全 文 ：·药剂与工艺·
数字化色谱指纹谱技术在双黄连制剂质量及药材鉴定中的应用
王新宏 ,安　睿 ,邹　云 ,王智华 ,洪筱坤 ,李国文⒇
(上海中医药大学 中药化学教研室 ,上海　 200032)
摘　要:目的　建立双黄连制剂和药材的数字化色谱指纹谱以用于制剂质量分析和药材鉴定。 方法　采用 RP-
HPLC梯度洗脱技术进行 HPLC分离分析 ,建立双黄连制剂和药材的数字化色谱指纹谱。色谱柱: Ine rtsil ODS柱 ;
流动相: 乙腈-1%乙酸水溶液作梯度洗脱 ;流速: 1 m L /min;检测波长: 280 nm。结果　在选定的色谱条件下 ,建立了
药材和制剂的数字化色谱-指纹谱 HPLC-DFPS( HPLC-Digitized Finger Print Spec trum) ,提供了稳定可控的制剂
指纹谱图 ,以及通过与空白样品比较探求了制剂中用以鉴定各药材的特征峰群。 结论　利用数字化色谱指纹谱技
术分析双黄连制剂的质量和鉴定中药材是切实可行的。
关键词: 数字化指纹谱 ;双黄连制剂 ;高效液相色谱法
中图分类号: R282. 5; R286. 02　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 02 0115 04
Application of chromatograph-digitized fingerprint spectrum in identification of
medicinal materials and qualitative control of SHUANGHUANGLIAN PREPARATION
*
WANG Xin-hong , AN Rui , ZO U Yun, WANG Zhi-hua, HONG Xiao-kun, LI Guo-wen
( Depa rtment o f Chinese Medicine Chemist ry , Shanghai Univ er sity o f TCM , Shanghai 200032, China )
Abstract: Object 　 To establish HPLC-Digiti zed fingerprint spect rum ( HPLC-DFPS ) of
SHU ANGHUANGLIAN PREPARATION and rela tiv e medicinal herbs so that i t will be applied in
identi fica tion o f medicinal materials and quali ty cont rol of the PREPARATION. Methods　 A gradient
separated method was applied. Column: Inertsi l ODS. Mobile phase: acetonit ri le-wa ter ( 1% acetic acid) .
Detection w aveleng th: 280 nm. Results　 Using above optimum chromato graphy condi tions, the HPLC-
DFPS of relative medicinal materials and SHUANGHUANGLIAN PREPARATION was established.
Conclusion　 Compa rison o f a g roup of characteristic peaks suggested that the HPLC-DFPS can be used
fo r identification of relativ e medicinal materials and quali ty control of SHU ANGHUANGLIAN
PREPARATION.
Key words: digi ti zed fing erprint spect rum ( DFPS ) ; SHU ANGHUANGLIAN PREPARATION;
HPLC
* SHUANGHUANGLIAN PREPARAT ION is a Chinese herbal preparation w ith Flos Lonicerae,
Radix Scutellariae , and Fructus Forsythiae. It has the function of antibio sis, antivi rus, and
antiinf lammation etc. .
　　金银花、黄芩、连翘组成的双黄连制剂具有良好
的抗菌、抗病毒、抗炎解热的功能 ,临床上广泛用于
呼吸道感染、扁桃体炎、肺炎等。 有关双黄连制剂的
质量标准 ,研究最多的是以 3味中药的主要成分作
为定性定量的指标 [1～ 3 ]。为了能在制剂中较全面、合
理地反映其组成药材即对制剂中药材作出科学鉴
定 ,本研究收集了不同厂家生产的双黄连口服液制
剂和同一厂家生产的不同批号的双黄连片剂 ,采用
梯度洗脱技术进行 HPLC分析 ,对制剂和药材的色
谱图建立数字化色谱指纹谱 ,探求药材在制剂中呈
现的特征峰群 ,为双黄连制剂中药材的鉴定提供科
学依据。 　
1　试验材料
1. 1　仪器: 高效液相色谱仪 ,包括 Waters 510型
泵 ,W aters TM 996 PDA检测器 , Mi llennium 32色
谱工作站。 SY3200超声清洗机 (上海声源超声波仪
器设备有限公司 )。
1. 2　试剂: 乙腈、甲醇为 HPLC级 ,冰醋酸为分
·115·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 2期
⒇ 收稿日期: 2001-05-24作者简介:王新宏 ( 1963-) ,男 ,浙江人 ,博士 ,上海中医药大学中药学院副教授 ,主要从事中药质量标准研究。
Tel: ( 021) 54231710　 Fax: ( 021) 54231547
析纯。 　　
1. 3　样品:金银花、连翘、黄芩药材购于上海市药材
公司 ,并经本校中药鉴定教研室吴赵云副教授鉴定。
黄芩苷粗品、双黄连片剂 (批号: 990601, 990702,
990812, 990305)、双黄连口服液 ( 981002、 981207、
990301、 990601、 20000102)为上海五洋药业健康产
品有限公司生产 ;双黄连口服液: 哈尔滨制药四厂
( 991104) ,黑龙江完达山制药厂 ( 990605) ,众生制药
厂 ( 990211) ,河南南阳制药厂 ( 991012)。
1. 4　对照品:咖啡酸、黄芩素、木犀草素购自 Sigma
公司 ;绿原酸、芦丁、黄芩苷、连翘苷购自中国药品生
物制品检定所。
2　实验部分
2. 1　色谱条件:色谱柱: Inertsi l O DS-3 ( 4. 6 mm×
250 mm , 5μm) ,保护柱: Phenomenex ODS-C18柱
( 3. 0 mm× 40 mm , 5μm) ,流动相: 乙腈 ( A) -1%醋
酸水溶液 ( B)作梯度洗脱 , 0～ 10 min, 18% A-72%
B; 10～ 20 min, 28% A-62% B; 20～ 35 min, 42% A-
52% B; 35 min以后 , 65% A-35% B。流速: 1. 0 mL /
min,柱温:室温 ,检测波长: 280 nm。
2. 2　对照品溶液配制:分别精密称取对照品置量瓶
中 ,以甲醇为溶剂 ,配制成单组分对照品溶液 ,而后
配制混合对照品溶液 ,其中含绿原酸 0. 1 mg /mL、
咖啡酸 0. 1 mg /mL、芦丁 0. 05 mg /mL、连翘苷
0. 15 mg /mL、黄芩苷 0. 1 mg /mL、黄芩素 0. 2
mg /m L。
2. 3　供试液的制备: 取片剂 10片 ,刮去薄膜包衣 ,
研碎 ,混匀 ,精密称取 50 mg ,置离心管中 ,加溶剂甲
醇 -水 ( 1∶ 1) 4 mL,超声 15 min,离心后取上清液 ,
残渣重复操作一次 ,合并两次上清液于 10 mL容量
瓶中 ,定容至刻度。
取口服液 5支 ,将其混合均匀后 ,精密移取
0. 5 mL加甲醇 -水 ( 1∶ 1)定容至 10 mL。
分别取金银花、连翘药材研磨成粉末 ,过 40目
筛 ,精密称取金银花 187. 5 mg、连翘 375 mg ,置离心
管中 ,同片剂操作。最后各定容至 10 mL容量瓶中。
因制剂中采用黄芩苷粗品为原料 ,所以称取黄
芩苷粗品 5. 7 mg代替黄芩药材 ,同上操作。
样品经微孔滤膜过滤 ,按 2. 1项下色谱条件进
样分析。此处仅以金银花药材、空白及样品的色谱图
为代表 ,见图 1。
2. 4　 HPLC相对保留值指纹谱的建立
2. 4. 1　 HPLC-DFPS原理及方法见文献 [ 4～ 5 ]。
2. 4. 2　相对保留值T的计算:双黄连制剂在本实验
Ⅰ -样品　Ⅱ -金银花　Ⅲ -空白
图 1　金银花药材、空白及样品 (片剂 990305)的 HPLC图谱
色谱条件下 ,色谱峰较多且相当密集 ,难以插入一个
合适的参照物 ,故选择一个出峰时间较居中、各制剂
中均存在的组分作内参照峰 ,如在鉴定金银花时以
绿原酸峰为参照峰 ,鉴定连翘时以连翘苷峰为参照
峰 ,鉴定黄芩时以黄芩苷作为参照峰 (T= 1) ,求出样
品中所有峰的相对保留值 T。
T= tRi /tRs
tRi -各组分的出峰时间 , tRs -内参照峰的出峰时间
色谱相对保留值是一组仅与化合物性质、色谱
分离条件相关的半定量参数 ,当色谱分离条件固定
时 ,仅与化合物的性质有关 ,可以消除人和仪器设备
对化合物保留时间的影响。
2. 4. 3　T值窗口的设定:由于保留时间受各种实验
因素的影响 ,每一次实验数据不可能完全一致 ,故对
每个峰位的 T值设定窗口为 2% ,即通过大量的实
验数据计算每个峰位的T值 ,取可信限在± 2%的范
围内。
2. 4. 4　指纹谱的建立:按样品各色谱峰T值的大小
次序排序 ,在每个 T项下标出该组分的相对面积值
( RA )即组成了样品的 HPLC-DFPS。以样品色谱峰
的总面积为分母 ,各色谱峰面积为分子 ,计算得到各
色谱峰的相对面积值 ,亦称为相应化合物的相对丰
度 ,计算公式为:
RA= Ax× 100 /΢A
R A-相对面积值 , A x-某个峰的面积 ,΢A-总峰面积
·116· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 2期
在一些可以作比较的不同的样品中 ,对具有相
同T值的峰的 RA值进行比较 ,可以获知所对应的
化合物在各个样品中的相对含量 ,达到半定量分析
的目的。表 1为以绿原酸为内参照峰的金银花药材
及样品色谱指纹谱的特征峰 ,表 2为以连翘苷为内
参照峰的连翘药材及样品色谱指纹谱的特征峰 ,表
3为以黄芩苷为内参照峰的黄芩苷粗品及样品色谱
指纹谱的特征峰。
表 1　金银花药材及样品的特征峰
T值 样品峰相对面积 ( RA )
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Δ
0. 488 0. 98 0. 23 0. 32 0. 31 0. 48 0. 60 0. 04 0. 33 0. 29 0. 18 0. 29 0. 16 0. 30 13
0. 558 0. 69 0. 34 0. 35 0. 24 0. 71 0. 31 0. 34 0. 26 0. 26 0. 26 0. 22 11
0. 767 1. 93 1. 40 0. 15 0. 33 0. 37 3. 01 1. 43 2. 13 1. 74 1. 13 2. 63 1. 71 1. 07 2. 98 14
1. 000 53. 43 1. 34 1. 25 1. 22 1. 16 0. 83 1. 67 2. 10 1. 57 1. 24 2. 43 2. 47 0. 78 3. 74 14
1. 047 2. 38 1. 12 0. 63 0. 15 0. 23 2. 12 1. 50 2. 15 1. 46 1. 50 1. 89 1. 49 0. 64 2. 94 14
1. 977 0. 56 0. 16 0. 35 0. 63 1. 60 0. 78 0. 72 1. 78 1. 60 1. 83 10
2. 047 22. 59 1. 23 0. 27 0. 18 0. 21 0. 58 0. 47 1. 00 0. 54 0. 31 0. 64 0. 78 0. 80 0. 80 14
2. 140 7. 94 0. 53 0. 51 0. 41 0. 40 2. 29 0. 78 1. 96 1. 46 0. 71 2. 13 1. 76 2. 85 13
2. 740 2. 43 0. 71 1. 05 1. 07 1. 07 0. 60 0. 89 1. 13 0. 35 0. 60 0. 83 0. 88 0. 65 1. 05 14
　　 1-金银花药材 ; 2-金银花空白 ; 3～ 6为上海五洋制药厂生产的片剂 ,批号分别是 990305、 990601、 990702、 990812; 7～ 11为上海五
洋制药厂生产的口服液 ,批号分别是 981002、 981207、 990301、 990601、 2000102; 12～ 15分别是众生制药厂 ( 990211)、哈尔滨制药四厂
( 991104)、黑龙江完达山制药厂 ( 990605)、河南阳制药厂 ( 991012)生产的口服液。 Δ为具有某T值的样品数。
表 2　连翘药材及样品的特征峰
T值 样品峰相对面积 ( RA )
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Δ
0. 638 5. 66 0. 55 0. 45 0. 44 0. 39 1. 30 1. 17 0. 76 0. 84 0. 45 1. 34 0. 10 1. 01 13
0. 659 36. 61 0. 21 1. 57 1. 49 1. 40 1. 41 3. 24 3. 08 1. 99 2. 08 1. 26 3. 21 2. 46 13
0. 680 5. 95 0. 66 0. 24 0. 14 0. 24 0. 26 0. 25 0. 18 0. 36 0. 21 0. 23 0. 13 0. 29 13
0. 822 2. 88 0. 54 0. 61 0. 65 0. 67 0. 58 0. 52 0. 25 0. 39 0. 62 0. 31 0. 22 0. 48 0. 67 14
1. 000 4. 68 0. 22 0. 23 0. 21 0. 20 0. 78 0. 46 0. 85 0. 32 0. 28 0. 33 0. 50 1. 91 0. 44 14
　　　　 1-连翘药材 ; 2-连翘空白 ;余同表 1。
表 3　黄芩苷粗品药材及样品的特征峰
T值 样品峰相对面积 ( RA )
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Δ　
1. 000 86. 01 77. 29 81. 71 82. 30 82. 50 66. 93 77. 88 70. 74 75. 03 72. 26 71. 88 72. 18 81. 42 70. 87 14
1. 257 8. 84 6. 57 4. 52 4. 87 4. 85 1. 82 1. 65 5. 20 3. 27 6. 36 5. 38 3. 91 5. 75 0. 37 14
1. 331 1. 44 0. 39 1. 12 0. 36 0. 33 0. 33 0. 49 0. 58 8
　　　　 1-黄芩苷粗品 ; 2-黄芩苷空白 ;余同表 1。
3　结果
3. 1　双黄连制剂中金银花药材的鉴定:一般在制剂
中鉴定某药味的存在与否是通过直观比较制剂、待
鉴药材和空白样品色谱图 ,观察相对应色谱峰有无
来鉴定 ,但该方法粗糙 ,误差较大 ,无量化指标。为能
正确、客观、量化地分析 ,本研究通过分析制剂、待鉴
药材和空白样品的数字化色谱指纹谱 ,清楚地发现
金银花指纹谱中有 9个色谱峰为多数样品共有 ,其
中 T值为 0. 488(仅在 11号样品中未检出 ) , 0. 588
( 5, 11, 12号样品中未检出 ) , 0. 767, 1. 000, 1. 047,
1. 977 ( 3, 5, 6, 14号样品中未检出 ) , 2. 047, 2. 140
( 14号样品中未检出 ) , 2. 740。因此可以认为这些色
谱峰是金银花在制剂中的特征峰群 ,换句话说 ,这些
色谱峰是由金银花产生 ,这为制剂中金银花的鉴定
奠定了基础。
3. 2　双黄连制剂中连翘的鉴定:采用连翘苷作为参
照峰建立了指纹谱 ,通过连翘药材、连翘空白制剂和
样品指纹谱比较 ,可以清楚地看出连翘指纹谱中的
6个色谱峰为多数样品共有 ,其中T值为 0. 638( 3
号样品中未检出 ) , 0. 659( 14号样品中未检出 ) ,
0. 680( 14号样品中未检出 ) , 0. 779( 14号样品中未
检出 ) , 0. 822, 1. 000。这些特征峰群在双黄连片剂、
口服液中出现率很高。
3. 3　双黄连制剂中黄芩的鉴定:由于制剂工艺中采
用黄芩苷粗品作为原料药 ,所以在制剂中检出物是
以黄芩苷粗品为比较对象。采用黄芩苷作为参照峰
建立指纹谱 ,通过黄芩苷粗品、黄芩空白制剂和样品
指纹谱比较 ,其特征峰群 T值为 1. 000, 1. 257,
·117·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 2期
1. 331。
3. 4　制剂工艺重现性的比较:本实验所研究的片剂
均系上海五洋制药厂生产 ,经比较不同批号片剂指
纹谱 ,发现各批号片剂总色谱峰为 28个 , 3个以上
批号都出现的峰为 23个 ,其重叠率大于 82% ,有些
小峰可能未能检出 ,降低了其重叠率 ,但已说明不同
批次样品的重现性是很好的。
文中研究的口服液系不同厂家生产 ,在工艺操
作中总会有偏差 , 9个样品中 ,以 7个以上样品都出
现的峰为共有峰计 ,则它们之间的重叠率也大于
57. 5% 。
4　讨论
4. 1　本研究采用了 HPLC-PDA技术对双黄连制
剂进行梯度洗脱 ,一次进样即能得到众多的色谱峰 ,
分离分析效率高 ,且其相对保留值相当稳定 ,所建立
的数字化色谱指纹谱更具稳定性和可控性。
4. 2　本实验采用梯度洗脱技术和 PDA检测器 ,对
双黄连制剂提取物进行分离分析 ,通过一次进样 ,即
能使 210～ 400 nm波长范围内有吸收的所有组分都
能被检测出来。通过 PDA技术获得多组分的三维
图谱 (分析时间 t-波长 λ-吸收值 A )信息 ,可找出每
个峰的最大吸收波长 ,使每个色谱峰都有较大的检
测灵敏度。实验借助三维图 ,截割得到不同吸收波长
的 A-t图 ,通过比较各波长下的色谱图 ,最后选择检
测波长 280 nm,在此波长下 ,出峰数多 ,可提供的信
息多 ,灵敏度高 ,基线平直稳定。
参考文献:
[ 1 ]　华菊根 ,胡立君 ,李国枕 .注射用双黄连质量标准的研究 [ J ].
中成药 , 1996, 18( 11): 13-15.
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连中连翘苷的含量 [ J] .中国中医药科技 , 1997, 4( 2): 93-95.
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原酸、黄芩苷的含量 [ J ]. 中草药 , 1991, 22( 2): 53-55.
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比较研究 [ J] .中国药学杂志 , 1997, 32(增刊 ): 30-33.
加味脑乐静合剂稳定性的跟踪分析
赵绪元 ,李焕德* ,向大雄 ,王秀良 ,唐晓峦* * ,陈卫林* * ⒇
(中南大学湘雅二医院 药剂科 ,湖南 长沙　 410011)
摘　要: 目的　对加味脑乐静合剂的稳定性进行研究 ,探讨 p H值的变化与微量沉淀形成的关系 ,确保本品安全有
效使用。方法　样品室温下存放 ,对其 p H、沉淀形成及化学成分进行为期 2年的跟踪检测。化学成分的定性用 TLC
和 HPLC法 ,葛根素含量测定采用 HPLC法 ,外标法定量 ( mg /m L)。结果　获得了沉淀和液体部分各自的 TLC和
HPLC特征图谱。 在薄层上可以清楚地检识出甘草和葛根的斑点 ,在 HPLC谱中可以清楚地检识出葛根素的特征
峰 ;随着贮存时间的延长 ,沉淀的量稍有增加 ,而 p H值略有下降。 结论　该液体制剂在贮存期间基本稳定 ,所获实
验数据可为本品的进一步研究提供参考。
关键词: 稳定性 ;加味脑乐静合剂 ; HPLC; TLC
中图分类号: R286. 01; R286. 02　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 02 0118 03
Studies on stability of JIAWEI NAOLEJING ORAL LIQUOR
*
ZHAO Xu-yuan, LI Huan-de, X IANG Da-xiong , W ANG Xiu-liang , TAN G Xiao-luan, CHEN Wei-lin
( Depar tment of Pha rmacy , Second Xiangya Hospital of Centr al South Unive rsity , Changsha Hu nan 410011, China)
Abstract: Object　 To study the stabili ty o f JIAWEI N AO LEJING ORAL LIQUOR and to find the
rela tionship betw een pH and sedimentation in the O RAL LIQUOR, so a s to ensure i ts safety and ef ficacy.
Methods　 The chemical costi tuents of the O RAL LIQUOR which have been stored fo r 24 months a t room
tempera ture w ere quali ta tiv ely determined by TLC and HPLC, the puerarin was quantitativ ely determined
by HPLC w ith ex ternal standard and expressed in mg /mL. Results　 Cha racteristic T LC and HPLC
spect rum of the sediment and the liquid w as obtained. Spo ts of Radix glycyrrhizae and Radix Puerariae
were clearly distinguished on the plate. HPLC peaks o f puera rin w ere clearly exhibi ted. The content of
sediment in the O RAL LIQUOR increased slowly accompanying time prolonging , but the pH value
·118· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 2期
⒇ 收稿日期: 2001-07-10基金项目:卫生部科技计划 ,湖南省科委重点项目 ( 98ss y1002)
* 通讯联系人 ,教授 ,国家新药评委 , Tel: 0731-5550252　　* * 湖南中医学院 96级实习生