胞中真菌诱导子可能主
要通过 NO 和 SA 信号途径起作用.
3 讨论
3.1 NO 分别依赖 JA 和 SA 信号转导途径诱发
NahG 转基因粉葛细胞和野生型细胞中葛根素的
合成积累
NO 是近年来发现的一种新型植物信号分子. NO
在植物体内具有多种生物学功能, 在胞外刺激和胞
内反应之间起到重要的桥梁作用[10]. 研究表明, NO
可以参与真菌诱导子对烟草等植物细胞过敏性死亡
和细胞中抗病基因表达的诱发作用[13,15]. 最近的研






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图 7 JA 抑制剂对真菌诱导子和 NO 诱发野生型粉葛细胞
中葛根素合成的影响
试验材料为 4 天龄的细胞, 各种抑制剂的添加时间为真菌诱导子和
SNP处理前 20 min. 葛根素含量的测定时间为诱导子或 SNP处理后 20
h. 所示数值为 4 次实验的平均值. Bar=SE. 诱导子浓度为 60 (μg glc
equ)/mL, SNP 浓度为 5 mmol/L. 对照组细胞加入等体积的水. A 示诱
导子; B示 SNP; C示诱导子+IBU (0.5 mmol/L); D示诱导子+NDGA(0.5
mmol/L); E 示 SNP+IBU(0.5 mmol/L); F 示 SNP+NDGA(0.5 mmol/L); G
示 MeJA(5 μmol/L); H 示对照

究结果表明 NO 是参与真菌诱导子诱发红豆杉等植
物细胞中次生代谢产物合成的必需信号分子 [17,18],
然而目前对 NO 促进植物细胞次生代谢产物合成的
信号转导机制仍不清楚. 本文试验结果表明, 以桔青
霉细胞壁制备的真菌诱导子可以诱发缺乏 SA 积累能
力的 NahG 转基因粉葛细胞的 NO 迸发、葛根素合成
积累并促进 JA 的生物合成. NO 猝灭剂 cPITO 可以抑
制真菌诱导子对细胞中 JA 和葛根素生物合成的促进
作用, 说明 NO 是对 JA 和葛根素生物合成具有调控
作用的上游信号分子. JA 合成抑制剂 IBU 和 NDGA
可以阻断 NO 对粉葛细胞中葛根素合成的促进作用,
说明 NO 依赖 JA 诱发葛根素生物合成. 上述试验结
果表明, 在 NahG 转基因粉葛细胞中 NO 可能通过 JA
信号途径介导了真菌诱导子对粉葛细胞中葛根素合
成的促进作用. 在野生型粉葛细胞中, 真菌诱导子可
以诱发 NO 迸发, SA 合成积累和葛根素含量增加, 但
细胞中 JA的含量未出现显著上升. cPITO可以抑制细
胞中 SA 的合成积累, 说明 SA 是作用于 NO 下游的
信号分子. 外源 SA 单独处理也可以促进野生型粉葛
细胞中葛根素的生物合成. 因此, 我们推测在野生型
粉葛细胞中 NO 可能通过 SA 信号转导途径介导真菌
诱导子对粉葛细胞中葛根素合成的促进作用.
3.2 SA抑制 NO对粉葛细胞中 JA生物合成的促
进作用
以前的研究报道表明, JA 和 SA 单独处理均可以
诱发植物细胞中次生代谢产物的合成积累 [40,41], 且
最近的研究结果表明外源 NO 也可以诱发长春花等
植物细胞中次生代谢产物的合成积累[16,18], 然而, 目
前有关 NO, JA 及 SA 在诱发植物细胞次生代谢产物
合成中相互关系的研究报道还不多见. 本文试验结
果表明, NO处理可以诱发野生型粉葛细胞中 SA含量
的显著增加 , 但不影响细胞中 JA 的水平 , 这与
Durner等人[15,42]在拟南芥中的试验结果一致. 有趣的
是, NO 虽然不能诱发野生型粉葛细胞中 JA 的合成积
累, 但能够显著提高细胞中 LOX 的活性; 在拟南芥
中, NO 可以诱发 LOX2, AOS 和 OPR3 基因的表达水
平, 但不能增加 JA的含量[42], 这些结果暗示NO可能
参与了植物细胞中 JA 生物合成途径的调控作用, 但
是由于受其他因素的影响使 NO 对 JA 生物合成的调
控作用未能发挥出来. 与野生型粉葛细胞不同, NO
处理可以诱发 NahG 转基因粉葛细胞中 JA 水平的显
著增加. 由于 NahG 转基因粉葛细胞缺乏 SA 生物合
成能力, 因此推测 SA 的存在可能是导致 NO 对粉葛
细胞中 JA 生物合成调控作用失效的原因. 为此, 我
们考查了 SA 对 NO 诱发 NahG 转基因粉葛细胞中 JA
合成积累的影响. 试验结果表明, 添加 SA 可以阻断
NO对NahG转基因粉葛细胞中 JA生物合成的促进作
用, 这一结果表明 SA 可能是抑制 NO 对粉葛细胞中
JA 生物合成调控作用的主要因素.
JA 和 SA 是植物防御反应中最常见的两个信号
分子, 有关SA和 JA在诱发植物防御反应时的相互关
系已有报道[43]. 虽然有一些研究报道认为 SA 和 JA
在诱发植物防御反应时具有协同效应, 然而大多数
研究结果表明 SA 和 JA 之间具有拮抗作用[44,45]. SA
对 JA 生物合成的抑制作用已经在许多植物中得到了
证实[46~48], 然而目前对 SA 和 JA 之间相互影响的分
子机理尚不十分了解. 图 6 表明, SA 处理虽然可以抑






74 中国科学 C 辑 生命科学 第 36 卷



SCIENCE IN CHINA Ser. C Life Sciences
制 NahG 转基因粉葛细胞中 JA 的合成积累, 但 JA 生
物合成途径的关键酶 LOX 的活性却不受影响, 说明
SA 不是通过抑制 JA 生物合成过程途径中 LOX 的活
性影响 JA 的生物合成.
3.3 SA和 JA在介导真菌诱导子诱发葛根素生物
合成中的互补性
NO 是参与真菌诱导子诱发红豆杉等植物细胞中
次生代谢产物生物合成所必需的信号分子 [17,18]. 虽
然外源 NO 可以诱发拟南芥中 JA 的生物合成和烟草
细胞中 SA 的合成积累[15,42], 但是目前对 SA 和 JA 是
否作为 NO 的下游信号分子共同参与对真菌诱导子
诱发植物细胞次生代谢产物合成的信号转导作用尚
不清楚. SA 和 JA 在植物抗病反应中的拮抗作用已经
在许多植物中得到了证实[46,47], 图 6 也表明 SA 可以
抑制粉葛细胞中 JA 的合成积累. 然而本文试验结果
同时也表明 SA 和 JA 在介导真菌诱导子对粉葛细胞
中葛根素合成的促进作用方面具有一定的互补性 .
SA和 JA都可以作为 NO的下游信号分子介导真菌诱
导子对粉葛细胞中葛根素合成的促进作用. 当 SA 合
成受阻时, 细胞可以通过合成 JA 并且由 JA 替代 SA
介导粉葛细胞中葛根素生物合成. 而当细胞中 SA 合
成加强时, 粉葛细胞则利用SA对 JA合成的抑制作用
使细胞中SA和 JA的水平处于一种动态平衡状态, 由
此可见 SA 和 JA 在介导真菌诱导子和 NO 诱发粉葛
细胞中葛根素生物合成的过程中具有一定的互补性.
3.4 NOS参与真菌诱导子诱发粉葛细胞 NO迸发
虽然大量的研究表明真菌诱导子可以诱发烟草、
红豆杉等许多植物细胞的 NO 迸发[15,17,18], 然而目前
对真菌子处理下植物细胞中 NO 产生的机理仍不十
分清楚. 研究表明, NOS 是动物细胞中 NO 产生的主
要途径. 虽然到目前为止还没有在植物中发现 NOS
基因, 但是在大豆、烟草等植物细胞中已经检测到了
与动物 NOS 类似的酶活性[49,50]. 图 2 表明, 真菌诱导
子对粉葛细胞中 NO 迸发的诱发作用可以被哺乳动
物 NOS 抑制剂 PBITU 抑制，说明粉葛细胞中可能也
存在着与动物类似的 NOS, 而且该酶参与了真菌诱
导子对细胞中 NO 迸发的诱导作用. 然而, 图 2 同时
也表明 PBITU 处理不能将真菌诱导子处理的粉葛细
胞中 NO 含量降低至对照水平, 暗示 NOS 可能不是
粉葛细胞中 NO 产生的唯一途径.
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