全 文 ：同山药成分的差异 ,它们之间的热效应也互有差别 ;
400℃ 以后失重峰与放热峰位置一致 ,应是山药中
某些成分发生氧化分解而放热 ,但不同山药的最后
一个尖峰位置、峰高差异较大 ,这与其成分、含量有
何关系 ,需进一步探究。
3　结论
由以上结果可以看出 ,不同产地的山药 ,其热分
析谱图体现出相当大的差异。 N2气氛下的 DT A曲
线体现了不同品种间的差异 ,空气气氛下的 DTG、
DTA曲线不仅体现了不同品种间的差异 ,同时也体
现了相同品种因产地不同所造成的差异。 此方法较
为灵敏 ,结果较直观 ,且样品处理很简单。 若用于中
草药鉴别中 ,将对中药质量的规范化起到一定的积
极作用。
致谢: 山药样品由河南省中药研究所陈蕴副研
究员、河南中医学院冯卫生教授、河南中医药研究院
张留记研究员等提供。 部分测试工作由河南大学郑
广水先生完成 ,在此一并致谢。
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and Peking Union Medical Col leg e Uni ted Publi shing House,
1995.
农杆菌介导枳壳转化系统的建立及 PCR鉴定
贺　红 1 ,韩美丽 2 ,李耿光 3⒇
( 1. 广州中医药大学中药学院 ,广东 广州 510405; 2. 广西林业科学研究院 ,广西 南宁 530001; 3. 中国科学院华南植物研究
所 ,广东 广州 510650)
摘　要: 目的　建立农杆菌介导的枳壳转化体系。方法　以枳壳实生苗上胚轴为转化外植体 ,农杆菌 Ti质粒上插
入了外源目的基因—— 柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因 ( C TV-cp) , 转化植株用 GUS (β -葡萄苷酸酶 )染色及 PC R
进行鉴定。结果　枳壳转化试验中 , 20 d苗龄的外植体转化再生率较高 ;外植体与农杆菌共培养时间以 2～ 3 d为
宜 ;乙酰丁香酮能较大提高转化效率 ,转化再生频率为 27. 5%。 转化获得的抗性植株中 , GUS反应呈阳性所占比
例为 70. 0%。 PCR分析证实外源目的基因已整合到枳壳转化株的核基因组中。结论　成功地建立了农杆菌介导
的枳壳转化系统 ,为利用基因工程的手段进行枳壳的抗病育种奠定了基础。
关键词: 农杆菌 ;枳壳 ;遗传转化 ;聚合酶链式反应 ( PCR)
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 02 0171 04
Agrobacter ium-mediated genetic transformation of Poncirus tr ifoliata and PCR analysis
HE Hong
1 , HAN M ei-li
2 , L I Geng-guang
3
( 1. Co lleg e of Chinese Materia Medica, Guang zhou Univ ersity o f TCM , Guang zhou 510405, China;　 2. Guangxi Academ y
o f Fo restr y Science , Nanning 530001, China;　 3. South China Institute o f Bo tany , CAS, Guang zhou 510650, China )
Abstract: Object　 To establish an effectiv e sy stem for Agrobacterium-mediated genetic t ransfo rma-
tion of Poncirus trifol iata Raf. Methods　 The explants used fo r t ransfo rmation were the epicotyls f rom
P . t rifol iata; the Agrobacterium tumefaciens st rain w as EHA101, provided wi th the vecto r plasmid
·171·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 2期 2003年 2月
⒇收稿日期: 2002-04-10基金项目:国家自然科学基金资助课题 ( 39870539)
pGA482GG; the coat pro tein gene ( CTV -cp gene ) was introduced into the t ransfo rmation plasmid. The
t ransforma tion was proved by PCR and histochemical GUS assay. Results　 In trans fo r mation of P . tri-
fol iata , 20 day s epico ty ls w ere suitable fo r t ransfo rmation. Shoo t regenera tion f requency w as high when
cocul tiv ation time w as 2— 3 days. The presence of aceto sy ringone during cocultiva tion could enhance the
ef ficiency of t ransfo rmation. Histochemical GUS assay show ed that 70. 0% o f the resistant plants w ere
GUS-posi tiv e. Ex tra g ene w as proved to be t ransfo rmed into P. trifoliata plant by PCR analysis. Conclu-
sion　 An ef fective genetic transforma tion sy stem has been established fo r P . t ri fol iata. This system w ill be
useful fo r resistant breeding o f P. tri foliata.
Key words: Agrobacterium ; Poncirus trifoliata Raf; g enetic t ransfo rmation; PCR
　　枳壳 Poncirus trifol iata Raf. 为芸香科植物 ,
其幼果及成熟果实入药。目前枳壳生产中面临一种
由病毒引起的衰退病 ,由桔蚜和棉蚜传播。常见的防
治措施为烧毁病株、喷洒农药杀虫以切断传染源 ,但
均不能从根本上解决问题 ,解决这一问题的根本途
径是抗病新品种的选育。遗传转化技术是近年来兴
起的一项新型生物育种技术 ,自问世以来 ,就以其严
格的定向性、高效性受到育种工作者的欢迎。常用的
遗传转化方法主要有生物法、物理法、化学法。 在这
3种方法中 ,以农杆菌介导的转化方法应用最为广
泛 ,所取得的转基因植株最多 [1 ]。本研究以农杆菌为
载体 ,衰退病病毒外壳蛋白基因为目的基因 ,建立了
一套根癌农杆菌介导的外源基因转入的方法 ,并探
讨了各种因素对转化体系的影响。
1　材料与方法
1. 1　植物材料: 枳壳种子经表面消毒培养无菌苗 ,
当苗长至 20 d时 ,剪取上胚轴 ,切成约 1 cm长的小
段 ,用作转化的外植体。
1. 2　离体再生培养:诱导芽分化的培养基: M T+
BA ( 6-苄氨基嘌呤 ) 1 mg /L; 生根培养基: M T+
N AA (萘乙酸 ) 0. 5～ 1 mg /L[2 ]。
1. 3　细菌菌株与质粒: 农杆菌菌株为 EHA101, 含
有质粒载体 pGA482GG, 质粒上插入 35S启动子
驱动的外源基因: C TV-cp (柑桔衰退病病毒外壳蛋
白基因 )及 GUS (β-葡萄苷酸酶 )、 N PTⅡ (新霉素
磷酸转移酶 )基因。农杆菌划线培养在含有 50 mg /
L卡那霉素的 Y EP培养基上 , 28℃ 黑暗培养 ,待
长出菌落后 ,挑取单菌落接于 YEP液体培养基中 ,
28℃ 振荡 20～ 25 h,达到菌对数生长期 ,培养物即
可用于感染。
1. 4　外植体的转化: 枳壳上胚轴切段预培养 2 d
后 ,浸入到准备好的菌液中 20 min,随后转到无菌
滤纸上吸掉多余的菌液 ,将外植体接种于不含卡那
霉素 ( Kanamycin, Km )及头孢霉素 ( Cefo taxime,
Cx )的 MT培养基上共培养 3 d后 ,再转到选择培
养基 (即诱导芽分化培养基+ Km 50 mg /L+ Cx
300 mg /L)上 [3 ] ,诱导抗性芽的产生。
1. 5　组织化学法检测 GUS基因表达活性: GUS
组织化学染色法参见文献 [4 ]。
1. 6　植物 DNA及质粒 DNA提取:分别采用 SDS
法、碱裂解法 [ 5]。
1. 7　 PCR扩增条件:反应采用 25μL反应体系。反
应体系中含: 20 ng植物 DNA, dN TP 200μmol /L,
Primer 1, Primer 2各 0. 1μmo l /L, TaqDN A合成
酶 1单位 , 10× PCR缓冲液 2. 5μL (含 15 mmol /L
Mg Cl2 )。反应程序为:样品 DNA先在 94℃下变性
6 min,然后经过 94℃ 1 min, 56℃ 1 min, 72℃ 1
min 30 s共 35个循环 ,最后 72℃延伸 8 min。扩增
产物在 1. 2%琼脂糖凝胶上电泳 ,并在紫外透射仪
上分析结果。 引物 Primer 1, Primer 2分别来自
CTV-cp序列的 130～ 149 bp及 650～ 669 bp基因
片段。扩增片段预计长度 539 bp。
每处理有培养瓶 6瓶 ,每瓶约接种 17个外植
体。 转化再生频率为每处理中产生绿芽外植体数占
外植体总数的百分比。多处理的多重比较采用新复
极差测验 ,显著水平 0. 05。
2　结果与分析
2. 1　根癌农杆菌感染和抗性植株再生:枳壳上胚轴
切段与农杆菌共培养 3 d后 ,转至选择培养基中进
行培养 ,出芽过程大大延缓 , 1个多月后才可看到抗
性芽的产生 (图 1)。随后 ,每过两周更换一次培养
基 ,随着选择次数增加 ,部分再生芽变白、死亡。待芽
长至 2 cm左右 ,从外植体上切下诱导生根 ,生根培
养基为 M T+ NAA 1 mg /L。
2. 2　 GU S基因表达检测: 转化处理获得的抗性植
株生长 5个月后 ,进行 GU S基因表达活性检测 ,结
果表明 ,没有经转化处理的对照无 GU S阳性反应 ,
转化处理获得的抗性植株检测 , 70. 0% 的植株茎段
·172· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 2期 2003年 2月
图 1　在选择培养基上获得抗性芽
Fig. 1　 Putatively transformed shoots on selection medium
染色结果呈阳性 ,叶片 GUS染色结果 ,大多数呈阳
性反应 ,说明大多数植株已有稳定的 GUS基因表
达 ,也有些植株可能是嵌合的转化体。
2. 3　转化体的 PCR鉴定: 从所得的 GU S阳性无
性系材料中随机选取 7个无性系的 DNA样品作为
模板 ,进行体外扩增 ,结果见图 2。
1～ 7-转化植株　 8-对照　 9-质粒　 10-标准相对分子质量
1— 7-t ransformed plan t　 8-non-t rans form ed cont rol plant
9-plasmid　 10-DN A marker
图 2　 CTV-cp序列的 PCR扩增产物
Fig. 2　 PCR analysis of CTV-cp sequence
从图 2可看出 , 7个枳壳 GUS阳性无性系与质
粒的 DNA样品在所扩增条件下 ,均在预期的 539
bp位点扩增出一条可分辩的 DNA迁移带 ,对照则
无。不同无性系之间扩增带强度有所不同 ,反应出不
同材料模板 DNA量的差异。 由此可基本确定所测
GUS阳性无性系为转基因无性系。
2. 4　外植体年龄对转化的影响:取枳壳萌发至 20,
30, 40 d的上胚轴为材料 ,研究外植体年龄对转化
效率的影响。 3种苗龄的对照外植体 (即未感染 )在
选择培养基上均未出芽 (未列入表内 ) , 感染处理
结果见表 1。苗龄为 20 d时 ,转化再生频率最高 ,为
15. 5% ,随着苗龄增加 ,转化率下降 , 30和 40 d时 ,
分别为 11. 0%和 5. 9% 。说明低苗龄的外植体对农
杆菌更为敏感。
表 1　外植体年龄对转化效率的影响
Table 1　 Effect of explant age on transformed ef ficiency
外植体年龄 /d 转化再生频率 /%
20 15. 5± 1. 50 c
30 11. 0± 1. 32 b
40 5. 9± 1. 85 a
　　注:有相同字母者表示在 0. 05显著水平上差异不显著。
　　 Note: Th e t reatments wi th same letter indicate no evid ent di-
f ference, w hi le the signifi cance is 0. 05.
2. 5　共培养时间对转化的影响:枳壳外植体预培养
2 d后 ,与农杆菌共培养不同时间 ( 1～ 4 d)后 ,取部
分外植体小块检测 GUS基因的瞬时表达活性 ,其
余转入选择培养基 , 1. 5个月后测定其转化再生频
率。 结果表明:共培养 1 d时 , GUS表达频率中等 ,
转化再生频率为 9. 6% , 2, 3 d时 , GU S表达频率及
转化再生频率均表现较高 , 4 d时 ,转化效率有所下
降 ,同时还可观察到 ,共培养 4 d时 ,培养基上形成
菌斑 ,难以除去。因此共培养时间以 2～ 3 d为宜。
表 2　共培养时间对转化效率的影响
　　 Table 2　 Ef fect of cocult ivat ion t ime on transformed
ef ficiency
共培养天数 /d GU S基因瞬时表达 转化再生频率 /%
1 　　　 9. 6± 1. 97 a
2 18. 2± 2. 42 bc
3 20. 1± 2. 15 c
4 14. 6± 2. 08 b
　　注: 表示 GU S基因瞬时表达强 ; 表示 GU S基因瞬时表达
中等 ;有相同字母者表示在 0. 05显著水平上差异不显著。
　　 Note: indicates a s t rong t ransien t expression of GU S gene;
indicates a medium tran sient expression of GUS g ene; th e t reat-
ments wi th s am e let ter indicate no evid ent di ff erence, whi le the sig-
nif icance is 0. 05.
2. 6　乙酰丁香酮对转化的影响:取 20 d苗龄的枳
壳上胚轴 ,设 3种处理:对照 (未感染 )、感染但未加
As (乙酰丁香酮 )、 感染并加入 100μmol /L As。在
选择培养基上观察的结果表明:对照无芽形成 ,而经
农杆菌感染的外植体 , 1个月后 ,部分开始出芽 ,无
As时转化再生频率为 18. 5% , 加入 As转化率有
较大提高 ,为 27. 5%。说明乙酰丁香酮可提高农杆
菌的转化效率。
3　讨论
在植物的遗传转化中 ,经常用 GU S基因作为
报告基因。组织化学法检测 GUS基因表达活性的
原理是: GU S组织化学分析中最常用的底物是 X-
Gluc( 5-bromo-4-cho lro-3-indo lylg lucuronide, 5-溴-
4-氯 -3-吲哚糖醛酸 )。在 GU S活性作用下 , X-Gluc
·173·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 2期 2003年 2月
产生蓝色沉淀 ,一种不可溶的 5, 5′-二溴 , 4, 4′-二氯
靛蓝染料。这种染料不是 GUS直接作用的结果 ,而
是 GU S水解 X-Gluc产生无色吲哚衍生物发生氧
化二聚作用形成。只有在有 GU S基因表达的植物
组织中 ,才有阳性反应。本试验通过对生长 5个月的
抗性植株进行 GU S基因表达活性检测 ,可以初步
说明 GU S基因导入情况。
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广藿香药用部位成熟结构及有效成分分布研究
冯承浩 ,姚　辉 ,吴　鸿* ,赵　晟 ,孙同兴⒇
(华南农业大学生命科学学院 药用植物研究中心 ,广东 广州 510642)
摘　要: 目的　揭示广藿香根、茎和叶的成熟结构及挥发油在其内的分布部位 ,为合理的评价和采收该药用植物提
供科学的理论依据。方法　石蜡切片法、半薄切片法、组织化学法。结果　在根的成熟结构中 ,挥发油主要分布在木
薄壁组织细胞中 ;在茎中 ,主要分布在皮层和韧皮部薄壁细胞中 ;在叶中 ,主要分布在叶肉组织和叶脉的韧皮部薄
壁细胞中。 结论　广藿香全草均含挥发油 ;另外 ,根内木质部的粗度、茎皮和叶片的厚度可作为评价广藿香品种优
良的 3个指标。
关键词: 广藿香 ;成熟结构 ;有效成分
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 02 0174 03
Studies on mature structures and distribution of active constituent of Pogostemon cablin
FEN G Cheng-hao, YAO Hui , WU Hong , ZHAO Sheng, SUN Tong-xing
( Resea rch Center o f Medicina l Plant Development, Co llege o f Life Science,
South China Ag ricultura l Univ ersity, Guang zhou 510642, China)
Abstract: Object　 To find out the mature medical pa rt structures and the distribution o f essential oi l
o f Pogostemon cabl in ( Blanco ) Benth. and provide thoretical basis fo r reasonably evaluating and ha rv esting
this medicinal plant. Methods　 Pa raf fin method, semi-thin sectioning , histochemical method w ere used.
Results　 In the mature st ructures o f P. cablin the essential oil w as mainly sto red in xylem parenchyma cells
in roo t, in phloem and co rtex parenchyma cel ls in stem, and in tissue cells and phloem parenchyma cells in
leaf. Conclusion　 The who le herb o f P . cabl in contains essential oil. The thickness o f roo t x y lem , the
stem skin and mesophyll tissue may be used as three indexes to evalua te P. cabl in.
Key words: Pogostemon cablin ( Blanco) Benth; mature st ructure; activ e consti tuent
　　广藿香 Pogostemon cablin ( Blanco. ) Benth.
为唇形科刺蕊草属植物 ,是常用的芳香化湿中药 ,传
统以其地上部分入药 ,有效成分为挥发油 [ 1] ,有芳香
化湿、开胃止呕、发表解暑之功效 ,是著名成药“藿香
正气丸 (水 )” 的“君”药。被历代医家视为暑湿时令
之要药 ,在临床上应用广泛。 广藿香原产菲律宾 [2 ] ,
·174· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 2期 2003年 2月
⒇收稿日期: 2002-09-11基金项目:广东省中医药管理局基金项目 ( F01032) ;广东省科技攻关项目 ( C20147)作者简介:冯承浩 ( 1973- ) ,男 ,山东省泰安市人 ,华南农业大学在读硕士研究生 ,主要从事药用植物方面的研究。
Tel: ( 020) 85280193　 E-mai l: fchenghao@ 163. com
* 通讯作者