全 文 ：香菇多糖对巨噬细胞一氧化氮生成和细胞内还原型谷胱甘肽的影响
侯　敢 ,黄迪南 ,祝其锋
(广东医学院生物化学与分子生物学研究所 ,广东 湛江　 524023)
摘　要: 目的　为探讨香菇多糖 ( lentinan, LTN ) 激活小鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮 ( NO )生成的作用机制。 方法
观察 LTN对小鼠腹腔巨噬细胞 NO生成与细胞内还原型谷胱甘肽 ( GSH)的影响及其关系。 结果　 ( 1) LTN对
小鼠腹腔巨噬细胞 NO生成具有明显的促进作用 ,同时细胞内 GSH浓度随 NO生成增加而减少 ; ( 2) NO生成抑
制剂能抑制 L TN刺激的小鼠腹腔巨噬细胞 NO生成和细胞内 GSH水平降低 ; ( 3) GS H去除剂能抑制巨噬细胞
NO生成。结论　研究表明 L TN促进小鼠腹腔巨噬细胞 NO生成并同时消耗细胞内 GSH,细胞内 GSH水平可能
与 NO的生成有密切关系。提示细胞内 GSH可能起到调节巨噬细胞 NO生成和保护宿主细胞免受 NO介导的细
胞毒作用。
关键词: 香菇多糖 ;巨噬细胞 ;一氧化氮 ;还原型谷胱甘肽
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 03 0245 03
Effects of lentinan on nitric oxide production and intracellular glutathione in
mouse peritoneal macrophages
HOU Gan, HU ANG Di-nan, ZHU Qi-feng
( Institute o f Biochemistr y and Molecular Biolog y, Guangdong Medica l Co llege , Zhanjiang Guangdong 524023, China)
Abstract: Object　 To investig ate the mechanisms of action of lentinan ( LTN ) activ ated mouse peri-
toneal macrophages to produce nit ric oxide ( NO) . Methods　 The ef fects of LTN on NO output and int ra-
cellular g lutathione ( GSH) in mouse peri toneal macrophages and the cor relation o f them were studied. Re-
sults　 ( 1) LTN can signi ficant ly increase production of NO in mouse peri tonea l macrophages, decrease
level o f int racellular GSH follow ed increase o f NO production. ( 2) The above ef fect can be blo cked effi-
cient ly by the NO production inhibitors. ( 3) NO production can be inhibi ted by GSH-low ering drugs. Con-
clusion　 LTN increase NO production wi th depletion of int racellula r GSH in the activ ated mouse peri-
toneal macrophages. It suggested that int racel lula r GSH plays an impor tant role in regula tion of NO pro-
duction and protection of host cells f rom cytotoxic at tack induced by NO.
Key words: lentinan ( LTN) ; macrophages; ni t ric o xide ( NO) ; gluta thione ( GSH)
　　香菇多糖 ( lentinan, LTN) 为免疫调节剂 ,能
提高机体免疫防御能力 ,具有宿主介导性抗肿瘤、抗
病毒等作用 [ 1]。我们曾报道 LTN能促进小鼠腹腔
巨噬细胞一氧化氮 ( NO ) 生成 [ 2]。为进一步探讨
LTN的免疫调节作用及其机制 ,观察了 LTN对小
鼠腹腔巨噬细胞 NO生成和细胞内还原型谷胱甘
肽 ( GSH) 的影响及其机制。
1　材料和方法
1. 1　药品及试剂:香菇多糖粉针剂 ( 1 mg /瓶 ,日本
森下制药株式会社产品 ) , RPM I-1640培养基 ( Gib-
co产品 ) ,小牛血清 (超级 ,杭州四季青生物工程材
料研究所产品 ) ,无酚红 RPM I-1640培养基、内毒
素脂多糖 ( lipopoly saccha ride, LPS)、 1-bromo-oc-
tane ( BrO )、 ethacrynic acid ( ET A)、 5′, 5′-二硫代
双-( 2-硝基苯 甲酸 ) ( DTN B) ( Sigma 产品 ) ,
buthionine sulphoximine ( BSO, Aldrich 产品 ) ,
N
G-mono- methyl-L-a rginine ( L -NMA, Ca l-
biochem-Beh ring Co rp. 产品 ) ,放线菌素 D ( acti-
nomycin D, Sino-American bio tec产品 ) ,放线菌酮
( actidione, Fluka产品 ) ,其余为国产分析纯试剂。
1. 2　动物: 昆明种小鼠 ,雌性 , 7～ 8周龄 ,体重
20～ 25 g ,由本院动物中心提供。
1. 3　小鼠腹腔巨噬细胞制备:小鼠 ip无血清 RP-
M I-1640培养液 2 mL,颈椎脱臼处死 , 75% 酒精浸
泡 15 min,收集腹腔内液 , 1 000 r /min离心 5 min
收集细胞 ,用含 10% 灭活小牛血清的 RPM I-1640
·245·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 3期
收稿日期: 2001-05-09基金项目:广东省重点学科基金资助 ( 9708)作者简介:侯　敢 ( 1963-) ,女 ,湖南湘西人 ,讲师 ,硕士 , 1988年毕业于湖南医科大学临床医学专业 ,从事衰老生物化学研究。
Tel: 0759-2388895
培养液调整细胞浓度至 1× 106 /mL,取 6孔细胞培
养板 ,每孔加细胞悬液 5 mL,置 5% CO2、 37℃ 培
养 5 h,倾去培养液后 ,再用无酚红 RPM I-1640培
养液洗去未贴壁细胞 ,即为所需的巨噬细胞。每孔加
5 mL含 10% 小牛血清的无酚红 RPM I-1640培养
液 ,按所需剂量加入药物进行培养。
1. 4　巨噬细胞 NO生成量的测定: 根据 Griess反
应测定细胞培养上清液的 NO-2量 ,间接反映巨噬细
胞的 NO生成量 [ 3]。
1. 5　细胞内 GSH测定:采用 DTNB比色法。参照
Chigo等 [4 ]的方法裂解细胞 ,并进行比色测定。
1. 6　统计分析:采用 SYSTA T统计软件进行统计
分析。
2　结果
2. 1　 LTN对巨噬细胞 NO生成和细胞内 GSH的
影响:分别以 1. 0, 10, 100 mg /L终浓度 LTN进行
实验 ,以 PBS为空白对照 , 20μg /L LPS阳性对照。
于培养 24 h取细胞培养液测定 NO-2浓度 ,并收集
各孔细胞测定 GSH,结果见表 1。可见 LTN能刺激
小鼠腹腔巨噬细胞的 NO生成 ,且细胞内 GSH随
NO生成量增加而减少。
表 1　 LTN 对巨噬细胞 NO生成和细胞
内 GSH的影响 (x± s, n= 6)
组　别 剂　量
( mg /L)
NO-2 (μmol /L) GSH (μmol /L)
PBS - 3. 80± 0. 57 5. 93± 0. 51
L TN 　 1. 0 5. 98± 0. 65* 5. 44± 0. 58
L TN 10 10. 51± 0. 84* 4. 51± 0. 49*
L TN 100 18. 42± 0. 79* 4. 07± 0. 58*
L PS 　 0. 02 22. 40± 0. 88* 3. 76± 0. 43*
　　与 PB S组比较: * P < 0. 01
2. 2　 NO合成抑制剂对巨噬细胞 NO生成和细胞内
GSH的影响: 用终浓度为 100μg /L LTN处理小鼠
腹腔巨噬细胞 ,同时分别加入放线菌素 D、放线菌酮
和 L-NMA共同培养。 24 h后取细胞培养液测定
NO
-
2浓度 ,并收集各孔细胞测定细胞内 GSH,结果见
表 2。可见 NO合成抑制剂能抑制 LTN诱导的小鼠
腹腔巨噬细胞 NO生成和细胞内 GSH含量减少。
表 2　 NO合成抑制剂对 LTN作用的巨噬细胞 NO
生成和细胞内 GSH的影响 ( x± s, n= 6)
组　别 NO-2 (μmol /L) GSH (μmol /L)
LTN 18. 28± 0. 72 4. 05± 0. 44
LTN+ 放线菌素 D 5. 78± 0. 65* 5. 54± 0. 37*
LTN+ 放线菌酮 6. 53± 0. 51* 5. 75± 0. 56*
LTN+ L-NM A 5. 42± 0. 48* 5. 45± 0. 50*
　　与 LTN组比较: * P < 0. 01
2. 3　 GSH去除剂对巨噬细胞 NO生成和细胞内
GSH的影响:用终浓度为 100μg /L LTN处理小鼠
腹腔巨噬细胞 ,同时分别加入 BSO ( 200μmol /L)、
BrO ( 60μmo l /L)及 ET A ( 60μmol /L)共同培养。
24 h后取细胞培养液测定 NO-2浓度 ,结果见图 1。
可见 GSH去除剂能抑制 LTN诱导的小鼠腹腔巨
噬细胞 NO生成。
图 1　 GSH去除剂对 LTN作用的巨噬细胞
NO生成的影响 ( x± s , n= 6)
3　讨论
巨噬细胞是机体免疫系统中的重要成分之一 ,
作为免疫效应细胞起作用 ,参与免疫系统的调节。许
多淋巴因子 ,如干扰素 -γ、白介素、肿瘤坏死因子及
内毒素脂多糖 ( LPS)等均能活化巨噬细胞 ,活化后
的巨噬细胞分泌近百种生物活性物质 ,如 NO、白介
素-1,肿瘤坏死因子、活性氧等 ,其中许多与免疫应
答及炎症有关 ,并通过 L-精氨酸途径合成 NO,起
到杀伤多种病原体及肿瘤细胞的作用 [ 5]。
GSH是细胞内最丰富的低分子巯基化合物 ,并
起到保护细胞免受氧化攻击的作用。 细胞内 GSH
还广泛参与膜转运、蛋白质合成、核酸合成、基因表
达和信息传递等重要过程。 NO能与巯基 ( -SH)反
应 ,与 GSH 反应可生成 S-亚硝基谷胱 甘肽
( GSNO)。 近年的研究表明 ,细胞内 GSH的氧化还
原状态和浓度起到调节巨噬细胞 NO合成和对抗
NO介导的对宿主的细胞毒的作用。在 LPS和干扰
素-γ激活的鼠巨噬细胞中 , NO生成增加而细胞内
GSH减少 [6 ]。巯基 ( -SH)在鼠巨噬细胞中起到对抗
NO介导的细胞毒作用 [7 ]。去除 GSH的巨噬细胞在
LPS和干扰素 -γ激活时 NO生成量仅为未去除
GSH的巨噬细胞的 60%。 本研究结果显示 , LTN
能刺激小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放大量 NO,同
时细胞内 GSH含量随 NO生成增加而减少 ,具一
定的相关性。与上述观点相符。
目前已知 ,巨噬细胞主要由诱生型一氧化氮合
酶 ( inducible-type NO syntha se, iNOS)通过 L-精
氨酸途径合成 NO, 干扰素 -γ及 LPS等多种因素
·246· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 3期
能诱导巨噬细胞从头合成 NO [9 ]。本研究结果显示 ,
RN A转录抑制剂放线菌素 D、蛋白质合成抑制剂
放线菌酮和 NO S竞争性抑制剂 L-NM A,均能有效
抑制 LTN所诱导的巨噬细胞 NO生成和细胞内
GSH的减少。 另一方面 ,使用 GSH去除剂 BSO、
BrO和 ET A亦能减少 LTN所诱导的巨噬细胞
NO生成。提示在 L TN激活巨噬细胞过程中 ,细胞
内 GSH可能起到调节巨噬细胞 NO合成及保护宿
主细胞免受 NO介导的细胞毒作用。
参考文献:
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小儿抗痫胶囊中 α-细辛醚的药物动力学研究
张德芹1 ,马　融2 ,刘昌孝 3 ,戚爱棣 1
( 1. 天津中医学院 中药系 ,天津　 300193;　 2. 天津中医学院第一附属医院 ,天津　 300193;　 3. 天津药物研究
院 ,天津　 300193)
摘　要: 目的　测定小儿抗痫胶囊中主要有效成分 α-细辛醚在大鼠体内的血药浓度 ,并根据血药浓度 -时间配对资
料测算其体内药代动力学参数。方法　采用 HPLC测定 ig给药 1. 25, 2. 5, 5 g /kg不同剂量小儿抗痫胶囊后 ,大鼠
体内 α-细辛醚的血药浓度。血药浓度数据采用 3P97药代动力学软件进行参数模拟。 结果　小儿抗痫胶囊中有效
成分 α-细辛醚在大鼠体内的动力学过程可用一级动力学过程的一室开放型模型来描述。低、中、高 3个不同剂量组
高峰血药浓度 (Cmax )分别为 0. 46, 0. 83, 1. 33μg /mL ,达峰时间 ( Tpeak )分别为 81. 94, 88. 85和 96. 12 min,血药浓
度时间曲线下面积 (AUC )分别为 152. 75, 225. 16和 393. 21μg· min /m L。结论　本研究建立的 HPLC测定大鼠
ig不同剂量小儿抗痫胶囊后 α-细辛醚血药浓度的实验方法简便、快速、灵敏 ,血浆中内源性物质及复方各组分药物
不干扰测定。 该研究可为小儿抗痫胶囊在临床和量化研究提供可靠的依据。
关键词: HPLC;小儿抗痫胶囊 ;α-细辛醚 ;药代动力学
中图分类号: R285. 61　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 03 0247 04
Pharmacokinetics study ofα-asarone in XIAOER KANGXIAN CAPSULE*
ZHANG De-qin
1
, M A Rong
2
, LIU Chang-xiao
3
, QI Ai-di
1
( 1. Depar tment of Chinese Materia Medica, Tianjin Co lleg e of TCM , Tianjin 300193, China; 2. First Affilia ted Hospital o f
Tianjin Colleg e o f TCM , Tianjin 300193, China; 3. Tianjin Institute o f Pha rmaceutical Research, Tianjin 300193, China )
Key words: HPLC; XIAOER KANGXIAN CAPSULE; α-asarone; pha rmacokinetics
* XIAOER KANGXIAN CAPSULE is a Chinese herbal preparation wi th Rhizoma Acori Tatarinowii ,
Rhizoma Gastrodiae , etc. . It is used against epilepsy and convulsion of children.
·247·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 3期
收稿日期: 2001-07-17基金项目:天津市卫生局中医、中西医结合科研基金资助课题 ( 200042)作者简介:张德芹 ( 1963-) ,女 (满族 ) ,硕士 ,天津中医学院中药系副教授 ,主要从事中药学教学及中草药药代动力学研究工作 ,参编医著 4部 ,在国内公开刊物发表论文 12篇。