全 文 ：·药材与资源·
红景天属 4 种植物 RAPD 分析与分类鉴定
胡挺松1, 陆一鸣1, 2, 马兰青1, 李彦舫1Ξ
(11 中国人民解放军军需大学 植物基因工程研究中心, 吉林 长春　130062;
21 第二军医大学 基础医学部医学遗传学教研室, 上海　200433)
摘　要: 目的　用RA PD 技术对红景天属 (R hod iola L 1) 的大花红景天 R 1 crenu la ta、长鞭红景天 R 1 f astig ia ta、狭
叶红景天 R 1 k irilow ii 和高山红景天 R 1 sacha linensis 4 种药用植物进行分子水平鉴定。方法　CA TB 法提取红景
天 属 原 植 物 总 DNA , 以 200 条 随 机 引 物 进 行 随 机 扩 增。结 果 　 用 O PA 4 (AA TCGGGCT G )、O PB7
(GGT GA CGCA G)、O PB18 (CCA CA GCA GT )、O PX14 (A CA GGT GCT G) 和O PZ13 (GA CTAA GCCC ) 作随机扩增
引物进行随机扩增时, 可得到识别这些物种基因组DNA 的多态片段。结论　RA PD 法能有效地鉴别红景天类药
材, 把大花红景天、长鞭红景天、狭叶红景天和高山红景天区分开。
关键词: 红景天属; RA PD; 分类鉴定
中图分类号: R 282171013　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 11 1286 04
Iden tif ica tion of four R hod iola L 1 plan ts by RAPD
HU T ing2song1, LU Y i2m ing1, 2, M A L an2qing1, L I Yan2fang1
(11R esearch Center of P lan t Genetic Engineering of Q uarterm aster U niversity of Peop le’s L iberat ion A rm y,
Changchun 130062, Ch ina; 21D epartm ent of M edical Genetics, D epartm ent of BasicalM edicine,
Second M ilitary M edical U niversity, Shanghai 200433 Ch ina)
Abstract: Object　To iden t ify the crude drugs of R hod iola L 1, including R 1 crenu la ta , R 1 f astig ia ta
R 1 k irilow ii, and R 1 saccha rinensis by RA PD 1 M ethods　Genera l DNA w as iso la ted from fresh leaves of
the fou r species in R hod iola L 1 by CTAB and the random amp lif ied po lymo rph ic DNA (RA PD ) w as u sed
to iden t ify them 1 Results　T he po lymo rph ic fragm en t of DNA fingerp rin ts of d ifferen t species w as com 2
pared by p rim ers O PA 4 (AA TCGGGCT G ) , O PB 7 ( GGT GA CGCA G ) , O PB 18, O PX14 (A CA GG2
T GCT G) , and O PZ13 (GA CTAA GCCC ) 1 T he studies show ed that they have differen t rela t ion sh ip s in
heredity and the m ethod of RA PD can be u sed to iden t ify them easily1 Conclusion　T he raw m edicinal m a2
terica ls R hod iola L 1 can be iden t if ied by RA PD , and the above2m en tioned fou r species are d ist ingu shed1
Key words: R hod iola L 1; RA PD; classif ied iden t if ica t ion
　　红景天属 (R hod iola L 1) 植物为多年生草本或
亚灌木, 世界有 90 余种, 我国有 70 多个种, 常具肉
质根及根状茎, 是近年来新开发的中草药, 主要以其
根和根茎入药, 主要药用成分有红景天苷、酪醇等。
具有抗缺氧、抗微波辐射、抗衰老、调节内分泌系统
等作用[1, 2 ]。红景天植物来源复杂, 商品药材种类多。
但红景天各个种功用不一, 不同种之间替代使用, 用
药混乱[1, 2 ]。因此, 有必要进行全面评价, 确定种类的
优劣和功效取舍。对红景天药材的分类和正确鉴定
就尤为重要。本研究利用RA PD 技术[3 ]对市场常见
的大花红景天 R 1 crenu la ta (Hook. f. et T hom s. )
S. H. Fu、长鞭红景天 R 1 f astig ia ta (Hook. f. et
T hom s. ) S. H. Fu、狭叶红景天R 1 k irilow ii (R eg1)
M ax im、高山红景天 R 1 sacha linensis A. Bo r. 进行
了分子水平鉴定, 为红景天类药材的分子鉴定提供
依据, 同时初步探讨了这 4 种植物之间的亲缘关系。
1　材料与方法
111　材料: 大花红景天、长鞭红景天、狭叶红景天、
高山红景天 (表 1) , 每个种各取 5 株植物的幼嫩叶
片, 混合提取总DNA。
·6821· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 11 期 2004 年 11 月
Ξ 收稿日期: 2004202202
作者简介: 胡挺松 (1977—) , 男, 四川省眉山人, 在读硕士研究生, 主要从事植物分子生物学方面的研究3 通讯作者　T el (0431) 6986038
表 1　实验材料的来源
Table 1　Source of exper imen ta l mater ia ls of Rhod iola L 1
编号 名　称 产　地
1 大红花景天R 1 crenu la ta 四川甘孜州
2 长鞭红景天R 1 f astig ia ta 四川甘孜州
3 狭叶红景天R 1 k irilow ii 四川甘孜州
4 高山红景天R 1 sacha linensis 吉林长白山
112　仪器与试剂: PCR 仪 (德国B iom etra) ; 恒压恒
流电泳仪 (北京六一仪器厂) ; 凝胶成像系统 (上海
T annon 公司) ; 电热三用水箱 (北京市医疗设备厂) ;
离心机(上海安亭科学仪器厂) ; CTAB (Bebco 公司)、
T ris (Bebco 公司)、ED TA (Bebco 公司)、T aq 酶 (北
京鼎国生物技术公司)、dN T P (Bebco 公司)、RA PD
随机引物(Operon 公司)、M arker (T akara 公司)。
113　随机引物: Operon 公司生产的A、B、H、G、J、
K、S、X、Y、Z 等组的 200 条引物经筛选, 得到扩增
条带清晰、多态性较好的 38 条随机引物 (O PA 4、
O PA 10、O PB 7、O PB 15、O PB 18、O PH 3、O PH 4、
O PH 12、O PH 15、O PH 18、O PG3、O PG4、O PG12、
O PG13、O PG16、O PG17、O PJ 1、O PJ 10、O PJ 14、
O PJ 18、O PJ 19、O PJ 20、O PK7、O PK10、O PK11、
O PS3、O PS11、O PS19、O PX3、O PX9、O PX14、
O PX15、O PY1、O PY15、O PZ11、O PZ13、O PZ18、
O PZ20) , 表 2 列出了其中的 14 条引物序列。
表 2　引物序列及其扩增带数
Table 2　Pr imers used for RAPD and ampl if ied band
引物名称 引物序列 5′- 3′ 扩增带数
O PA 04 AA TCGGGCT G 5～ 7
O PB07 GGT GA CGCA G 5～ 9
O PB18 T GA GT GGGT G 5～ 9
O PH 18 GAA RCGGCCA 5～ 7
O PJ10 AA GCCCGA GG 7～ 8
O PJ19 GGA CA CCA CT 3～ 6
O PJ20 AA GCGGCCTC 7～ 8
O PK10 GT GCAA CGT G 5～ 6
O PS03 CA GA GGTCCC 4～ 7
O PS11 A GTCGGGT GG 2～ 5
O PX14 A CA GGT GCT G 5～ 8
O PY15 A GTCGCCCT T 7～ 8
O PZ13 GA CTAA GCCC 6～ 12
O PZ20 A CT T T GGCGG 4～ 8
114　DNA 的提取: 采用 CTAB 法并稍加改进[4 ]。
取011～ 0125 g 新鲜幼嫩叶片, 于液氮中迅速研磨
成粉。将冻粉迅速转入7 mL 离心管中, 加入3 mL
65 ℃ 预 热 提 取 缓 冲 液 ( 2 gö100 mL CTAB ,
114 mo löL N aC l, 20 mmo löL ED TA pH 810,
100 mmo löL T ris. C l pH 810) , 混匀, 于65 ℃保温
30 m in, 其间轻柔搅动2～ 3次。加入等体积的氯仿2
异戊醇 (24∶1) 抽提两次, 轻缓颠倒混匀, 静置
10 m in, 10 000 röm in离心10 m in, 吸上清液于另一
离心管中, 加入2ö3倍体积的异丙醇沉淀DNA , 轻缓
颠倒混匀, 室温下放置15 m in。 10 000 röm in离心
10 m in, 弃上清液。用1 mL 70% 乙醇洗涤沉淀 2 次,
室温下微干, 溶于500～ 700 ΛL T E 缓冲液。加入 50ΛgömL R naseA , 37 ℃保温 1 h。用等体积的氯仿2
异戊醇 (24∶1) , 抽提 1 次。上清液中加入终浓度为
012～ 014 mo löL N aC l, 2 倍体积的无水乙醇沉淀
DNA , - 20 ℃放置约 30 m in, 12 000 röm in 离心
10 m in, 弃上清液。用 70% 乙醇洗涤沉淀 2～ 3 次,
自然干燥后溶于 50～ 100 ΛL T E, 经 018% 琼脂糖
凝胶电泳检查后, - 20℃保存备用。
115　RA PD 分析: 扩增反应在 25 ΛL 的体系中进
行, 其中含有 10×PCR 缓冲液 (含M g2+ ) 215 ΛL、
dN T P (10 mmo löeach) 015 ΛL、随机引物 (8 pmo lö
次) 110 ΛL、T aq 酶 (2 U öΛL ) 015 ΛL、模板DNA (稀
释 10 倍) 210、1815 ΛL 双蒸水。
PCR 反应程序[3 ]: 经 94 ℃加热 4 m in, 使模板
DNA 变性, 然后进入下列温度循环: 94 ℃变性45 s, 37
℃退火 45 s, 72 ℃延伸1 m in, 共进行40 个循环。循环
结束后, 在72 ℃延伸10 m in。扩增产物10 ΛL 加10×
L oading 缓冲液, 经 1. 0% 琼脂糖凝胶电泳, EB 染色
后, 紫外灯下观测电泳结果并拍照。扩增反应重复 2 次。
116　多态性数据的分析: 扩增产物按条带有无分别
赋值, 强反应带记“1”, 弱反应带重复出现记“1”, 弱
反应带出现但不重复记“0”, 没有带记“0”, 得RA PD
反应的原始数据。计算供试材料间 Jaccared 遗传相
似系数 (GS) [5 ] , GS= aö(a+ b+ c) , 其中 a 为 2 种共
有的带数、b 为B 种有而C 中没有的带数、c 为C 种
有而B 中没有的带数。利用 SPSS1110 统计分析软
件进行聚类分析。
2　结果与分析
211　基于RA PD 用红景天DNA 的提取: RA PD 具
有操作方便, 灵敏快捷的优点, 但存在扩增重复性较
差的问题。而DNA 的提取质量直接影响RA PD 的
重复性、稳定性, 综合红景天DNA 提取结果, 样品
量以每 7 mL 离心管 3 mL 提取液中加 011～ 0125 g
鲜样品较为适宜; 在加提取液前用液氮研磨, 研磨时
尽量细且均匀, 并使冻粉呈干粉状; 因红景天含较多
的酚类物质, 可以加少量的抗氧化剂Β2巯基乙醇, 经
多次氯仿2异戊醇 (24∶1) 抽提, 异丙醇和乙醇两次
·7821·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 11 期 2004 年 11 月
沉淀后可得到色泽较好纯度较高的DNA (图 12A ) ,
符合RA PD 的扩增要求。
212　红景天 RA PD 扩增体系的优化: 由于红景天
DNA 的 RA PD 扩增未见报道, 对于一个新类群的
RA PD 分析, 确定最适模板DNA 的扩增浓度是关
键的, 不同的类群有不同的最佳范围[6 ]。除DNA 的
纯度与浓度, 引物浓度、M g2+ 浓度、dN T P 浓度、T aq
来源和用量、扩增程序与循环周期以及所用的 PCR
扩增仪型号均能影响RA PD 反应的扩增结果[7 ] , 这
些条件稍有变化, 容易产生假扩增带, 结果完全不一
样, 影响实验的稳定性, 重复性。对以上各影响因素
通过梯度分析, 进行优化, 发现 T aq 酶 (2 U öΛL ) 用
量从 015～ 110 ΛL 均可得到较好的扩增, 同时不同
厂商不同批次的 T aq 酶对RA PD 扩增有较大影响。
因此, 应采用同批次的 T aq 酶进行RA PD 试验。对
于红景天 RA PD 来说, 在本实验室的 PCR 扩增仪
型号和RA PD 扩增程序与循环周期下, 采用 115 项
下的RA PD 扩增条件, 在扩增带型和清晰度上均获
得很好的重复。为红景天DNA 水平的遗传多态性
分析和种类分子鉴定提供了科学依据。
213　红景天DNA 水平多态性分析: 200 条引物经 筛选, 得到较好扩增的引物有 38 条, 共扩增检测到302 个位点, 其中单态性位点 90 个, 多态性位点 212个, 占 70120% , 片段大小在 200～ 3 000 bp。根据302 个位点的有无, 按 116 项下建立种系发生图 (图2)。可见大花红景天与长鞭红景天先聚为一支, 狭叶红景天与高山红景天聚为一支, 最后聚在一起。说明大花红景天与长鞭红景天亲缘关系较近, 狭叶红景天与高山红景天亲缘关系较近, 而大花红景天、长鞭红景天与狭叶红景天、高山红景天亲缘关系较远。聚类结果与形态学分类相似, 但有差异。从植物体的叶形、根状茎等形态学特点分析, 大花红景天与狭叶红景天、高山红景天相近, 而与长鞭红景天亲缘关系较远。由于RA PD 扩增的结果只能从相似性系数或遗传距离去做表征分析 (表 3) , 所得树状图不一定能真正反应种属间系统发育关系, 同时在种间的DNA变异水平很高, 用一个或几个个体代表一个种可能造成结果的很大偏差, 尤其是药用植物是针对有药用价值的分类单元进行分析。因此, 笔者认为在应用RA PD 方法对药用植物种间亲缘关系的研究, 尤其是在对类似红景天这样的大属分类时, 要考虑形态学的差异以及前人的观点进行全面评价。
图 1　基因组D NA 提取结果及扩增D NA 指纹图谱
F ig. 1　Result of D NA extracted and f ingerpr in ts of ampl if ied D NA with RAPD pr imers
·8821· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 11 期 2004 年 11 月
图 2　用遗传相似系数聚类分析产生的树状图
F ig. 2　D endrogram of four spec ies in
Rhod iola L. with GS analysis
表 3　4 种红景天的分类群间 Jaccared 遗传相似系数
Table 3　Jaccared genetic sim ilar ities (GS)
of four spec ies in Rhod iola L.
1 2 3 4
1 1
2 01615 1
3 01556 01547 1
4 01531 01506 01609 1
214　红景天的分子鉴定: 红景天植物来源复杂, 商
品药材种类多。红景天各个种功用不一, 不同种之间
替代使用, 用药混乱[1, 2 ]。因此, 对红景天药材的分类
和正确鉴定就尤为重要。从红景天的RA PD 扩增结
果显示用O PA 4、O PB 7、O PB 18、O PX14、O PZ13 作
引物可将大花红景天、长鞭红景天、狭叶红景天及高
山红景天 4 种红景天属植物区分开, 每种红景天均
有一特异片段扩增 (图 1B～ F)。这些结果得到了很
好的重复, 其特有位点能够将这 4 种红景天区分开,
说明应用 RA PD 分析方法对红景天种类的鉴定是
切实可行的。
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甘肃陇西道地药材蒙古黄芪规范化栽培技术规程初步研究
陈志国1, 马世震13 , 陈桂琛1, 张鼎新2, 李　毅1, 周昌范1Ξ
(11 中国科学院西北高原生物研究所, 青海 西宁　810001; 21 甘肃省陇西县农业技术推广中心, 甘肃 巩昌镇　748100)
摘　要: 目的　规范蒙古黄芪种植、加工, 使蒙古黄芪生产达到优质高产无公害的标准, 与国际接轨, 使中药走向世
界。方法　通过对陇西县及其毗邻地区黄芪产区的种植历史、基本生态环境、种质资源、良种选育的调查和试验, 并
取样对活性成分进行检测。结果　改变了产区传统生产中存在的不足, 形成了蒙古黄芪规范化种植规程。结论　通
过规范化种植生产出来的蒙古黄芪具有优良的品质。
关键词: 蒙古黄芪; 规范化种植 (SO P) ; 优质高产无公害; 种质资源
中图分类号: R 282121　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 11 1289 05
Standard opera ting procedure for A straga lus m em branaceus var. m ongholicus
of dom estic m ed ic ina l ma ter ia ls in L ongx i, Gan su Prov ince
CH EN Zh i2guo 1, M A Sh i2zhen1, CH EN Gu i2chen1, ZHAN G D ing2x in2, L I Y i1, ZHOU Chang2fan1
(11N o rthw est Inst itu te of P lateau B io logy, Ch inese A cadem y of Sciences, X in ing 810001, Ch ina;
21L ongxi A gro techn ical Ex tension Center of Gansu P rovince, Gongchangzhen 748100, Ch ina)
Abstract: Object　To study the standard opera t ing p rocedu re (SO P ) fo r A strag a lus m em branaceus
(F isch1) Bge1 var1 m ong holicus Beg1 H siao , so as to m ake its h igh quality, h igh yield, non2hazard, and
·9821·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 11 期 2004 年 11 月
Ξ 收稿日期: 2004202213
基金项目: 中国科学院兰州分院与甘肃省院地合作项目“甘肃省陇西黄芪GA P 基地种植技术研究”课题; 科技部西部重大项目“中藏药
材规范化栽培技术研究”; 中国科学院专题 (KSCX22120122203) ; 中国科学院“西部之光”人才培养计划“青藏铁路高海拔地区
植物繁育及其栽培技术研究”专题
作者简介: 陈志国 (1963—) , 男, 吉林省公主岭市人, 中国科学院西北高原生物研究所副研究员, 硕士, 主要从事农作物育种和栽培研究。
T el: (0971) 6143763; 13007793142　E2m ail: czg0403@ sina. com; zgchen@nw ipb. ac. cn3 通讯作者