全 文 ：· 药材 ·
长春花叶片愈伤组织诱导及培养过程中生物碱
合成类型的变化和调节及有关酶的分析
中国协和医科大学
中国医学科学 院 药物研究所 (北京 1 0 0 0 5 0 ) 赵 剑
. 朱蔚华 胡 秋
山西师范大学生物 系 王文科
摘 要 在 4 种不 同培养基上诱导 长春花叶片愈伤组织 发生的过程中 , 叶片中含 量较高的文多灵
( v i n d o l in e ) 和长 春质碱 ( e a t h a r a n t h in e )迅速 降解 至极低水平 , 而在 叶片 中含 量较低 的阿玛 碱 ( a j-
m a l ie in e )和蛇根碱 ( s e r p e n t in e ) 的合成却逐渐增 加 , 同时酸 性和碱 性过 氧化物 酶 ( p e r o x i d a s e ) 活性
呈上升趋势 , 尤其碱性过 氧化物 酶与蛇根碱 和阿玛碱 的相 关性较密切 。 光 照和黑 暗中的变化趋势
基本 一 致 , 但 光照可 提高过 氧化 物酶的 活性 , 对培养物的长春质 碱 、 文多灵和 蛇根碱 的合成 有利 。
不 同的培养基对 生物碱 的合 成影 响较 大 , 2 , 4 一 D 显 著抑制生 物碱的合成 , 持续 光照使 愈伤组 织 的
生长受到抑制 , 使阿玛碱 向其 蛇根碱转化 。
关键词 长春花愈伤组织 叫噪生 物碱 讨氧化物酶
长春花组织和细胞培养已经研究 了很多 洗 干净 , 吸 干 水 分 , 先 用 70 %酒 精灭 菌 2
年 , 但至今仍仅限于中等规模的生物反应器 m in 后 , 转人 0 . 1 %的升汞灭菌 10 m in ,无菌
生产 , 且长春花生物碱 的生物合成途径和调 蒸馏水冲洗 5 次 , 剪成小块 ,接种于 以下 4 种
节有许多不清楚之处 , 所 以 国内外的很多实 诱 导 培养 基 中 : M l : M S + N A A 1 m g / L 十
验室仍在进行研究 [`一 3 〕。 尤其近几年在长春 I A A 1 m g / L + K T 0 . 1 m g / L 十 5 %蔗 糖 +
碱 ( v i n b l a s t i n e ) 的基础上得到新 的半合成抗 0 . 7%琼脂 ; M Z : M S + N A A 1 m g / L + K T
癌药异长春碱 v( in or el ib en ) 具有很大的应用 。 . 1 m g / L + 5%蔗 糖 + 0 . 7写琼 脂 ; M 3 :
潜力 , 市场价格高于紫杉醇 。 而其半合成原料 M S + 2 , 4一 D 1 m g / L + K T o . l m g / L 十 3%
仍需长春质碱和 文多灵 ,使 组织培养这一 可 蔗糖 + 。 . 7%琼脂 ; L l : L s + I A A 1 m g / L +
能的原料来源途径再次受到人们关注 。 从长 6一B A 0 . 1 m g / L + 5%蔗糖 + 0 . 7%琼脂 , 培
春花愈伤组织的诱导 、 继代培养到细胞悬浮 养基在高温灭菌前均调至 p H S . 5 。 每瓶接种
培养这个过程中培养物 的生物碱合成代谢类 物约为 0 . 4 9 。 分别置于 光下和黑暗中培养 ,
型和 能力有了很大变化 , 这一切是如何发生 培养温度均为 23 C 士 2 ` C ,光照周期 1 2 h d/ ,
的还很不清楚 ,本文试 图从愈伤组织的诱导 光强约 2 0 0 卜 。 激素和光 的调节实验用来
和继代培养过程 中的生物碱合成类型的变化 自同一植株的组织系 , 取继代 3 次的该愈伤
和调节及此过程中的相关酶活性变化来探索 组织均匀地接种于 含有不同种类和浓度的生
其原因 。 长素和激动素组合的 M S 培养基含 3 %蔗糖
1 实验材料和方法 和 0 . 7 %琼脂 (激素配 比编号 为 A , B , C , D ,
1
.
1 愈伤组织的诱导 : 取实验室内盆栽的长 E , F ) ,分别置于光下和黑 暗中培养 , 培养基
春花顶芽下第三 片叶 ,用肥皂水和 自来水清 制备和 培养条件与以上相 同 。 愈伤组织诱导
`
A d ` r e s s ’架瓷若i,n梦s“ ` u` e 。 ` M· , e r ·` M ·“ 一 C h ·`… A 。· `一 , 。 ` M ·“ 二 , ” ·`一 ” · k ·` g U· 。` n M ·“ 。 · ` C。 , -再 草药牡少万流竿 3。 卷第 7期 · 5 33 ·
实验每 隔 s d 取一次材料 , 光和 激素调节实
验则在培养 45 d 后取材 , 称鲜重后 , 一部 分
做酶活性分析 ,一部分做生物碱含量分析 , 所
有数据均为 3 次平行重复测定的结 果 , 标准
偏差不超过 10 % 。
1
.
2 组织生长 (率 ) 和酶活性测定 : 组织生长
(率 )用鲜重法规定 , 愈伤组织诱 导试验 中 , 直
接以收获鲜重表示生长量增长 ,组织生长率 -
收获鲜重 /接种鲜重 X I OO% 。 过氧化物酶酶
液提取制备和酶活性测定按前文的方法川 , 碱
J胜过氧化物酶活性测定在 。 . l m ol / L T ir s -
H C I ( p H g
.
0 )缓 冲液中进行 , 酸性过氧化物酶
活性测定在 0 . 05 m ol / L 柠檬酸一磷酸氢二钠
缓冲液 ( p H S . 5) 中进行 。
1
.
3 生物碱的提取和测定 : 按前文图的方法
进行 , 采用外标法测定 , 以 T L C 、 保 留时间 、
共进样和紫外吸收光谱进行几种生物碱的鉴
定 。
2 结果与讨论
2
.
1 长春花叶片愈伤组织诱导发生过程 中
培养 物的生长动态 : 从生长 曲线 图 1 可见 ,
在黑 暗和光照条件下 , 几种诱导培养基均可
刺激叶片产生愈伤组织 ,诱导率均为 1 0 % ,
在 4 种诱导培养基中 , M 3 诱导效果最好 , 愈
伤组织浅黄疏松 ,生长较快 ,愈伤组织发生较
早 , 生长状态最好 。 M Z 诱导效果其次 , 愈伤
组织发生和生长均很好 , 但在光下略有褐化
现象 ,使生长受到一些抑制 。 M l , L l 培养基
诱导效果 一般 , 在光照 培养 中 , 鲜重增长较
慢 , 褐化严重 , 长久光照下组织变绿 , 黑暗中
生长良好 。 光照在早期促进愈伤组织发生和
生长 ,但在后期则对生长有抑制作用 。
1 0 20
培养时间 以 d)
1 0 加培养时间 之 (d )
3 0 4 0
小斗叶汇。东么LOǎ卜肠:à铃平洲感翩
A
一光照 B一黑暗
图 1
l
一
M 1 2
一
M 2 3
一
M 3 4
一
L l M I ~ M 3
、
L I
一 4 种诱导培养基的培养物 (下同 )
长春花叶片愈伤组 织诱导发生过程 中培养物的生长动态
o6绷40312ǎ。启
·月`扫它`留、宋玄纽é心)
塑典位孚粼解划
10 20 3 0 4 0培养时间 亡( d )
瞥翩洲骂州。ǎ昌
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卿傲想娜牟书划
培养时间 (t d)
图 2 长春花叶片愈伤组织诱导发生过程 中培养物的酸性过妞化物酶活性的变化生长动态
2
.
2 长春花叶片愈伤组织诱导发生过程中酸 导的愈伤组织发生较早 , M 3 中培养物便是该
性和碱性过氧化物酶活性的动态变化 : 由图 峰值提前者 ,光下比在黑暗中更有利于愈伤组
2
, 图 3 可见 , 在愈伤组织诱导发生过程中 , 酸 织的发生 , 体现在峰值较早地出现 。 2 , 4一 D 明
性与碱性过氧化物酶活性基本呈上升趋势 。 但 显地抑制 P O D 的活性 ,且在黑暗中的抑制效
在 10 一 20 d 之间不 同培养 基 的培 养物 的 应更强 。 无论是酸性还是碱性过氧化物酶活性
P O D 都有一个峰值 ,观察结果表明 , 此峰值时 在光照下都明显高于黑暗中 。 由图可见 ,各组
间与愈伤组织发生的时间同步 , 例如 M 3 诱 织的碱性 P O D 在均呈曲折上升 。
.
5 3 4
.
1 0 2 0 30 堵养时间 以 d)
图 3 长春花叶片愈伤组织诱导发 生过程中培养物 的碱性过妞化物酶活性的变化动态
2
.
3 长春花叶片愈伤组织诱导发生过程 中 干重 。 由图 5可见 ,蛇根碱则同样也受 2 , 4一 D
阿玛碱和 蛇根碱的动态变化 : 由图 4 可见 , 在 的抑制 , 培养物在 M 3 培养基中蛇根碱 的含
植物叶片中含量较低的阿玛碱当叶片愈伤化 量远比 L l 中的低 , 而在光下的 L l 培养基 中
后开始上升 , 在 L l 和 M Z 培养基 中上升最 蛇根碱则可积累至 1 . 7 54 m g / g 干重 。 在光
快 ,而在 M 3 中最小 , 这可能是 2 , 4一 D 的抑制 照下培 养物的蛇根碱总是 比 黑暗 中的含量
作用 。 光照明显降低阿玛碱的积累 , 在光照条 高 , 可能是 由于光诱导过氧化物酶活性提高
件下阿玛 碱只达到 0 . 3 4 7 m g / g 干 重 , 在黑 的缘故 。
暗中阿玛碱在 L l 中可积 累至 .1 3 83 m g / 9 .2 4 长春花叶片愈伤组织诱导发生过程中
4 介 1 . 6
1 0 2 0
培养时间 : (d )
10 加培养时间 t ( d ) 3 0 4 0
l
`
l
``. .04218640
通工J几00详.0.谕日à喇如攀成盆2-3一叨é!l巨0峨儿0山4Zn妙八U00ǎ .诊,0.、冒à训如舒成谊
图 4 长春花叶片愈伤组织诱导发生过程中培养物的阿玛碱含 t 的变化动态
0 1 0 2 0
培养时间 妊d )
ǎ .诊.0.洛日)-如舒蜂姗
一40
4,`几`1ù
10 2 0
培葬时间 t ( d )
3 0 40
卜巨。25泊15nUǎ .卜.。.、日à翻如舒玲省
图 5 长春花叶片愈伤组织诱导发生过程中培养物的蛇根碱含 t 的变化动态
文多灵和长春质碱的动态变化 : 文多灵和长 和降解 的消长 , 反映了叶片愈伤组织诱导初
春质碱只在不加 2 , 4 一D 的培养基 中存在 , 而 期外植体发生的生理生化和次生代谢途径的
且在诱导愈伤组织发生的过程 中 , 其含量发 变化 。
生剧烈变化 ,离体培养开始文多灵迅速下降 , 2 . 5 生长素和光暗条件对长春花愈伤组织
而且降幅最大 ,在 l o d 内便 由 1 . 14 m g / g 干 的生物量和生物碱的调节 : 在不 同种类的生
重降至 0 . 03 ~ 0 . 08 m g / g 干重 。 而长春质碱 长素与 K T 配 比的培养基 中 ,愈伤组织随 2 ,
先上升然后又迅速下降 , 后期仍保持一 定水 4一 D 浓度提高 , 其生物碱含量 降低 , P O D 活
平 (图 6 , 7) 。 光照有利于缓解文多灵和长春 性也降低 。 光照可使酸性和碱性 P O D 活性
质碱的降解 。 这两种不同类型生物碱的合成 增加 , 但持续光照使生长受到抑制 , 同时也使
《中草药 》 1 9 9 9 年第 3 0 卷第 7 期 一 5 3 5 .
蛇根碱含量增加 , 而阿玛碱含量下降 , 这可能 是碱性 P O D 活性增加的结果 。 在 2 , 4一 D 培
肠0420
.瓦物扣护脚来仲
10 20培养时间 t( d)
218场4U注叨肠0.0认众氏。让.沙.0.、日à翻如每妞仲邓
0 10 2 0
堵养时间城 d )
3 0 初
长赛花叶片愈伤组织诱导发 生过程中培养物 的长春质碱含含的变化动态
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诊.0.、曾.à-如峨协拭
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10 即堵养时间 : (d )
3 0 40 2 0 3 0 4 0场养时间代 d )
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图 7 长容花叶片愈伤组织诱导发 生过程中培养物的文 多灵含 , 的变化动态
养基中加入 I A A 可增 加生物碱 的含量 , 将
2
,
4
一
D 用 N A A 或 I A A 代替 ,则生物碱 的合
成显著增加 ,过氧化物酶活性增加 ,而生长率
有一定程度 的下降 (表 1 ) 。
表 1 不同的生长索和光暗条件对长赛花愈伤组织
的 生 物 , 、 生物碱含 t 和 过权化 物 酶活性
( PO D )的影响
培养基 组织生长率 阿玛碱 蛇根碱长春质碱 酸性 PO D碱性 OP D
代号 (% ) (一n g /9 D r y W eig h t ) (胡 D` ,。 / m g p r o t e in . m i n )
A 光培养 34 5 . 5 0 . 2 07 0 . 5 2 5 0 . 0 0 13 93 . 75 2 0 . 08
暗培养 3 86 . 1 0 . 2 72 0 . 3 74 0 . 0 0 12 52 . 4 3 8 . 2 5
B 光培养 34 6 . 2 3 0 . 10 9 0 . 4 4 2 0 . 0 00 9 68 . 4 2 11 . 6 2
暗培养 49 7 . 4 6 0 . 2 0 3 0 . 2 1 9 N D 28 . 54 10 . 2 5
C光培养 40 0 . 21 0 . 0 5 7 0 . 2 7 3 N D 34 81 17 . 4 5
暗培养 528 . 9 0 . 12 5 0 . 10 3 N D 14 . 25 9 . 0
D 光培养 3 35 . 26 0 . 21 7 0 . 5 9 6 0 . 0 0 18 5 2 . 10 2 1 . 3 0
暗培养 417 . 6 0 . 39 7 0 . 3 9 9 0 . 0 00 6 2 6 . 38 10 . 6 1
E光培养 3 25 . 16 0 . 35 3 0 . 6 5 7 0 . 0 0 84 1 25 . 3 6 26 . 5 3
暗培养 3 87 . 36 0 . 41 6 0 . 5 4 7 0 . 0 04 9 7 2 . 54 19 . 2 6
F 光培养 3 20 . 64 0 . 30 8 0 . 6 2 3 0 . 0 0 79 1 20 . 6 3 33 . 0 9
暗培养 3 70 . 35 0 . 37 2 0 . 564 0 . 0 04 7 6 1 . 75 18 . 6 4
注 : 培养基的激素配 比分别是 A : 2 , 4 一D l m g / L + K T O . 1
m g / I ; B
:
2
, 4 一D 2 m g / L + K T 0
.
1 m g / L ; C
:
2
, 4一 D 3
m g / L + K T 0
.
1 m g / L ; D
:
2
,
4
一
D 1 m g / L + I A A 1 m g / L +
K T 0
.
2 m g / L ; E
:
N A A 1 m g / L + I A A 1 m g / L + K T O
·
l
m g / L ; F
:
N A A 1 m g / L + K T 0
.
1 m g / L
。
N D 表 示含量甚
徽 ,未能检出 。
3 讨论
.
5 3 6
·
许多研究结果表明 , 在 由植物体的某 一
器官诱导形成愈伤组织后 , 其合成原器官的
次生代 谢物的能力极大地降低甚至丧失 , 而
与此同时另一些在原外植体中含量低的化合
物却在愈伤组织中大量合成 , 这可能是因为
愈伤组织在不 同条件下的次生 代谢途径 改
变 。 本试验证实长春花植物的叶片诱导愈伤
组织过程中生物碱的变化便体现了这点 , 这
与其他试验结果相似闭 。 本来在长春花叶片
中阿玛碱和蛇根碱的含量较低 , 而文多灵和
长春质碱 的含量相对较 高 ,但在 叶片脱分化
形成愈伤组织的过程中 , 合成文多灵 的能力
却逐渐丧失 ,却获得 了高水平合成阿玛碱和
蛇根碱的能力 ,这个过程 自然涉及多种与发
育和分化调节密切相关的基因的表达及酶的
调节的事件 。 因为正是外源激素使叶片组织
发生根本变化 ,而且过氧化物酶被证 明参与
阿玛碱 向蛇根碱的转化和文多灵与长春质碱
偶合 为长春 碱① , 故我们在研究外 源激素对 ’
叶片变为愈伤组织的过程 中生物碱合成影响
的 同时 , 检测外源激素和光对过氧化物酶 的
活性的调节 , 探索此过程 中生物碱合成类型
的变化与过氧化物酶之间的关系 。 这对阐明
长春花叶片愈伤组织的诱 导过程中发生的生
物碱代谢类型 的变化机制有 重要 价值 , 因为
这一变化最终导致组织培养的方法不能生产
文多灵 , 长春碱 。 本文仅是 一 部 分初 步的工
作 , 仍需进一步努力探索 。
参 考 文 献
1 M o r e n o P R H
, e t a万. P l a n t C e l l T i s s u e a n d o r g a 了、 C u l -
t u r e , 1 9 9 5
, 4 2
:
1
2 S e h la t m a n n J E
, e t a l
.
B i o e h n o lo g y a n d B i o e n g in e e r i n g
,
1 9 9 3 , 4 1 : 2 5 3
3 S h a n k s JV
,
et a l
.
B i o t e e h n o l o g y a n d Bi o e n g in e e r i n g
,
1 9 9 8
,
5 8
:
3 3 3
4 赵 剑 ,等 . 生物物理学报 , 1 9 9 6 , 1 2 ( 3 ) : 5 1 7
5 赵 剑 ,等 . 药学学报 , 19 9 9 , 3 4 ( 7 ) :
6 M o r r i s P
.
P la n t a M e d i e a
,
19 8 6
, :
12 7
( 1 9 9 8
一 1 1
一
2 3 收稿 )
R e g u l a t i o n o f I n d o l e A l k a l o i d s S y n t h e s i s a n d R e l a t e d E n z y m e s D u r i n g C a l l u s
In i t i a t i o n a n d C u l t u r e o f M a d a g a s e a r P e r iw i n k l e L e a v e s ( aC t h
a ar n t h u s or s e u s )
Zh
a o
Ji
a n ,
1 0 0 0 5 0 )
A b s t r a 〔 t
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e n k e
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.
( In s t i t u t e o f M
a t e r i a M
e
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e a o f P u M e & e A M e
, 玫 iji n g
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e a f e a ll u s e s o f C a t h a r a n z h u s or
s e u s
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, .
) G
.
D o n 叭 , e r e in it i a t e d In f o u r d if f e r e n t m e d ia u n -
o r i n d a r k
.
V i
s ib le e a l! u s b e g a n t o f o r n i w i , h in l () t o 1 5 d a y s
.
T h e
w h i le t h e lo w e r a jm
a lie i n e
v i n d
o
l in
e a n d e a t h a r a n t h i n e i r、 t h e le a f d e e li n e d r a p i d l y , w h
e r e a s e
d m a r k e d l y d u r in g e a l l u s in i t ia t i o n
.
A t t h e s a m e t im e
o r d in a r ily h i g h e o n t e n t s o f
a n d
s e r P e n t in e e o n t e n t s i n
-
, a e i d i
e a n
d
a l k a li n e P e r o x id a s e s h o w e d a t e n d e n e y
t o i n e r e a s e t h
e i r a e t iv i t i e s
, e s p e e ia l l y t h e a e t i v i t ) o f a l k a li n e p e r o x id a s e w a s m o r e e lo s e l y r e l a t e d w it h t h e s y n
-
t h e s i s o f s e r P e n t i n e a n d a jm
a li e i n e
.
R
e s u l t s a l s o s h o w e d t h a t il l u m i n a t io n im P r o v e d o e e u r r e n e e o f l e a f e a l l u s i n
a
d
v a n e e a n d
s t im u la t e d p e r o x id a s e a e t iv it y
,
b
e n e fi c ia l fo r t h e s y n t h e s i s o f v in d o l in e
, e a t h
a r a n t h in e a n d s e r
-
p e n t i n e
.
2
.
4
一
D r e p r e s s e s b io s y n t h e s i s o f i n d o le a lk a l o i d s a n d P e r o x i d a s e a e t i v i t y i n a ll e u l t u r e s
.
K e y w o r d s aC
t h a r a n th u s or
s e u s ( L
·
) G
.
D o n le a f e a ll u s in it ia t io n i n d o le a lk a l o i d P e r o x i d a s e a e
-
t l v 一t y
正交设计在何首乌组织培养中的应用 “
广州 中医药大学中药学 院 ( 5 1 0 4 0 7) 杜 勤 ` 王振华 张俊荣
摘 要 用正交设计法考察了 4 种激素对何首乌嫩茎 、 叶诱 导愈伤组织产 生的影 响 。 方差分析结
果 显示 : 2 , 4一 D 、 I B A 作 用极显著 . 6一B A 作用显著 , N A A 作用不 显著 , 它们作 用大小依次为 : 2 , 4一 D
> BI :A > 6
一
B A > N A A
,诱导何首乌愈伤组 织产生 的最佳激素 配比为 : M S 十 2 , 4 一D l m g / L ( 以下单
位同 ) + 6 一 B A I + I B A 0 . 5 。
关键词 正交设计 何首乌 组织 培养 愈伤组织
何 首 乌 尸。勺。心 n u m m u lt ifl or u 脚
T h u n b
. 为萝科植物 ,是常用传统 中药 , 为广
东 十大道地药材之一 。 药用块根 , 具有补肝
肾 ,益精血 , 乌须发 ,强筋骨等功效 。 目前关于
何首乌组织培养方面的报道较少 l[, “〕 , 而在这
些研 究中 ,所 用培养基 中植物激素 的组合是
A d d r e s s
:
D u Q i
n , C o lle g e o f C h in e s e M a t e r i a M e d i e a
,
G u a
M at e r i a M e d i e a
,
G u a n g z h o u
1 9 9 0 年河南中医学院 中药 专业本科毕业 , 1 9 9 5
n g z h o u U n ive r s i t y o f T r a d i t io n a l C h in e s e M e di e in e a n d
中内
《中草药 》 1 9 9 9 年第 3 0 卷第 7 期 . 5 3 7 .