全 文 ：1-内标　 2-大黄素　 3-大黄酚　 4-大黄素甲醚　 5-大黄酸
1-internal s tandard 2-emodin 3-ch rysophanol 4-ph yscion 5-rhein
图 2　温脾汤中大黄游离蒽醌的 HPCE图谱
Fig. 2　HPCE chromatogram of free anthraquinone in WPD
4. 2　试验结果表明 ,附子先煎 15～ 60 min后 ,再经
复方煎煮 ,其乌头碱含量已远低于《中华人民共和国
药典》 2000年版一部乌头碱限量规定 ,日服汤剂中
乌头碱的总量也低于口服乌头碱的中毒限量 [ 4]。综
合考虑 ,认为附子以先煎 30 min为宜 ,能保证临床
用药的安全有效。
4. 3　比较了附子单煎与混煎对乌头碱含量的影响 ,
结果表明混煎液中乌头碱含量明显低于单煎液 ,说
明在复方煎煮过程中有可能发生化学反应 ,导致乌
头碱含量降低 ,从而为附子与干姜、甘草共煎可降低
其毒性的理论提供了试验依据。
4. 4　温脾汤复方中大黄的后下试验结果与单味大
黄煎煮的结果基本一致 [5 ] ,表明大黄无论是单味煎
煮 ,还是在复方后下 ,煎煮时间都不宜过长。 考虑到
大黄若不经浸泡 ,直接投入煮沸的水中 ,容易产生
“寒热隔 ”的效应 [6 ] ,因此在本试验中大黄均浸泡
30 min后再入汤剂。
4. 5　内标物选择对氨基苯磺酸 ,是由于其在水中的
溶解度较大 ,且在 254 nm处有较大吸收 ,对各待测
成分峰不产生干扰 ,重现性好。
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甘草皂苷生物转化的研究
吴少杰 1 ,杨志娟 1 ,朱丽华 1 ,金风燮 2
( 1. 华北煤炭医学院 ,河北 唐山　 063000; 2. 大连轻工业学院 ,辽宁 大连　 114001)
摘　要: 目的　对甘草皂苷糖链进行有选择的部分水解 ,以得到单葡萄糖醛酸基甘草皂苷元。方法　生物酶水解法
和液体发酵转化法。 结果　利用试验菌最佳产酶条件所产的酶水解甘草皂苷 ,获得产物的产率为 23. 7%。 在液体
发酵法中 ,产物的产率约为 10%。 产物可用 85% 乙醇从 HP20树脂柱上洗脱下来 ,同时未转化的甘草皂苷可用
50% 乙醇洗脱而循环利用。 结论　该方法简洁方便 ,提高了甘草皂苷的转化率。
关键词: 甘草皂苷 ;甘草皂苷元 ;单葡萄糖醛酸基甘草皂苷元 ;生物转化
中图分类号: R282. 15; R286. 02　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 06 0516 03
Study on biotransformation of glycyrrhizin
WU Shao-jie, YAN G Zhi-juan, ZHU Li-hua, JIN Feng-xie
( 1. No rth China Coal Medical Co llege , Tang shan 063000, China; 2. Dalian Co lleg e of Light Indust ry , Dalian 114001, China)
Key words: gly cy rrhizin; g lycyrrhetinic acid; monog lucuronyl-glycy rrhetinic acid ( MGGA); bio t rans-
forma tion
·516· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
收稿日期: 2002-07-19
　　甘草皂苷是甘草中主要的生理活性成分 ,其基
本结构是由一个齐墩果烷型五环三萜在第 3位连接
2分子的葡萄糖醛酸构成的。 研究表明皂苷上的糖
链对其生理功能有重要影响 ,去除部分糖基往往能
改变或提高其生理功能 [1, 2 ]。在甘草皂苷中也得到类
似结果:甘草皂苷失去 2分子糖基得到的甘草皂苷
元 ,某些生理活性要强于甘草皂苷 [3 ]。相对甘草皂苷
元 ,如果仅去除 1分子糖基 ,就得到单葡萄糖醛酸基
甘草皂苷元 ( MGGA) ,但对其研究很少 ,一个重要
原因就是制备困难 ,虽然糖链化学水解方法很多 ,但
一般只形成皂苷元 ,很难有选择地去除部分糖基 [4 ]。
为了有选择性地部分水解甘草皂苷糖链制备
GAMG,我们尝试了生物转化的方法 ,分别利用酶
水解法及液体发酵转化法进行转化 ,并利用柱色谱
技术提纯产物。
1　设备与材料
　　 UV-102-02型分光光度计 (日本岛津 ) ; HSC-
20R-A高速冷冻离心机 (吉林图们市离心机厂 ) ;
CS-930薄层扫描仪 (日本岛津 ) ;薄层色谱板 Si lica
Gel 60-F254 (德国 Merck公司 ) ; HP20树脂 (日本三
菱化工 )。
甘草皂苷、甘草皂甘元 (池田糖化株式会社 )。
菌种为米曲霉 39和黑曲霉 UV-48。药材甘草 Gly-
cyrrhiza uralensis Fischer. 购自新疆石河子地区。
其他药品均为分析纯。
　　 (诱导产酶 ) 固体培养基: 甘草粉 5 g ,麦麸皮
20 g ,水 20 mL;液体发酵培养基:含 0. 5% 甘草皂
苷的 5°麦芽汁。
2　方法与结果
2. 1　酶的提取及酶活测定: 经预试验 ,两种菌都能
被甘草皂苷诱导出较高活力的甘草皂苷水解酶 ,故
将两菌接入固体培养基培养 3 d后用 pH5. 0的醋
酸缓冲液浸提出酶蛋白 ,再经离心、硫酸铵 (饱和度
65% )盐析、透析得酶液。
测定酶活时 ,反应底物为甘草皂苷 ,根据预试
验 ,两种酶的水解产物均含甘草皂苷元 ,故以甘草皂
苷元的量来反映甘草皂苷水解的酶活力。 测定方法
见文献 [5 ]。
酶活力定义为:在 40℃ pH5. 0的条件下 ,每小
时生成 1μg甘草皂苷元所需的酶液量 ( mL) 为一
个酶活力单位。
2. 2　酶诱导产生的条件
2. 2. 1　酶诱导的培养温度:不同培养温度下两种菌
所产生的酶水解甘草皂苷的活性见表 1。
表 1　培养温度对酶活的影响
Table 1　 Inf luence of culture temperature
on enzyme activity
温度 /℃ 酶　　活米曲霉 39 黑曲霉 UV-48
20 77. 4 16. 7
25 82. 2 22. 6
30 97. 8 26. 1
35 76. 5 14. 7
40 54. 4 14. 1
　　表明: 两种菌在 30℃ 时都显示出较高的酶活
力 ,因此两种菌的最佳培养温度都定为 30℃。
2. 2. 2　酶诱导的培养时间:在实验中 ,发现两种菌
生长速度不一样 ,米曲霉 39比黑曲霉 UV-48要快
一些 ,因此取样时间稍做调整。结果见表 2。
1-甘草皂苷　 2-甘草皂苷元
3-黑曲霉 UV-48酶解液
4-米曲霉 39酶解液
1-glycyrrh izin　 2-glycyrrh e-
tinic acid　 3-zymolysi s by
Asper illus niger UV-48
4-zymolysi s by A. oryzae 39
图 1　甘草皂苷酶解液
的薄层色谱图
Fig. 1　 TLC chromatog-
ram of glycyrr-
hizin after zy-
molysis
表 2　培养时间对酶活的影响
Table 2　 Inf luence of culture time on enzyme activity
时间 /h 米曲霉 39酶活 时间 /h 黑曲霉 UV-48酶活
24 59. 4 22 11. 8
33 57. 2 45 17. 0
40 108. 9 59 25. 0
60 98. 4 70 23. 1
70 58. 2 83 11. 3
　　因此 ,两种菌的最佳培养时间分别为米曲霉 39
为 40 h,黑曲霉 UV-48为 59 h。
2. 3　酶解产物分析: 将甘
草皂苷用 pH5. 0的醋酸缓
冲液配成 2 mg /m L的溶
液 ,取 0. 5 mL,加入酶液
0. 5 m L,于 40℃ 反应 24
h后取 0. 1 mL反应液于
小离心管中 ,加入 0. 2 mL
甲醇以沉淀酶蛋白 ,离心 ,
取上清液进行薄层色谱分
析。展开剂为正丁醇-冰醋
酸-水 ( 4∶ 1∶ 2) ,展距约 6
cm。然后参照文献 [6 ]进行薄
层扫描 ,其中 λS= 254 nm,
λR= 360 nm ,反射锯齿法扫
描步距 0. 1 mm,狭缝 2
mm × 2 mm,
SX= 2。 结果见图 1和表 3。　　由图 1可见 ,甘草皂苷
的 Rf值为 0. 42, MGGA
的 Rf值为 0. 64,甘草皂苷
元 Rf值为 0. 98。因此 ,米
曲霉 39的酶水解甘草皂苷
只能产生甘草皂苷元 ,不产
生 MGGA,而黑曲霉 UV-
48的酶能生成 MGGA,故
后者是 我们 所希望 的
菌种。另外黑曲霉 UV-48的
·517·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
·518· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月