全 文 ：·药材·
四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅰ . 根癌农杆菌介导的转基因菘蓝
张　磊 1 ,许铁峰 1 ,谭秋敏 2 ,王子楠 2 ,丁如贤 1 ,唐克轩 2 ,张汉明 1
( 1. 第二军医大学药学院 生药教研室 ,上海 200433;　 2. 复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室 ,上海 200433)
摘　要: 目的　将外源半夏凝集素基因 ( PTA)转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫抗性。方法　构建了以 CaMV 35S
为启动子 ,新霉素磷酸转移酶 ( Npt-Ⅱ ) 为选择标记 ,带有半夏凝集素基因 PT A的 pCAMBⅠ A2200植物双元表达
载体 ,应用根癌农杆菌 EHA 105遗传转化四倍体菘蓝。 结果　菘蓝外植体植株再生率达到 95%以上 ,转化率有
10%。 结论　建立了以 6-BA和 N AA为主要激素组合的四倍体菘蓝离体分化再生系统和农杆菌介导的转化系统。
关键词: 菘蓝 ;遗传转化 ;根癌农杆菌 ;半夏凝集素基因 ;植株再生
中图分类号: R282. 12　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 03 0258 04
Agrobacterium tumefaciens mediated transgenic tetraploid Isatis indigotica
carrying anti-insect gene fromP inella Ternata Agglutinin
ZHANG Lei
1
, XU Tie-feng
1
, T AN Qiu-min
1
, WANG Zi-nan
2
, DIN G Ru-xian
1
,
T ANG Ke-xuan
2
, ZHANG Han-ming
1
( 1. School of Pha rmacy , Second Milita ry Medica l Univ ersity, Shanghai 200433, China; 2. State Key Labo rato ry of Gene tic
Engineering , School of Life Sciences, Fudan Univ ersity, Shanghai 200433, China)
Abstract: Object　Pinella Ternata Agglutinin ( PT A) gene was conducted into tet raploid Isatis indig-
otica Fo rt. to g et anti-pest species. Methods　 Agrobacterium tumefaciens mediated t ransfo rmation in
w hich the“ high toxic” st rain EHA105 and the plant binary expression vecto r pCAMB I A2200 w ere adopt-
ed under CaMV 35S promo to r and neomycin phosphorus t ransfer red enzyme ( NptⅡ ) serv ed as the selec-
tion marker. Results　 The plant regenera tion rate o f transgenic explants w as up to 95% and transgenic
f requency was 10% . Conclusion　 An in vit ro highly ef fcient plantlet regenera tion system and transgenic
system mediated by A. tumef aciens in the main combination of 6-BA and N AA was established via co tyle-
don and hypocotyl segments in tet raploid I . indigot ica.
Key words: Isatis indigotica Fort. ; genetic t ransforma tion; Agrobacterium tumefaciens; Pinella Ter-
nata Agg lutinin ( PTA) gene; plant let regeneration
　　十字花科植物菘蓝 Isat is indigot ica Fort. 为我
国历代常用中药 ,其根称板蓝根 ,叶称大青叶 ,有清
热解毒 ,凉血利咽的功效 ,可防治病毒性感染 ,对流
行性乙型脑炎 ,流行性感冒 ,急慢性肝炎 ,流行性腮
腺炎等均有效 [1 ]。其人工四倍体 ( 2n= 28)的抗内毒
素及抗病毒作用显著强于二倍体亲本 ,是优质高效
的新品系 ,具有很大的开发利用价值 [2 ]。由于国内外
对其需求量很大 ,因此在我国南北各地广为栽培 ,但
栽培过程中 ,鳞翅目昆虫白粉蛾和小菜蛾所引起的
虫害相当严重 ,在某些地区虫害造成的损失经常达
到 60%～ 100%。 采用常规抗虫育种和使用化学农
药、生物杀虫剂及生态防治等手段杀虫 ,虽然取得了
长足进展 ,但也带来了一些新的问题。基因工程技术
的发展为培育抗虫药用植物品种提供了新的手段 ,
从而开辟了药用植物抗虫育种的新时代。近年来研
究进展迅速 ,并有一批转基因抗虫作物进入了大田
试验 ,展现出了美好的应用前景。抗虫植物基因工程
研究发展迅速 ,并分离出了大量的抗虫基因 ,其中包
括以抗鳞翅目害虫为主的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体
蛋白基因 ( Bacil lus thuringiensis insecticidal crystal
protein gene, Bt-ICP) [3 ]、 外源植物凝集素基因
( lectin)
[4 ]、 具有广谱抗虫性的胰蛋白酶抑制剂基
·258· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 3期 2003年 3月
收稿日期: 2000-10-10
* 通讯作者: Tel: 86-21-65513056
因 [5 ]及以抗鞘翅目害虫为主的疏基蛋白酶抑制剂基
因 [6 ]等。
根癌农杆菌 Agrobacterium tumef aciens是一种
天然的生物载体 ,可通过其 T-DNA的转移 ,将外源
DNA分子整合到受体植物核基因组中实现遗传转
化。根癌农杆菌介导的基因转化系统是一个较为完
善的植物转化系统 ,有非常广泛的寄主范围 ,可用于
大多数双子叶植物及一些单子叶植物的转化 [ 7]。菘
蓝的离体培养研究显示菘蓝是容易再生和转化的植
物种类 [8, 9 ] ,便于进行遗传操作。 我们建立了根癌农
杆菌介导的遗传转化系统 ,将天南星科植物半夏中
克隆得到的半夏凝集素基因构建植物双元表达载体
转入菘蓝。
1　材料和方法
1. 1　无菌外植体的获得: 将四倍体菘蓝种子先用
75%乙醇浸泡 1 min后用无菌水洗 1次 ;然后在
0. 1% Hg Cl2溶液中浸泡 10 min,最后用无菌水冲洗
3～ 5次 ,以达到种子表面灭菌的目的。将经过灭菌
处理的种子在无菌操作条件下播种到含蔗糖 3%的
MS
[ 10]空白培养基上 ,置于 4 000 lx× 12 h /d光照 ,
28℃条件下发芽。大约 1周后种子发芽长出实生
苗。将实生苗的子叶剪成 1 cm× 1 cm的叶盘 ,下胚
轴剪成 1 cm长小段供转化使用。
1. 2　农杆菌培养和质粒载体构建: 双元载体
pCAMBIA2200来自于澳大利亚 CAMBIA研究
院 ;中间载体 pBⅠ 121、农杆菌株 EHA105 ( St rr ,
Rifr , Kmr )、大肠杆菌 DH5α由本室保存。构建载体
pCAMBIA2200-NptⅡ -Kmr (图 1)用于转基因。
取用甘油保存于 - 20℃的农杆菌 50～ 100μL
于 2 mL的 LB液体培养基中 ,并加入相应的抗生素
[如: 利福平 ( Rif ) 20～ 50× 10- 6; 链霉素 ( St r )
50～ 100× 10- 6 ;卡那霉素 ( Km ) 50× 10- 6 ] ,在摇床
上以 250 r /min左右、 25℃ 摇菌 24～ 36 h至 A600=
1. 0。再取新摇菌 100～ 200μL于 30 mL的 LB液体
培养基中 ,并加入相应的抗生素 (浓度、条件同上 ) ,经
12 h左右 ,菌液达到 A600= 1. 0时 ,即可用来转化。
图 1　双元表达载体 P2200-PTA的构建流程
Fig. 1　 Construction f low of binary expression vector P2200-PTA
1. 3　叶盘法转化菘蓝:菌液在无菌的 50 mL的离心
管中以 5 000 r /min离心 5 min,去上清液 ,再用 30
m L的 MS液体培养基重悬。将预先剪好的外植体浸
在菌液中 20～ 30 min后 ,再用无菌滤纸或吸水纸吸
去多余的菌液 (无须进一步吸干 ) , 置于 MS0固体培
养基 (可覆盖一层无菌滤纸 ) 上 , 25℃ 暗培养 3 d。
共培养的外植体先用无菌水冲洗 3次 ,再浸于含头孢
霉素 ( 250 mg /L ) 的 MS0液体培养基中 20～ 30
min,用无菌滤纸或吸水纸吸干后 ,接种于选择分化
培养基 ( M S+ 6-BA 2 mg /L+ N AA 0. 5 mg /L+
Km 100 mg /L+ 羧苄青霉素 ( Cb) 300 mg /L)上进
行光照培养 ,每 3周继代 1次。以未转化外植体作为
对照。约 1～ 2个月 ,将 2 cm左右高的幼苗转到生根
培养基 ( 1 /2 M S+ Km 50 mg /L+ 头孢噻肟钠
( Cef ) 100 mg /L) 上生根。 生根是转基因成功的关
键 ,大多数转基因苗都有较发达的根系 ,而非转基因
苗在抗性培养基上往往难于生根 ,但并没有足够的证
据表明可以根据生根与否辨别是否是转基因苗。适当
降低抗生素浓度将有利于再生苗的生根。当苗长至 5
～ 6 cm高时 ,先要少量透气 ,并在培养基上加水炼
苗 ,防生菌。待苗适应环境后 ,完全置于空气中。移栽
温室之前 ,先要洗净根部的培养基。直接将无菌苗移
·259·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 3期 2003年 3月
入土中容易造成脱水 ,甚至死亡。本实验首先将苗移
入珍珠岩中用 1 /10 M S营养液培养 ,生长一段时间
后再移入土中可大大提高移栽苗的成活率。
2　结果
2. 1　菘蓝高频离体再生系统的建立:通过对比试
验 ,菘蓝植株再生的最佳条件是 MS+ BA 2 mg /L
+ N AA 0. 5 mg /L, 蔗糖浓度为 3% ,子叶再生率可
达 100% ,下胚轴再生率可达 96. 5% (见表 1)。
表 1　外源激素对菘蓝子叶和下胚轴分化再生的影响
Table 1　 Ef fect of plant growth regulators on tetraploid I. indigotica regenerat ion from cotyledon and hypocotyl
生长激素 /mg· L- 1 再生频率 /% 植株再生数
BA N AA 子叶 下胚轴 子叶 下胚轴
　　　 0. 0 　　　 0. 0 0 0 　　　　 0 　　　　 0
0. 2a 0. 5 27. 4± 2. 7 26. 8± 1. 6 11 10
0. 2a 1. 0 42. 3± 1. 5 44. 5± 5. 8 17 18
0. 2a 0. 2 66. 8± 5. 9 78. 6± 6. 3 27 31
0. 2a 5. 0b 0 0 0 0
1. 0 0. 5 85. 2± 3. 0 87. 0± 2. 2 34 35
1. 0 1. 0 89. 5± 4. 5 85. 3± 5. 8 36 34
1. 0 2. 0 83. 5± 1. 6 77. 7± 3. 4 33 31
1. 0 5. 0b 0 0 0 0
2. 0 0. 5 94. 0± 2. 2 96. 5± 1. 4 37 40
2. 0 1. 0 　　　 100. 0± 3. 8 　　　 86. 9± 2. 7 40 35
2. 0 2. 0 95. 8± 4. 1 79. 2± 3. 3 38 32
2. 0 5. 0b 0 0 0 0
5. 0 0. 5 73. 4± 4. 0 38. 6± 3. 2 29 15
5. 0 1. 0 64. 8± 5. 1 43. 5± 3. 6 26 17
5. 0 2. 0 20. 4± 2. 0 28. 7± 3. 2 8 11
5. 0 5. 0b 0 0 0 0
　　 a:部分外植体上有不定根长出　 b:部分外植体形成白色愈伤 ( P < 0. 05)
a: Some explan ts grew un fix ed roots　 b: Whi te cal lus cou ld be seen in ex plant ( P < 0. 05)
2. 2　转化体的筛选及再生:将与农杆菌共培养 3 d
的菘蓝外植体置于含有 Km的筛选培养基上进行
筛选时 ,要保证 Km的浓度足以杀死非转化外植
体 ,并不影响转化外植体的生长及分化情况。本实验
选择了非转化的菘蓝外植体 ( 50 /每个处理 ) ,鉴定
在含有不同浓度 Km分化培养基的条件下 ,能杀死
非转化外植体的最佳 Km的浓度。结果发现在 Km
浓度为 100 mg /L时 ,生长停止 ,并不能分化成苗 ,
因此采用这个浓度为最佳筛选压。
3　讨论
3. 1　转化受体的选择: 在四倍体菘蓝的遗传转化
中 ,最好的转基因受体是子叶和下胚轴。许多结果表
明 ,通过诱导愈伤获得的再生植株往往具有遗传性
状的不稳定性 ,而由丛生芽直接分化得到的再生植
株在遗传性状上更加稳定 [11 ]。
3. 2　基本培养基、不同激素配比、蔗糖浓度对菘蓝
外植体再生的影响:本研究发现 ,在菘蓝外植体的分
化过程中 , M S培养基要好于 GB5 [12 ]和 White[13 ]培
养基。6-BA+ N AA是最佳激素配比 ,并且最佳浓度
为 BA 2 mg /L, N AA 0. 5 mg /L。 3%的蔗糖浓度以
及光照培养最有利于菘蓝外植体的分化和高频再
生 [14, 15 ] (图 2)。
S1～ 5 -蔗糖浓度 1% ～ 5%　 L-光照培养　 D-暗培养
S1— 5 -sucrose concent ration 1%— 5%　 L-ligh t cul ture
D-darkness culture
图 2　不同培养条件对菘蓝离体再生系统的影响
Fig. 2　 Effect of dif f erent culture conditions on
tetraploid I. indigotica regenerat ion from
cotyledon and hypocotyl
3. 3　共培养时几个因素对转化效率的影响
3. 3. 1　菌液浓度对转化效率的影响: 在农杆菌介导
的遗传转化中 ,适当的菌液浓度是转化成败的关键问
·260· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 3期 2003年 3月
题之一。菌液浓度过低 ,会使农杆菌细胞数目不足导
致转化效率较低 ;菌液浓度过高 ,则由于营养不足造
成菌液中死菌数目过多 ,实际有感染能力的农杆菌数
目减少 ;此外 ,菌体产生的某些有害代谢产物对植物
细胞造成伤害 ,引起转化效率下降;农杆菌的浓度太
高 ,生长过盛就会造成外植体死亡;并且如果农杆菌
在共培养培养基上生长过旺 ,即使用 500 mg /L、甚至
1 000 mg /L的头孢霉素也不能将其杀死。选用适当
菌液浓度的原则是能够达到最大转化效率的最小菌
液浓度。因此在实验中 ,我们发现当菌液浓度在 A600
值为 1. 0～ 1. 6的范围内时 ,转化频率会维持在一个
相对的稳定的值 ,不会随着菌液浓度的提高而增加 ;
当菌液浓度过高时 ,转化频率反而会下降。
3. 3. 2　共培养的时间对转化效率的影响: 共培养的
时间以 3 d为好 ,此时转化效率达到最高值 ,进一步
则增加共培养的时间时 ,转化效率会急剧下降。究其
原因可能是由于在共培养基上不含任何抗生素 ,植
物细胞和细菌细胞都可以生长。 而细菌细胞的生长
周期要比植物细胞的短 ,生长较快。如果培养时间过
长 ,过度生长的细菌细胞就会抑制植物细胞的正常
生长 ,甚至会造成植物细胞的死亡。
3. 3. 3　共培养的温度、 pH对转化效率的影响:共培
养的温度在 22℃ 时转化频率较高 ,因为它具有 2个
优点: 1)不容易发生质粒的丢失; 2) 比较容易控制细
菌的过度生长。 缺点是植物细胞的生长也同时会受到
一定程度的抑制。出于上述考虑 ,我们一般选择 25℃。
在农杆菌与植物细胞进行共培养时 ,使用较低
pH的培养基有利于转化频率的提高。原因可能是
在偏酸的培养条件下 ,有利于农杆菌 vi r区基因的
表达 ,但较低 pH条件下 ,培养基的凝固状态较差 ,
不利于试验操作 ,容易污染。 pH在 4. 8～ 6. 2的范
围内 ,对转化效率的负面影响较小。所以共培养时我
们一般选择 pH5. 2的条件。
致谢:本实验四倍体种子由第二军医大学药学
院生药教研室乔传卓教授培育并赠送特此感谢。
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　　 (上接第 257页 )
较为满意 ,且能有效降低血浆 ET水平 ,络泰粉针是
三七总皂苷制剂。 三七总皂苷对缺血脑损伤有较好
的保护作用。已有研究表明 , ET的缩血管作用依赖
于钙离子的细胞内流 ,钙离子通道拮抗剂如尼莫地
平能逆转其引起的血管收缩。络泰粉针具有钙通道
阻断的作用 ,因此 ,络泰粉针可能是通过拮抗钙离
子 ,扩张血管而阻断 ET的作用从而显著降低血浆
ET水平的。另一方面 ,由于络泰粉针具有抗自由基
损害作用 ,可抑制脑梗死后再灌注时自由基的反应 ,
从而使 ET合成与释放减少。至于其确切机制 ,有待
进一步研究。
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·261·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 3期 2003年 3月