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石斛属 4 种植物的AFL P 分析
虞　泓1, 23 , 和　锐1, 倪念春1, 张时刚1Ξ
(11 云南英茂生物技术实验室, 云南 昆明　650106; 21 云南大学生命科学学院 生态遗传学实验室, 云南 昆明　650091)
摘　要: 目的　研究石斛属植物DNA 指纹图谱, 初步探讨A FL P 分子标记技术在石斛地道性鉴别上的应用。方法
采用扩增片段长度多态性 (A FL P)技术对石斛属内石斛组 4 个种和一个外类群种进行基因组DNA 多态性分析。结
果　从 64 对引物组合中选出 5 对引物组合构建了 5 个种的DNA 指纹图谱。通过聚类分析, 石斛属 4 种植物聚成
一个大类, 彼此关系得到了很好的分辨, 并获得 boo tstrap 校验的有力支持。结论　A FL P 技术可用于药用石斛
DNA 指纹图谱研究。
关键词: 石斛属; A FL P; DNA 指纹图谱
中图分类号: R 28217　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 07 0808 03
F ingerpr in ting ana lysis of plan ts of D end robium Sw1 by AFL P
YU Hong1, 2, H E R u i1, N I N ian2chun1, ZHAN G Sh i2gang1
(11 Inmo l L abo rato ry of B io techno logy of Yunnan, Kunm ing 650106, Ch ina　21 L abo rato ry of Eco logical
Genetics, Co llege of L ife Science, Yunnan U niversity, Kunm ing 650091, Ch ina)
Abstract: Object　Studies on DNA fingerp rin t ing of fou r species of D end robium Sw 1 and the app lica2
t ion of amp lif ied fragm en t length po lymo rph ism (A FL P) to the iden t if ica t ion of natu ra l herbal1 M ethods
T he po lymo rph ism s of fou r species from D end robium Sw 1 and one ou tgroup species w ere detected by
A FL P techn ique1 Results　T he DNA fingerp rin t ing of five species w ere genera ted by fine p rim er com b ina2
t ion s screened from 64 p rim er com b inat ion s1 Fou r species of D end robium Sw 1 w ere clu stered in to one b ig
group , w ho se rela t ion sh ip s w ere dist ingu ished very w ell1 T he resu lts w ere st rongly suppo rted by boo t2
st rap test1 Conclusion　A FL P techn ique has p rovided u s w ith the m ethod of study on the DNA finger2
p rin t ing of m edicinal species of D end robium Sw 1
Key words: D end robium Sw 1; amp lif ied fragm en t length po lymoyh ism (A FL P) ; DNA fingerp rin t ing
　　扩增片段长度多态性 (A FL P) 是在随机扩增多 态性 (RA PD ) 和限制性片段长度多态性 (R FL P) 技
·808· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
Ξ 收稿日期: 2003210212
作者简介: 虞泓, 博士生导师, 云南大学生物系教授, 云南英茂生物技术实验室主任, 主持云南大学生命科学学院生态遗传学实验室工
作, 从事生态遗传学和居群生物学科研与教学。1996 年评为云南省学术和技术带头后备人才; 1997 年主持完成的《横断山区
百合科四个属的细胞遗传与进化研究》获“云南省自然科学二等奖”; 1998 年主持完成的《云南百合科遗传多样性与进化研
究》获首届“云南省青年科技奖”; 2000 年获云南省五四青年奖章; 2002 年云南省人民政府授予“云南省中青年学术技术带头
人”称号; 2003 年获“云南省科技论文一等奖”。发表论文 40 篇 (SC I论文 6 篇)。3 通讯作者　T el: (0871) 8327767　Fax: (0871) 8327761　E2m ail: fisher@poblick. km. yn. cn
术上发展起来的 DNA 多态性检测技术[1 ] , 具有
R FL P 技术高重复性和 RA PD 技术简便快捷的特
点, 不需象 R FL P 分析一样必须制备探针, 且与
RA PD 标记一样对基因组多态性的检测不需要知
道其基因组的序列特征, 同时弥补了RA PD 技术重
复性差的缺陷。同其他以 PCR 为基础的标记技术相
比, A FL P 技术能同时检测到大量的位点和多态性
标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究, 种质
资源鉴定方面的研究, 构建遗传图谱等。罗志勇等[2 ]
首次用A FL P 技术构建了人参 P anax g inseng C1
A 1 M ey1 和西洋参 P anax qu inquef olium L 1 的
DNA 指纹图谱, 具有丰富的多态性, 这对于鉴别人
参品种, 真假人参等提供了非常有效的工具。
石斛属 (D end robium Sw 1)是兰科植物中的第 2
大属, 全世界约有 1 000 种, 我国有 4 种和 2 变种,
产秦岭以南诸省区, 尤其云南南部为多[3 ]。石斛以新
鲜或干燥茎入药, 具有益胃生津、滋阴清热、润肺益
肾、明目强腰之功效, 可治热病伤津、消化不良、病后
虚脱、遗精盗汗、腰膝无力、肺结核等症[4 ]。由于生境
狭窄, 繁殖困难, 植株数量及少, 石斛一直是价格昂
贵的紧缺药材。本实验采用A FL P 技术对石斛属 4
个种 (共 20 个样品) 和一个外类群种 (共 5 个样品)
进行了基因组DNA 多态性分析, 并结合聚类分析
探讨了供试类群的亲缘关系, 说明A FL P 技术可用
于药用石斛的DNA 分子指纹图谱构建。
1　材料与方法
111　材料: 植物材料来源见表 1, 均由中国科学院
北京植物研究所陈心启教授鉴定。
表 1　用于AFL P 分析的石斛 (叶片)
Table 1　Plan ts of D end robium Sw1 analyzed by AFL P
编号 植物名称 产地
NA (1～ 4) 碟花石斛
D end robium p ha laenop sis
人工栽培
N (1～ 4) 金钗石斛 01
D 1 nobile 高黎贡山
ND (1～ 4) 金钗石斛 02
D 1 nobile 高黎贡山
N E (1～ 4) 细茎石斛
D 1 m onilif orm e 高黎贡山
NB (1～ 4) 流苏石斛
D 1 f im bria tum 高黎贡山
N C (1～ 4) 束花石斛
D 1 ch ry san thum 高黎贡山
112　试剂: CTAB、T ris、Β2巯基乙醇、ED TA 均购自
美国 AM R ESCO 公司; RNA 酶, dN T P s、Eco R I、
M se I、T 4 DNA L igase、人工接头、预扩增引物均来
自上海生物技术和服务公司。 T aq 酶购自美国
P rom ega 公司。选择性扩增引物:M se I2XXX (X 为
选择性碱基) , Eco R I2XXX (此引物 5′端为荧光标
记) , 均购自美国 PE 公司。
113　仪器: 美国 PE 公司 377 测序仪: Gene Amp
PCR System 2400, 美国M illi POR E 超纯水系统,
意大利M ixer Gen iu s 生物反转摇匀仪, 瑞典A na2
lyt ica l Balance 分析天平, 英国 U n iccam H elio s X
紫外可见分光光度计, 德国 Sigm a 3K—30 冷冻高
速离心机、M emm er 水浴锅。
2　方法和结果
211　植物总DNA 提取: 采用常规CTAB 方法提取
植物新鲜叶片总DNA [5 ]。针对石斛属植物富含多糖
的情况, 在细胞破壁前加入一个水洗步骤以去除多
糖物质。DNA 经分光光度计和 ΚDNA 荧光半定量
法标定质量浓度。
212　A FL P 分析: 实验中为了降低成本, 将 PE 公司
试剂盒中大部分试剂更换为国产或其他公司试剂。
A FL P 扩增反应按照 PE 公司A FL P 操作手册进行。
取 013 ΛL 选择性扩增产物, 014 ΛL GeneScan—500
红色荧光标记的标准DNA , 115 ΛL L oading Buffer
涡旋混匀, 95 ℃变性 5 m in, 然后将其迅速置于冰上直
到上样。电泳在AB I PR ISM 377 测序仪上进行: 5%
变性聚丙稀酰胺凝胶, 1×TBE, 3 000 V 2. 5 h。电泳
过程中M acin to sh 计算机收集数据并产生电泳图 (图
1)。电泳结束后用 GenScan311 软件和 GenoT yper
215 软件分析采集的数据, 在M acin to sh 计算机上用
PAU P410b10 软件进行U PGM A 聚类分析, 再进行
boo tst rap 500 次重复抽样验证各分支的可信度, 构建
聚类图(图 2)。从 PE 公司试剂盒中的 64 对引物组合
里筛选出 5 对组合用于正式扩增。各引物的扩增情况
见表 2。两个金钗石斛居群分别彼此聚为一支, 形成姊
妹群关系, 再与细茎石斛聚类。石斛属 4 种植物形成一
个单系群后再与外类群蝶花石斛聚合(图 2)。
3　讨论
本实验室认为A FL P 技术对石斛属种的鉴定
及彼此亲缘关系的分析具有快速、准确、可信度高的
特点。聚类结果 (图 2)显示, 石斛属的 4 个种与人工
栽培种碟花石斛准确地区分开, 单独聚为一支, 支持
率为 856% ; 4 个种之间, 金钗石斛与细茎石斛之间
亲缘关系较近, 首先聚在一起, 再与流苏石斛、束花
石斛聚为一类, 其中高黎贡山不同居群的金钗石斛
各自聚为一类, 然后两个居群又聚为一类, 支持率高
达 99% , 其余的细茎石斛、流苏石斛、束花石斛都各
自聚为一支, 且支持率均超 90%。
·908·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
图 1　AFL P 分析电泳图
F ig. 1　Electrophoresis pattern of AFL P f ingerpr in ts
图 2　石斛样品的 UPGM A 聚类树
F ig. 2　D endrogram of plan ts of D end rog ram Sw.
con structed by UPGM A
表 2　用于石斛属扩增的引物组合、扩增片段数目及多态百分率
Table 2　Pr imer combination s used in PCR, results of ampl if ica tion , and polymorphous ratio in plan ts of D end rog ram Sw1
名　称
E2A CA öM 2CA T E2A CT öM 2CTA E2A CT öM 2CA G E2AA GöM 2CA T E2A CT öM 2CTC 多态率ö%
多态条带ö总条带 多态条带ö总条带 多态条带ö总条带 多态条带ö总条带 多态条带ö总条带
金钗石斛 108ö129 79ö111 121ö136 141ö194 121ö159 78. 2
蝶花石斛 65ö110 76ö110 79ö99 136ö206 70ö131 64. 9
流苏石斛 64ö101 68ö109 64ö100 64ö107 78ö137 61. 0
束花石斛 81ö118 92ö121 94ö117 122ö169 129ö179 73. 6
细茎石斛 101ö127 96ö133 109ö119 125ö164 100ö148 76. 8
　　几种石斛种类的单独聚类说明A FL P 方法可
用于药用石斛种的正确鉴定, 两个金钗石斛居群的
分别聚类说明A FL P 方法可进一步用于石斛中药
材的地道性分析。根据笔者对其他药用植物如红景
天、虫草的研究, 认为A FL P 方法较之 RA PD 方法
在可信度、灵敏度和经济实用等方面具有较大的优
势, 可推广到中药材种质鉴定和地道性研究中;
A FL P 方法还可以用于中药材种间、品种间系统亲
缘关系的识别, 这将为珍稀濒危药材的引种驯化、遗
传育种和 GA P 规范化种植提供科学的理论依据;
A FL P 方法在中药材分子指纹图谱中的成功应用,
必将对我国中药材种源的稳定和种质的提高起到良
好的作用。实验中为了降低成本, 将 PE 公司试剂盒
中的大多数试剂更换为国产或其他公司的试剂, 相
比之下, 最后完成A FL P 实验的成本比用RA PD 方
法的成本低, 更省时间, 更方便, 而且准确性更高, 数
据更可靠, 技术难度也不大; 电泳可更换为传统的垂
直板电泳——银染法, 这样A FL P 方法成本进一步
降低且更易于推广。A FL P 技术在种质资源及中药
材地道性研究应用中前景广阔。
致谢: 文字图片处理得到了代云波的帮助。
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·018· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月