全 文 ：·1850· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
小白菊内酯对人肝癌BEL一7402细胞p53蛋白和
增殖细胞核抗原表达的影响
张雯，宋晓凯。
(天津理工大学生物与化学工程学院，天津300191)
小自菊内酯(parthenolide)为一种西方传统药
物，是从艾叶菊属的短舌匹菊(小白菊)Pyrethrum
Parthenium(L．)Smith中提取的化学成分
(c，。H⋯O)，主要用于治疗皮肤感染、风湿病和偏头
痛=1]。小白菊内酯以时间依赖关系抑制c—fos和C
myc蛋白表达，但不影响p15、p16、p18、p19蛋白表
达，以剂量依赖关系使血管平滑肌细胞(VSMC)周
期中的G。／G。期细胞比例明显增多，s期细胞比例
显著减少，同时抑制VSMC的[3H]TdR掺人口]；前
期研究表明小白菊内酯抑制人肝癌细胞BEL一7402
细胞增殖，并诱导其凋亡口]。本研究以BEL一7402细
胞为靶细胞，研究小白菊内酯对其p53蛋白和增殖
细胞核抗原(PCNA)表达的影响，探讨其抑制细胞
增殖的机制。
1材料与方法
1．1 药品与主要试剂：小白菊内酯(质量分数>
99％)，购自上海康成生物工程有限公司，用三蒸水
配制成10．0pg／#I。储存液；环磷酰胺购自江苏恒
瑞医药股份有限公司。MTT，250mg，Sigma分装；
RPMI一1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自
中国科学院血液病研究所；DAB显色试剂盒、Sp试
剂盒、小鼠p53单抗、PCNA单抗购自北京中山生
物技术有限公司。
1．2 主要设备：倒置式生物显微镜(Nikon
ECLIPSETE300)；5％二氧化碳培养箱(Thermo
FormaMODEI。3111)；自动酶标读数仪(TACAN
SPECTRAⅡ)。
1．3 细胞株及细胞培养：人肝癌细胞株BEI。一7402
由北京医科大学实验中心细胞库提供。用RPMI—
I640培养液(fi-15％胎牛血清)，在37℃、5％CO。
孵箱中常规培养。取对数生长期的细胞用于实验。
1．4 MTT比色法。1测定细胞增殖抑制率：将对数
生长期的肝癌细胞制成1×105／mI．的细胞悬液，接
种于96孔培养板内，每孔200．0pL，于37℃、5％
CO。、饱和湿度的培养箱中培养，待细胞生长至一定
浓度后换上含有不同质量浓度药物的培养液，各设
6个复孔，对照组不加药，继续培养蚰h，加入
0．5％MTT(5．0mg／mL)，每孔20．0pI。，孵育4
h，再加入DMso100．0pL，轻微振荡使紫蓝色沉淀
溶解，用酶标仪测定492nrll波长吸光度(A)值，计
算细胞增殖抑制率。
抑制率；(1A**／Aw月)×100％
1．5免疫组织化学法“3检测p53表达：细胞接种于
12孔板，加药(小白菊内酯7．5、15pg／mL)培养
48h，无水乙醇固定10rain；PBS缓冲液洗涤5
rain，共3次；3％H：O。内源性过氧化物酶阻断剂室
温孵育30min；PBS洗涤5rain，共3次；正常羊血
清室温孵育30min；一抗4℃孵育过夜；PBS洗涤
5rain，共3次；生物素标记的二抗37℃孵育30
min；PBS洗涤5rain，共3次；链菌素亲生物蛋白一
过氧化物酶37℃孵育30min；DAB显色35rain，
苏木素复染核。高倍镜下每张选4个视野观察。
1．6 PCNA表达检测：细胞培养与免疫组化染色步
骤同1．5，其中一抗为PCNA单抗，其余操作相同。
1．7免疫组化结果的观察方法：PCNA或p53蛋
白表达阳性，均呈现为细胞核的棕黄染色(可伴有
或不伴有胞浆染色)。参照Carcangiu的方法01，把
细胞阳性染色的程度分为强(+++)、中(++)、
弱(+)和阴性()4级。其中还可根据阳性细胞
的比例分为：“+++”级——阳性细胞占60％以
上，通常阳性细胞呈片块状分布，为棕黄色染色；
“++”级——阳性细胞在60％～20％，阳性细胞多
呈局灶性或小巢状分布，呈黄色染色；“+”级——阳
性细胞在20％以下，阳性细胞一般分散存在，为淡
黄色染色及“ ”——阳性细胞在5％以下，偶见单
个阳性细胞，呈浅黄色。
鉴銎最智：契落需名臻科学基金资助项目(。336。7611)，天津市高校科技发展基金资助项目(200lYYl5)
尊翥蕞稆擎磊瓦hT女e’t于薏雳^态差裟3缎E-应ma用il咒煮砉裂簧；{；!!襄怠j：一‘唑：：磊努譬k；尝j79@“3’。“
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 851·
1．8统计学处理：计量资料用z±s表示，两组间比
较采用t检验；阳性率的显著性检验采用驴检验。
2结果
2．1 MTT法检测小白菊内酯对人肝癌细胞增殖
的抑制作用：不同质量浓度小白菊内酯作用细胞后，
细胞生长受到不同程度的抑制，且抑制作用随小白
菊内酯质量浓度的升高而增强，见表1。
表1小白菊内碡对BEL一7402细胞增殖的作用“一6)
Table1 InhibitionofparthenolldeolEEL一7402
cellproliferation(n=6)
2．2 小白菊内酯对肝癌细胞p53蛋白表达的影
响：见表2。小白菊内酯(7．5、15p．g／mL)可促进
p53蛋白表达，与对照组比较差异非常显著(P<
0．01)，且小白菊内酯两个剂量组间比较差异非常显
著(尸<0．01)。环磷酰胺(16．7mg／mL)组与对照
组比较差异显著(P／～0．05)。
衰2小白菊内酯对BEL一7402细胞p53蛋白裹达的影响
Table2 Effectofparthenolideonp53protein
expressionofEEL一7402cell
2．3小白菊内酯对肝癌细胞PCNA蛋白表达的影
响：小白菊内酯可抑制PCNA蛋白的表达，小白菊
内酯7．5和15lag／mI．组间差异显著(P
(尸
Table3 EffectofparthenolideoHPCNAexpression
ofBEL一7402cell
3讨论
本实验中MTT检测可见小白菊内酯能明显抑
制BEI．一7402细胞增殖，并呈量效关系。
p53基因是一种抑癌基因，定位在人第17号染
色体短臂(17q13)上。编码为一个由357个氨基酸
组成的、相对分子质量为5．3×104的核酸蛋白[⋯。
p53基因分野生型和突变型两种。正常细胞内的
p53基因为野生型，具有抑癌功能，但其表达的蛋白
在细胞内的量很小。当p53基因发生突变时，其产
物p53蛋白构象发生改变后稳定性明显提高，能与
一些癌蛋白形成稳定的复合物，其半衰期大大延长，
免疫组织化学方法能够检测到o]，因而用免疫组织
化学方法检测到的是突变型的p53蛋白。突变型的
p53蛋白不但丧失抑癌活性，而且具有恶性的转化
功能口]，所以越来越引起人们的重视。然而也有报道
称某些突变型p53可抑制细胞生长，促进细胞凋
亡口““。本实验发现经小白菊内酯处理后，BEL一
7402细胞p53表达不但没有减弱，反而显著增强。
PCNA是一种相对分子质量为3．6×104的酸
性核蛋白，是DNA多聚酶的辅助蛋白，起调节
DNA多聚酶8活性的作用，PCNA随细胞增殖周期
的不同而变化。它在G，后期开始增加，S期达高峰。
PCNA参与DNA合成，而DNA合成又是细胞分
裂增殖的必要条件o⋯。
本实验结果表明小白菊内酯对人肝癌BEL一
7402细胞的增殖具有抑制作用，其机制可能与促进
p53蛋白表达和抑制PCNA蛋白表达有关。
致谢：本实验得到了天津中医学院中心实验室
及范英昌等老师的大力协助。
Referenees：
[1]HeinrichM，RoblesM，WestJE，et口z．Ethn。ph哪ac01。gy
ofMexicanAsteraeease(CA3mgosltae)口]．AnnuR删Ph r～
macolToxicol，1998，38(6)：539—565．
[2]WengSX，ShahJ，LinXX，eta1．Studiesontheeffectof
parthenolideontheproliferationofratvascularsmoothmus—
clecellsandthemechanism口]．China．，ChinMaterMed
(中国中药杂志)，2003·28(7)：647-649．
[3]SongxK，ZhangW．Experimentalstudyonparthenolidein—
dueinghumanhepatocellularearcinomacellineBEL一7402
apoptosis[J]．ChinTraditHerbDrugs(中草药)，2005，36
(11)：1691—1693
[4]WangRQ，ZhouZC，YangJM，eta1．Expressjonofras，
c—myc”erbB一2andp53proteinshepatocellularcarcinoma
tissues[J]．ChinJClinExpPathol(1临床与实验病理学杂
志)，1997，13(1){4-6
[5]CareangiuML，ChambersJT，Voydek1M，ela1．Immuno—
bistochemicalvaluationofestrogenandprogesteroner eep—
totcontenti 183patientswithendometricalcarcinomapart
1．Clinicalandhistologicalcorrelations[J]Am。，Pathol，
1990，94(3)：247．
[6]QuY，HuangJM，ShahcG，eta1．Thesignificanceofim—
munohistochemicaltestingp53expressioninnasopha‘y“geal
lesions[J]．ModIntegrTraditChinWestMed(现代中西
医结合杂志)，2003，11(5)：448—449．
万方数据
·1852· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
[73WangY．Researchndevelopmentofp53gene[J]F0r_
eignMedSci：CancerSect(国外医学：肿瘤学分册)，1993，
29(3)：129．
[8]XiaoCJ ApoptosisandcorrelatedgenesandtumorsEJ]．
Jiang：ciMedJ(江西医药)，1996，31(5)：300．
[9]OhSJ，ImMY．Thep53mutationwhichabrogatestraasac
tivationwhilemaintainingitsgrowthsuppressionactivity
[J]．MolCells，2000，10(4)：386391．
rlO]KaneuchiM，YamasitaT，ShindohM，eta1．Inductionof
apoptoaisbythep53—273L(Arg斗Leu)mutantinHSC3ceils
withouttransactionofp2lWall／Cipl／Sdilanbax[J]．Mol
Carcinog．1999，26(1)：44—52
[11]YucC，FilipeMI．Updateonproliferationassociatedanti
hodiesapplicabletoformalin—fixedparaffineembeddedtissue
andtheirclinicalapplicationsEJ]H舭hemJ，l993，25
(12)：843—853
苁蓉总苷对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响及机制研究
皋聪1，王传社2”，巫冠中1，胡梅1，屠鹏飞2“’
(1．中国药科大学药理教研室．江苏南京210009，2．北京大学中医药现代研究中心，北京100083
3．北京大学基础医学院．北京100083}4．北京大学药学院，北京100083)
人口的老龄化已使寻找安全有效的防治老年痴
呆症药物成为药物研究的热点。近年来，中医学使用
以补肾益髓为主、兼补心脾的方法治疗老年痴呆症
取得了较大的进展。肉苁蓉始载于《神农本草经》，具
有补肾阳、益精血、润肠通便之功效，现广泛用于治
疗老年性痴呆、阳痿、习惯性便秘等病症口“1。研究表
明其具有抗痴呆、抗氧化、抗缺氧、抗辐射、增强免疫
功能等作用，主要成分为苯乙醇苷类[3“]。苁蓉总苷
是从管花肉苁蓉Cistanchetubulosa(Schrenk)R．
Wight的干燥肉质茎中提取精制而成的，含苯乙醇
苷类90．7％，其中含主要成分松果菊苷(eehinaco—
side)44．3％。本实验研究苁蓉总苷对血管性痴呆大
鼠学习记忆障碍以及正常大鼠血栓形成和血小板聚
集的影响，为其开发成为促智和防治老年性痴呆症
的新药提供依据。
1材料
1．1动物：SD大鼠，雄性，体重470～570g，由上
海西普马一必凯实验动物有限公司提供，合格证号：
沪动合格字第152号。
1．2药物与试剂：苁蓉总苷，管花肉苁蓉的提取物，
含苯乙醇总苷90．7％、松果菊苷44．3％，深褐色粉
末，由北京大学中医药现代研究中心化学室提供，批
号为980601。吡拉西坦片，宜兴制药厂生产，批号为
980521。阿司匹林肠溶片，南京第二制药厂生产，批
号为000402。各药用前以蒸馏水配制。肝素钠，中国
医药(集团)上海化学试剂公司产品，批号为
F000128。戊巴比妥钠，中国医药(集团)上海化学试
剂公司进口分装，批号为971104。二磷酸腺苷二钠
(ADP)，中科院上海生化所东风生化技术公司产
品，批号为9305122，用前配成lmg／mL储备液冰
箱保存，用时以磷酸缓冲液稀释3倍。
1．3仪器：MG一3型Y型电迷宫，张家港教学实
验器械厂生产。SPA一4多功能血小板聚集仪，上海
科达测试仪器厂生产。
2方法
2．1 大鼠局灶性脑缺血一再灌注致血管性痴呆模型
制备及检测
2．1．1分组与给药：将大鼠按体重随机分为6组，
分别为假手术组、模型组、阳性对照组(吡拉西坦
300mg／kg)及苁蓉总苷高、中、低剂量(200、100、
50mg／kg)组。各组ig给药，0．5mL／100g，每日1
次，假手术组和模型组给予等体积的蒸馏水，连续给
药30d。
2．1．2模型的制备”]：于给药的第16天，大鼠以水
合氯醛360mg／kgip麻醉。正中切开颈部皮肤，分
离右侧颈部肌肉。游离颈总动脉和颈外动脉，结扎并
剪断颈外动脉分支。分离颈内动脉，直至暴露翼腭突
动脉。用动脉夹夹闭该侧颈总动脉，颈外动脉切口，
将头端钝圆、直径0．28mm的碳素渔线从大鼠颈外
动脉插入颈内动脉并进入颅内，直到有轻微阻力，这
时大脑中动脉的所有血供被阻断。缺血40min后将
渔线抽出，结扎颈外动脉，再通颈总动脉，消毒、缝
合，im青霉素防止感染。假手术组只分离和结扎颈
外动脉，不插渔线、不夹闭颈总动脉。
鉴鐾景皙：箬鬟嚣苌簖药物与中药现代化专项(96—9，。一。。一2。8)尊翥蕞雍挚蒜笔67_Tel／’男Fax漕：(师’010主)琶燥挚翟姜鬣@。E，-ma．池il：g—aoc””吨”3’⋯
万方数据
小白菊内酯对人肝癌BEL-7402细胞p53蛋白和增殖细胞核抗原
表达的影响
作者： 张雯， 宋晓凯
作者单位： 天津理工大学生物与化学工程学院,天津,300191
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(12)
被引用次数： 5次
参考文献(11条)
1.Heinrich M;Robles M;West J E Ethnopharmacology of Mexican Asteracease (Compositae) 1998(06)
2.Weng S X;Shan J;Lin X X Studies on the effect of parthenolide on the proliferation of rat vascular
smooth muscle cells and the mechanism[期刊论文]-中国中药杂志 2003(07)
3.Song X K;Zhang W Experimental study on parthenolide inducing human hepatocellular carcinoma cell
line BEL-7402apoptosis[期刊论文]-中草药 2005(11)
4.Wang R Q;Zhou Z C;Yang J M Expressionofras,c-myc,c-erbB-2 and p53 proteins hepatocellular
carcinoma tissues 1997(01)
5.Carcangiu M L;Chambers J T;Voydck I M Immunohistochemical evaluation of estrogen and progesterone
receptor content in 183 patients with endometrical carcinoma part 1.Clinical and histological
correlations 1990(03)
6.Qu Y;Huang J M;Shan C G The significance of immunohistochemical testing p53 expression in
nasopharyngeal lesions 2003(05)
7.Wang Y Research and development of p53 gene 1993(03)
8.Xiao C J Apoptosis and correlated genes and tumors 1996(05)
9.Oh S J;Im M Y The p53 mutation which abrogates transactivation while maintaining its growth
suppression activity 2000(04)
10.Kaneuchi M;Yamasita T;Shindoh M Induction of apoptosis by the p53-273L (Arg→Leu) mutant in HSC3
cells without transaction of p21 Waf1/Cip1/Sdi1 and bax 1999(01)
11.Yu C C;Filipe M I Update on proliferation associated antibodies applicable to formalin-fixed
paraffine embedded tissue and their clinical applications 1993(12)
本文读者也读过(10条)
1. 陈智超.李秋柏.吕建.邵菁.仲照东.游泳.刘新月.邹萍.CHEN Zhi-chao.LI Qiu-bai.LV Jian.SHAO Qing.ZHONG
Zhao-dong.YOU Yong.LIU Xin-yue.ZHOU Ping 小白菊内酯对多发性骨髓瘤细胞表面抗原的影响及其生长抑制作用
[期刊论文]-中国医院药学杂志2006,26(9)
2. 刘继洪.潘月龙.姚航平.LIU Ji-hong.PAN Yue-long.YAO Hang-ping 小白菊内酯对结肠癌细胞凋亡的影响及其
机制研究[期刊论文]-中国基层医药2009,16(9)
3. 陈智超.李秋柏.邵菁.吕建.游泳.仲照东.邹萍.CHEN Zhi-chao.LI Qiu-bai.SHAO Jing.L(U) Jian.YOU Yong.
ZHONG Zhao-dong.ZOU Ping 小白菊内酯对多发性骨髓瘤细胞的生长抑制及其凋亡诱导作用[期刊论文]-中华医学杂
志2006,86(28)
4. 宋晓凯.潘福娟 小白菊内酯的生物活性与NF-kappa B通道抑制[期刊论文]-中国老年学杂志2003,23(12)
5. 宋晓凯.张雯 小白菊内酯诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡的实验研究[期刊论文]-中草药2005,36(11)
6. 方勇.吴金民.卢瑜.Jennifer M.DZIADYK.潘宏铭.范伟民 小白菊内酯抑制紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡[期刊论文
]-中国药理学与毒理学杂志2004,18(1)
7. 刘继洪.潘月龙.姚航平 小白菊内酯诱导结肠癌细胞凋亡及对Caspase-3Caspase-9表达的影响[期刊论文]-中国
药物与临床2009,9(8)
8. 赵立杰.李岩.ZHAO Li-jie.LI Yan 小白菊内酯对胃癌BGC823细胞凋亡表型的影响[期刊论文]-现代肿瘤医学
2009,17(4)
9. 方梁杰 小白菊内酯对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡作用[学位论文]2008
10. 刘兰.许东元.杨万山.孙抒.LIU Lan.XU Dong-yuan.YANG Wan-shan.SUN Shu 小白菊内酯增强4-HPR诱导肿瘤细
胞凋亡[期刊论文]-中国病理生理杂志2008,24(9)
引证文献(5条)
1.骆丽.李道明 小白菊内酯对EC9706细胞增殖及VEGF、NF-κB P65蛋白表达的影响[期刊论文]-郑州大学学报（医
学版） 2010(5)
2.韩琨景.丁杨.杨万山 小白菊提取物的药理作用[期刊论文]-医学综述 2012(11)
3.赵立杰.李岩 尿激酶型纤溶酶原激活剂在小白菊内酯抑制胃癌细胞转移中的作用[期刊论文]-中国临床药理学与
治疗学 2008(8)
4.赵立杰.李岩 小白菊内酯对胃癌BGC823细胞凋亡表型的影响[期刊论文]-现代肿瘤医学 2009(4)
5.孙向珏.沈汉明.朱心强 菊花提取物抗肿瘤作用的研究进展[期刊论文]-中草药 2008(1)
本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200512036.aspx