全 文 ：表 4　不同播期和用种量鱼腥草植株地上部分甲基正壬酮含量和总量
Table 4　 Content and total amount per area of methynonyketone in overground
part of H . cordata plant in dif ferent sowing date and sowing quantity
播期
用种量
甲基正壬酮
含量 / (μg· g- 1 ) 总量 ( g· 小区 - 1)
播期
用种量
甲基正壬酮
含量 /(μg· g- 1 ) 总量 ( g· 小区 - 1 )
A1B1 55. 60 1. 56 A2B3 22. 51 0. 67
A1B2 34. 23 1. 06 A2B4 21. 45 0. 70
A1B3 64. 31 1. 73 A3B1 27. 81 0. 58
A1B4 64. 49 1. 79 A3B2 31. 22 0. 85
A2B1 16. 45 0. 50 A3B3 34. 99 0. 87
A2B2 21. 21 0. 57 A3B4 21. 97 0. 61
播种。本试验范围内 ,播期对新品系全株鲜重影响不
显著 ,说明其适合播种的范围的确较宽。但播期对地
上和地下部分各自鲜重有明显影响 ,以 10月 15日
播种者地上部分鲜重最重 , 11月 4日播种者地下部
分鲜重最重。鉴于 9月 25日播种者地上部分甲基正
壬酮含量以及单位面积甲基正壬酮总量均普遍较
高 ,建议生产中若以采收地上部分鲜草为主 ,最好于
9月下旬播种。若以培育种根或收获地下部分为主
要目的 ,可适当推迟播期至 11月上旬。至于 11月 4
日播种者地下部分鲜重最重的原因估计与此时种根
比较充实 ,根茎上的腋芽较为饱满有关。
有关鱼腥草栽培的文献均未见对鱼腥草用种量
的描述 [1, 2 ]。本试验发现 ,用种量主要对鱼腥草新品
系地上部分鲜重有显著影响 ,但多重比较结果未发
现不同用种量间有显著差异。多重比较结果还表明 ,
不同播期用种量间 ,地上部分鲜重 A1B2 , A2 B1和
A2 B4与 A1B1 , A1 B3 , A1 B4 , A2 B2 , A2 B3 , A3B2 , A3 B3和
A3 B4间差异不显著 ,仅与 A3 B1间差异显著。全株鲜
重 A2 B4和 A3B4与 A1 B1 , A1B2 , A1 B3 , A1 B4 , A2 B1 ,
A2 B2 , A2 B3 , A3B2和 A3 B3间差异不显著 ,仅与 A3 B1
间差异显著。 故综合产量质量等因素 ,认为若 9月
25日播种 ,以 3 kg /小区 ,即 3 000 kg /hm2左右用
种量比较适宜。若播期推迟 ,则用种量以 4. 5 kg /小
区 ,即 4 500 kg /hm2左右用种量比较合算。
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新疆产麻黄的 RAPD分析
党荣理 1 ,马永红 1 ,吴　霞 2 ,刘庆华 2⒇
( 1. 新疆军区卫生防疫大队 ,新疆 乌鲁木齐　 830011;　 2. 新疆药物研究所 ,新疆 乌鲁木齐　 830000)
摘　要: 目的　建立新疆产 3种麻黄指纹图谱 ,进行遗传多样性分析。方法　通过 20个 10碱基随机引物对新疆 3
种麻黄进行 PCR扩增 ,用无药用价值的膜果麻黄作对照 ,通过计算遗传相似性系数 ,建立 U PGM A聚类图。结果　
共扩增出 189个多态位点 ,建立了他们的基因组 DN A指纹图谱。 结论　物种间遗传差异明显 ,具有丰富的遗传多
样性 ;膜果麻黄与其他 3种药用麻黄的差异较大 ;药用麻黄中 ,木贼麻黄相对独立 ,中麻黄与兰麻黄遗传距离较近 ,
且具有较为相同的遗传关系。
关键词: RAPD;麻黄 ;遗传多样性
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 09 0861 03
·861·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月
⒇ 收稿日期: 2002-10-28基金项目:国家重点科技攻关项目 ( 2000-K01-05-02)作者简介:党荣理 ( 1965- ) ,男 ,陕西浦城县人 ,副主任医师 ,硕士 ,副研究员 ,研究方向为生物学、预防医学。
RAPD analysis of three species ofEphedra Tourn. ex L. growing in Xinjiang
DANG Rong-li
1 , M A Yong-hong
1 , WU Xia
2 , L IU Qing-hua
2
( 1. Brigade o f Epidemic Prevention o f X injiang M ilitar y Area , Urumqi 830011, China;
2. Xinjiang Institute of Ma teria Medica, U rumqi 830000, China )
Key words: RAPD; Ephedra Tourn. ex. L. ; genetic div ersi ty
　　麻黄是一种传统中药材 ,具有发汗、平喘、利尿祛
风的作用。新疆麻黄种类约有 9种 1变种 [ 1] ,但药用
仅 3种 ,即木贼麻黄、中麻黄和兰麻黄。 由于种类不
同 ,其有效成分及药用价值也不尽相同 ,为了进一步
分析中药麻黄的种间差异 ,我们利用 RAPD技术对
新疆 3种中药麻黄并用无药用价值的膜果麻黄作对
照进行基因组 DNA随机多态性分析 ,建立不同种的
DNA指纹图谱 ,为中药材的鉴定和标准化提供依据。
RAPD技术自 20世纪 90年代产生以来 ,广泛
应用于遗传图谱的构建、基因克隆、分子系统学及植
物群体遗传结构等研究领域。由于 RAPD分析是完
全随机扩增 ,不需要对所研究的物种的分子遗传学
背景有所了解 ,因为可选择的随机引物数十分巨大 ,
所检测的位点在基因组中随机分布 ,因而可以更客
观地说明群体遗传多样性的水平 [2 ]。
1　材料和方法
1. 1　材料来源: 研究材料均采自于新疆本地 ,为新
鲜幼枝叶 ,具体见表 1。
1. 2　方法
表 1　材料来源
Table 1　 Source of materials
序号 植物种名 采集地 样品植株数 采集时间
1 木贼麻黄 Ephedra equisetina Bge. 奇台 18 2001-07
2
中麻黄 E. intermedia Schrenk. et C.
A. Mey
和静 20 2001-08
3 兰麻黄 E. glauca Regel 库车 16 2001-08
4 膜果麻黄 E. przewalskii Stapf 库车 20 2001-08
1. 2. 1　基因组 DNA提取: 取同一物种的 18～ 20
株的幼嫩枝叶 ,混合后称取 3 g ,经液氮处理提取基
因组 DNA,基因组 DNA的提取方法采用高盐低
pH值法 [3 ]。
1. 2. 2　引物选择:选取 40个 10碱基长度的寡核苷
酸随机引物 (购自上海生物工程公司 ) ,分别扩增 4
个 DNA样品 ,从中筛选出扩增性强、重复性好、多
态性高的 20个引物 ,引物序列见表 2,全部用于麻
黄样品基因组 DNA的扩增。
表 2　产生多态位点的随机引物
Table 2　 Primers which produced polymorphic bands
引物 序列 总带数 多态带 　引物 序列 总带数 多态带
S1 GT T TCGCTCC 　　 12 　　 10 　 S16 T TTGCCCGGA 　　　 9 　　　 9
S3 CATCCCCCTG 12 11 　 S17 AGGGAACGAG 15 13
S4 GGACTGGAGT 16 15 　 S20 GGACCCT TAC 10 10
S5 TGCGCCCTTC 11 5 　 S26 GGTCCCTCAC 8 8
S6 TGCT CTGCCC 9 9 　 S27 GAAACGGGTG 9 8
S8 GTCCACACGG 13 11 　 S32 GTGA TCGCAG 10 7
S10 CTGCTCCCAC 14 11 　 S34 TCT GTGT TGG 11 9
S11 GTAGACCCGT 7 5 　 S37 GACCGCT TCT 15 15
S12 CCTTG ACGCA 10 7 　 S40 GTT GCGAT CC 8 5
S13 T TCCCCCGCT 15 13
S15 CCACCCTCTT 13 8 　合计 227 189
1. 2. 3　 PCR反应: PCR扩增反应在 PE公司 5700
型定量 PCR仪上进行 ,反应总体积为 25μL。 其成
分为: 10× PCR buf fer 2. 5μL, 25 mmol /L MgCl2 2
μL, 10 mmo l /L dN T P 1μL , 25 ng /μL模板 DNA 1
μL, 10 pmol引物 1μL, 5 U /μL Taq DN A聚合酶
0. 3μL, ddH2O17. 3μL。扩增程序为:首先 , 95℃预
变性 2 min,然后进行以下 40个循环: 94℃变性 40
s, 36℃退火 60 s, 72℃延伸 120 s,最后 72℃延伸 7
min。 取 10μL扩增产物在 1. 5%琼脂糖凝胶中电
泳 , EB染色后 ,在 Alpha Imager 2200型凝胶成像
系统上观察并拍照。
1. 2. 4　数据处理: 电泳图谱中的每一条带均代表了
与模板 DNA互补的一对结合位点 ,可记为一个优
点 ,根据相对分子质量标准对照反应产物在胶上的对
应位置 ,估计扩增产物的相对分子质量大小 ,有带的
记为 1,无带的记为 0,开成 0 /1矩阵 ,进行带数统计。
·862· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月
计算遗传系数 F [F= 2N ab / (N a+ N b) ]和遗传距离
D (D= 1- F) ,利用 UPGMA法进行聚类分析。
2　结果和分析
2. 1　 RAPD产物的多态性: 在所采用的 40条引物
中 ,其中 20条引物在对 4种麻黄的 DNA样品进行
RAPD分析中得到良好的结果 ,图 1列举了 S1、 S13
两条引物扩增产物的电泳图谱。通过分析发现 20条
引物共检测到 227个位点 ,位点范围在 200～ 2 500
bp之间 ,膜果麻黄位点最多 ,共计 160个 ,兰麻黄最
少 ,仅 101个。在所有位点中多态位点 189个 ,占总
位点的 79. 75% ,平均每条引物扩增出 9. 45条多态
位点。 这说明麻黄具有丰富的遗传多样性。将产物
多态性结果的随机引物的所有扩增位点均用于分
析 ,并将它们看作性状 ,即 4个供试麻黄的 227个性
状 ,其中 189个性状是多态的。
M-DL2 000+ DL15 000 Mark er
1-木贼麻黄　 2-中麻黄　 3-兰麻黄　 4-膜果麻黄
1-E. equiset ina　 2-E . interm dia　 3-E. gla uca　 4-E. p rzewalskii
图 1　引物 S1与 S13对 4种麻黄样品的扩增图谱
Fig. 1　RAPD amplif ied for four species of Ephedra
respect ively with primers S1 and S13
2. 2　种间遗传关系分析: 据 F= 2N ab /N a+ N b
(N ab为二者共同的带数 ,N a、 N b分别为二者特有
的带数 )计算相似系数 ,遗传距离 D为 1- F ,列出
遗传距离矩阵 (表 3)。
表 3　 4种麻黄的遗传距离矩阵
Table 3　Matrix of genet ic distances in four
species of Ephedra Tourn. ex L.
木贼麻黄 中麻黄 兰麻黄 膜果麻黄
木贼麻黄 　　 0 　 0. 546 2 　 0. 490 0 　 0. 718 7
中麻黄 0 0. 359 6 0. 557 9
兰麻黄 0 0. 490 0
膜果麻黄 0
　　通过聚类分析可以看出 ,这 4种麻黄可以分为
3个组 (图 2) ,膜果麻黄为 1组 ,木贼麻黄为 1组 ,中
麻黄与兰麻黄为 1组。
图 2　 4种麻黄聚类分析树状图
Fig. 2　 Dendrogram of UPGMA in four
species ofEphedra Tourn. ex L.
3　讨论
根据 RAPD结果 ,不同种植物指纹图谱有一定
的差异 ,特别是无药用价值的膜果麻黄与其他 3种
差异较大 ,而中麻黄与兰麻黄差异较小。传统的植物
分类认为 ,木贼麻黄为单子麻黄亚派 ,中麻黄、兰麻
黄为欧亚麻黄亚派 ,膜果麻黄为翅麻黄亚派 [ 4 ] ,这和
RAPD结果及聚类分析结果相一致 ,说明植物的基
因图谱与亲缘关系的一致性。
从有效成分看 ,北疆山地生长的木贼麻黄体内
所含的麻黄素 ,左旋麻黄素占 80% ,右旋麻黄素占
20% ;在南疆山区生长的兰麻黄与中麻黄的体内所
含麻黄素 ,右旋麻黄素占 80% ,左旋麻黄素占
20% [5 ]。基因组 DNA指纹图谱中 ,兰麻黄与中麻黄
比较接近 ,木贼麻黄基因图谱与前两者差异较大 ,而
膜果麻黄不含有效成分 ,基因图谱与前三者相差最
大 ,这说明药效成分与基因图谱二者之间存在一定
相关性。
致谢:新疆大学生命科学与技术学院分子生物
学重点开放实验室提供实验条件。
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　　　　　　　　中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月　　　　　　· 附 1·