全 文 ：·药材·
丹参主要居群的遗传关系及药材道地性的初步研究
郭宝林1, 2 ,林　生 2 ,冯毓秀 1 ,赵杨景 1
( 1. 中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所 ,北京　 100094; 2. 北京中医药大学 ,北京　 100029)
摘　要 :目的　研究丹参主要居群的遗传关系及药材的道地性问题。 方法　选择丹参主要产地样本 44个 (包括 9
个居群样本 ) ,进行 RAPD分析 ,得到的扩增条带用 NTSYS-pc和 AMOV A软件进行数据处理。 结果　 ( 1)从 100
多个引物中选择出 11个多态性强和重复性好的引物 ,扩增得到 129条带 ; ( 2)不同居群内多态位点比率为
20. 9% ～ 55. 0% ; ( 3)用 UPGM A法得到所有样本的聚类图 ,可分为 6个主要分支组和 3个组外个体 ,其中四川中
江居群的 5个样本聚为一组 ,并与其他样本遗传距离较大 ; ( 4)按产地分组 ,遗传差异的 80. 44%存在于居群内 ,
8. 29%来自于组内居群间 , 11. 27%的遗传差异来自于组间。 结论　 ( 1)丹参居群内遗传多样性十分丰富 ; ( 2)山东
和河南的栽培居群栽培种源来自于当地野生居群 ,尚没有进行人工选择 ,丹参酮Ⅱ A等成分的减少的原因主要是栽
培条件不理想 ; ( 3)地区间居群的遗传分化不均衡 ,四川中江和河北承德居群与其他居群距离较远 ; ( 4)丹参的道地
性的确定应当依据现代的优质药材评价系统 ,山东和河南产的丹参也可认为是丹参的道地药材。
关键词: 丹参 ; RAPD;居群遗传关系 ;丹参药材道地性
中图分类号: R282. 21　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 12 1113 04
Primary research on genetic relationship among main populations
of Salvia miltiorrhiza and genuineness of herb
GUO Bao-lin
1, 2 , L IN Sheng
2 , FENG Yu-xiu
1 , ZHAO Yang-jing
1
( 1. Institute o f Medicinal Plant, Chinese Academy o f Medical Sciences and Peking Union of M edical Colleg e,
Beijing 100094, China; 2. Beijing Univ er sity o f TCM , Beijing 100029, China )
Abstract: Object　 To resea rch on genetic rela tionship among the main popula tions of Salvia mil tior-
rhiza Bge. and the genuineness of the herb. Methods　 From main dist ributed places, 44 samples ( includ-
ing nine popula tions) w ere analy zed by RAPD. The data of ampli fied bands w ere analy zed by the so ftw are
N TSYS-pc and AMOV A. Results　 ( 1) From more than 100 primers, 11 primers producing polymo rphism
and reproduceable bands w ere selected, 129 bands w ere amplified. ( 2) The percentage o f po lymo rphic
bands wi thin dif ferent popula tions w ere 20. 9% -55. 0% . ( 3) The cluster map including all samples w ere
obtained by U PGMA. In the map, there w ere six cluster g roups and three individuals outside the g roups.
The branch w ith five samples of Zhong jiang Sichuan popula tion w ere far f rom other samples in genetic dis-
tance. ( 4) Acco rding to the dist ribution provinces five g roups were divided in genetic v ariance analy sis.
Genetic v ariance 80. 44% existing wi thin population, 8. 29% among populations and 11. 27% among
g roups. Conclusion　 ( 1) The genetic div ersi ty within popula tion o f S. mil tiorrhiz a is plenti ful. ( 2) The
seeds of the cul tiv ated popula tion in Shandong and Henan Provinces come from the wi ld ones o f same
places. The cultiva ted plants lack arti ficial selection. The decrease of chemical compound is mainly due to
the undesired condi tion of cultiv ating. ( 3) The genetic di fferentia tion among the populations f rom dif ferent
provinces is unbalance. Tw o popula tion f rom Zhong jiang Sichuan and Chengde Hebei are far f rom the oth-
er popula tion. ( 4) The genuineness o f Radix Salv iae Milt iorrhizae should be decided according to modern
evaluation sy stem. The herbs f rom some places of Shandong and Henan should be genuine ones.
Key words: Salvia m iltiorrhiza Bge. ; RAPD; genetic rela tionship of popula tion; g enuineness of
Radix Salviae Milt iorrhizae
　　丹参是著名活血化瘀药 ,现代药理研究表明丹
参对心血管系统作用十分显著 ,已成为治疗冠心病
最常用的中药之一。 《中华人民共和国药典》 ( 2000
年版 )规定 ,丹参为唇形科植物丹参 Salv ia mil tior-
·1113·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
收稿日期: 2002-02-14基金项目:国家自然科学基金重点资助课题 ( 39730500)
rhiza Bge.干燥根及根茎。丹参的生态适应强 ,在我
国广泛分布于华北、华东、中南 ,西北、西南部分省区
也有分布。随着野生资源的减少 , 20世纪 70年代中
期丹参已经供不应求 ,在全国许多地区都开始栽培 ,
目前栽培品已成为丹参主要来源 ,全国丹参产量大
的有河南、山东、四川、山西、陕西、湖北、安徽等省。
历代本草对丹参产地和道地产区叙述有所不同。
如《名医别录》 (东汉 )述: “生桐柏山谷及太山” (今河
南和湖北交界及山东泰山一带 ) ;《图经本草》 (宋朝 ):
“今陕西河东州郡及随州皆有之” (今山西、湖北 ,河东
州郡应归为山西而非陕西 ) ;《本草品汇精要》 (明朝 ):
“道地随州” (今湖北随州 ) ;《药物出产辨》 ( 1930年 ):
“产四川龙安府为佳” (今四川平武 )。总结起来 ,在历
史上湖北、河南、山东和山西等几个省曾是丹参的主
要产地或道地产区。只是在近代才被认为川产丹参为
佳品 ,但在《中国道地药材》中 ,丹参被列为川产道地
药材 [ 1] ,科技部在四川省中江建立了丹参的 GAP种
植基地 ,研究丹参的道地性 ,确立最佳生产地区对于
优质药材的评价是十分有意义的。 本文通过对四川、
河南、山东、山西、河北等丹参主要居群 (包括野生和
栽培 )材料 RAPD分析 ,研究类群间遗传关系 ,并就
丹参的道地性问题进行一些探讨。
1　材料和方法
1. 1　材料:为 1999年至 2000年在丹参的主要产区
采集的叶片 ,自然晒干或晾干 ,其中四川的样品为嫩
叶经硅胶快速干燥。 另测定同一样本的根中丹参酮
Ⅱ A含量 [2 ] (表 1)。
　　每个居群取样 3～ 5个 (居群 a～ i ) ,并提供该居
群样本的成分含量情况 [2 ] ,对丹参的主要分布区 (河
南和山东 )的居群 ,补充了邻近居群的个体 ( 16～ 21,
36, 37) ,湖北样本为单一个体 ( 44)。
1 . 2　仪器和试剂: 离心机为 Heraeus公司生产的
表 1　丹参材料来源和有效成分含量情况
序号 居群编号 种源 丹参酮Ⅱ A (% ) 序号 居群编号 种源 丹参酮Ⅱ A(% )
1～ 5 a 四川中江 (栽 ) 0. 4402 22～ 25 d 山东沂南 (栽 ) 0. 7219
6～ 10 b 河南卢氏 (栽 ) 0. 5797 26～ 29 e 山东沂南 (野 ) 0. 6928
11～ 15 c 河南卢氏 (野 ) 0. 9649 30～ 32 f 山东沂水 (栽 ) 0. 3690
16 河南灵宝 (栽 ) 33～ 35 g 山东沂水 (野 ) 0. 8069
17 河南灵宝 (野 ) 36 山东莱芜 (栽 )
18 河南洛宁 (栽 ) 37 山东莱芜 (野 )
19 河南洛宁 (野 ) 38～ 40 h 河北承德 (栽 ) 0. 0585
20 河南嵩县 (栽 ) 41～ 43 i 山西垣曲 (栽 ) 0. 1495
21 河南嵩县 (野 ) 44 湖北武当山 (野 ) 0. 1266
Biofuge Stra tos, PCR仪为 PERKIN ELM ER公司
生产的 GeneAmp PCR System 9600,电泳仪为
BIO-RAD公司生产 POWER PAC 300。 Taq酶、
DNA ladder (华美公司 ) , dN TP、随机引物 (上海
Sangon) , EB ( SIGMA ) , β-巯基乙醇 ( M ERCK ) ,
Tris碱 ( GIBCO) , EDT A( AM RESCO) ,琼脂糖凝胶
( Spanish ) ,其他溶剂为分析纯。
1. 3　 DNA提取方法:将丹参叶片约 0. 4～ 0. 5 g置
于乳钵中 ,加入约 40 mg (重量约占叶片 10% ) PV P-
40T (聚乙烯吡咯烷酮 ) ,在液氮环境下研磨成细粉
状 ,装入离心管 ,加入 4℃的提取液Ⅰ ( 0. 25 mol /L
NaCl, 0. 25 mo l /L Tris-HCl, 50 mmol /L EDT A,
pH= 8. 0) ,冰置 10 min 4℃ , 7 000 r /min离心 10
min,弃去上清液 ,加入 65℃已预热的提取液Ⅱ (即
2× CT AB) 3. 5 mL(其中已加 Vc 0. 4 g ,并调 pH为
6. 0～ 6. 5) ,再加 2%的 β-巯基乙醇约 70μL,轻微振
摇后放进水浴锅内 65℃恒温 1 h,期间不断振摇。取
出离心管放至室温 ,用氯仿 -异戊醇 ( 24∶ 1)抽提至
两界面间无沉淀 ,取上清液加 2 /3体积的异丙醇 ,
- 20℃冷藏 1 h, 12 000 r /min离心 10 min,取沉
淀 ,用 70% , 95%乙醇离心各洗一次 ,晾干沉淀至无
醇味 , TE溶解。
1. 4　 PCR扩增: 25μL反应体系。 模板 DNA 5μL
( 5～ 10 ng ) , 10× Reaction Buf fer 2. 5 μL, 2. 5
mmol /L dN T P 2 μL, 25 nmol /L M g2+ 2 μL,
ddH2O 12μL, Taq酶 0. 5μL ( 1. 5U ) ,引物 1μL
( 15 ng )。
PCR扩增程序为: 预变性: 94℃ , 10 min;扩增
循环 ( 45个 ): 94℃ , 1 min; 36℃ , 1 min; 72℃ , 2
min;延伸: 72℃ , 10 min。
先进行引物筛选 ,再将筛选好的引物对所有的
样本扩增 ,设不加模板的空白对照 ,每个引物重复
2～ 3次。
1. 5　数据处理:对扩增条带按有或无记录 ,每一位
点有带记为“ 1” (强带和弱带同记 ) ,无带记为“ 0” ,得
到原始数据矩阵 ,计算多态性条带比率 ,推测遗传多
样性。 应用 N TSYS-pc软件 ,选择 DICE相似性系
数、非加权算术平均数聚类方法 ( U PGMA)进行聚
·1114· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
类分析 ,得聚类图。用 AMOVA软件 ,利用欧氏距离
系数进行距离计算 ,分析居群间遗传关系。
2　结果
2. 1　居群的多态性条带比率: 从 S115～ S250号引
物 (上海生工生物工程技术公司 )中筛选出 11个条
带清晰 ,多态性强而且重现性好的引物 ,分别是
S193, S198, S201, S220, S227, S230, S232, S237,
S246, S247, S250,引物 S250的部分样本扩增结果
参见图 1, 11个引物共得到 129条扩增带 ,全部为多
态性带 ,即所有样本没有共有带 ,丹参种内多态率为
100% ,表 2给出 9个居群内的多态性条带数量和多
态位点比率 ,范围为 20. 9%～ 55. 0%。
表 2　 9个丹参居群内多态位点的比较
居
群 样本数
多态位
点数
多态位
点比率 (% )
居
群 样本数
多态位
点数
多态位
点比率 (% )
a 5 42 32. 6 f 3 44 34. 1
b 5 65 50. 3 g 3 34 26. 4
c 5 71 55. 0 h 3 27 20. 9
d 4 59 45. 7 i 3 42 32. 6
e 4 41 31. 6
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
M-200bp ladder,最强带为 1 000 bp; 1～ 15-丹参样本 ,序号同表 1
图 1　引物 S250部分样本的扩增图
2. 2　全部样本的聚类结果: 图 2为全部 44个样本
的聚类图。依据聚类图 ,在相似性为 0. 5处 ,有 6个
分支组 (Ⅰ ～ Ⅵ )和 3个组外样本 ( 44, 40和 11) ,分
支组Ⅰ 包括四川居群样本 ( 1～ 5)和河南灵宝和嵩县
的两个野生个体 ( 17, 21) ;分支组Ⅱ包括河南野生或
栽培的大部分样本 ( 6, 9, 20, 7, 8, 19, 13, 16, 12)和 2
个山东沂南栽培样本 ( 24, 25) ;分支组Ⅲ由河南卢氏
居群的两个个体 ( 14, 15)组成 ;分支组Ⅳ由河北承德
和山西恒曲居群各两个样本 ( 38, 39和 42, 43)组成 ;
分支组Ⅴ包括了山东野生或栽培的大部分居群样本
( 33, 37, 27, 28, 29, 31, 36, 32, 34, 35, 26, 30) ,仅有样
本 18来自河南洛宁 ;分支Ⅵ 来源较杂 ,有河南卢氏的
样本 10,山东沂南样本 22和 23,山西垣曲样本 41。
从整个聚类图可看出 , 6个分支组分化不十分显著。
四川居群内 5个样本聚为单独一个分支 ,表明
居群内遗传比较相似 ,而其他居群内个体间遗传多
样性丰富 ,遗传特性不一致 ,但河南和山东的地区内
样本间存在一定的遗传相似性。
图 2　丹参 RAPD结果聚类图
2. 3　居群遗传变异分析:按地理分布将丹参 9个居
群分为 5个居群组 ,用 AMOV A软件对居群的遗传
变异进行分析 ,得出在研究群体内 ,有 80. 44%的遗
传差异来自于居群内 , 8. 29%的遗传差异来自于组
内居群间 , 11. 27%的遗传差异存在于居群组间。 不
同居群间的遗传距离值见表 3。
3　讨论
3. 1　丹参居群遗传结构: 由于样本来源的限制 ,本
研究涉及的居群个体较少 ,尚不能完全反映丹参居
群关系 ,但本研究可得出一些初步结果。
3. 1. 1　丹参的居群内遗传多样性十分丰富 ,野生居
·1115·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
群内多态性条带百分率有随个体数增加而增加的趋
势 ,如山东沂南居群为 26. 4% ,山东沂水居群
31. 6% ,河南卢氏居群 55. 0% ,因而丹参居群内的
遗传多样性可能还大于本研究给出的实验值。 从总
体分析结果 ,有 80. 44%遗传差异来自于居群内 ,居
群间变异仅占总变异的不足 20% ,因而丹参应为典
型的异花传粉植物。
表 3　丹参不同居群间的遗传距离值 ( a～ i为居群编号 )
a b c d e f g h i
a 0. 000
b 0. 292 0. 000
c 0. 230 0. 074 0. 000
d 0. 250 0. 064 0. 021 0. 000
e 0. 395 0. 231 0. 150 0. 209 0. 000
f 0. 360 0. 208 0. 089 0. 151 0. 129 0. 000
g 0. 377 0. 159 0. 047 0. 130 0. 157 0. 048 0. 000
h 0. 502 0. 285 0. 183 0. 214 0. 323 0. 255 0. 316 0. 000
i 0. 357 0. 160 0. 079 0. 120 0. 209 0. 063 0. 162 0. 213 0. 000
　　山东和河南每一地区的栽培居群与相应的野生
居群的遗传多样性基本一致 ,表明这些地区的栽培
少有人工选择。目前存在的居群内丰富的遗传变异
为良种选育提供了良好的基础。
3. 1. 2　丹参居群间遗传分化:同一地区的栽培居群
与野生居群的遗传距离很近 ,如河南卢氏两个居群
遗传距离为 0. 021,山东沂水两个居群间遗传距离
为 0. 048,均是本研究中遗传距离最近的关系居群 ,
但两个地区的栽培类型丹参酮Ⅱ A的含量都明显低
于野生类型 ,与前人研究一致 [ 3, 4] ,说明这些地区现
有栽培条件和栽培方法不利于丹参脂溶性成分的积
累 ,需要寻找栽培方面的原因。山东沂南栽培和野生
居群之间的遗传距离为 0. 209(二居群的遗传多样性
也相差很大 ) ,丹参酮Ⅱ A的含量却非常相近 ,这一特
殊结果表明山东沂南地区的丹参值得进一步研究。
四川中江的居群与其他居群关系最远 ,与各居
群的遗传距离分别为 0. 230～ 0. 502,该地区栽培历
史较长 ,由于没有当地的野生样本 ,尚无法判定遗传
差异是否来源于栽培选择 ,但长期栽培已使遗传多
样性大大降低。
从表 3给出的居群间距离值可看出 ,除四川中
江外 ,河北承德居群 (h )与其他居群距离较大 ,而其
他不同地区间的距离存在较大的不均衡 ,表明地区
间的遗传分化不十分显著 ,这与居群取样量较少有
一定关系 ,有待进一步研究。
3. 2　丹参的道地性问题: 在本草文献记述中 ,丹参
主产区和道地产区出现较大变迁。在常用中药中 ,道
地产区变迁十分普遍 ,产生变迁的原因除对优质药
材的进一步认识和有目的的选择外 ,还有政治文化
等社会原因、药材市场占有量 (如一些地区大量栽
培、某一城镇药商集中等 )等生产和市场的原因及本
草著者掌握资料有限等主观原因等 ,因此一些产地
比较广泛、道地记述有较大变迁的中药材 ,其道地药
材的确定应当慎重 ,尤其在变迁的原因无法考证明
确时 ,不能对本草中提及的地区进行简单取舍。 丹参
是使用历史最悠久的中药之一 ,道地四川在文献中提
及不足百年 ,要确立川产丹参为佳品 ,需要充分的
证据。
古人评价优质药材的标准是简单和直观的 ,没
有系统的临床比较方案 ,也缺乏科学的评价标准 ,然
而中国地域广阔 ,用产地来限定药材的质量是一种
有效的权宜之计 ,因而传统的道地药材和真正的优
质药材可能是很不一致的 ,简单地拘泥于古人的认
识也是不可取的 ,而应当用已建立的现代质量标准
体系阐明传统道地药材的科学内涵 ,并定向寻找、选
择和培育新型的优质道地药材。对不同产地丹参的
有效成分含量研究已有多篇报道 [ 3, 5] ,结果表明山东
和河南产丹参的脂溶性成分含量明显高于其他产
地 ,而川产丹参含量不高 ,因而山东和河南的相应地
区可以被确立为现代丹参的道地产区。 但丹参的水
溶性成分也已被证明是心血管活性的主要成分 ,因
此 ,利用水溶性成分的含量评价优质道地丹参是目
前迫切需要进行的工作。
四川中江栽培丹参历史较长 ,栽种方法比较规
范 ,市场占有量大 ,质量比较稳定 ,近年随着培育方
法的优化 ,质量在逐步提高 [6 ]。本研究表明中江丹参
与其他地区丹参的遗传分化明显 ,因此通过杂交引
进优良种质 ,选育新的优良品系是提高川产丹参质
量的有效方法之一。
本研究的取样地区和采样量尚很不足 ,进一步
的研究在进行中。
　　致谢:本课题组高光跃、陈四保提供部分实验样
品 ,林佳提供成分测定结果。
参考文献:
[1 ]　胡世林 . 中国道地药材 [ M ] . 哈尔滨: 黑龙江科学技术出版
社 , 1989.
[2 ]　林　佳 ,徐丽珍 ,李　琰 ,等 .不同产地丹参中丹参酮Ⅱ A的含
量比较 [ J] .中国中药杂志 , 2002, 27( 2): 153.
[3 ]　黄秀兰 ,王长根 ,董月丽 ,等 . 野生和栽培丹参的质量研究 [ J ].
中药材 , 1989, 12( 6): 31.
[4 ]　常效林 ,管玉民 . 山东栽培丹参的质量考察 [ J ] . 中药通报 ,
1988, 13( 12): 17.
[5 ]　郭宝林 ,林　生 . 丹参干叶片 DN A提取 [ J ]. 中草药 , 2002, 33
( 5): 418-420.
[6 ]　陈　幸 ,黎万寿 ,夏文娟 ,等 . 四川中江产丹参与其他产地丹参
化学成分的比较研究 [ J] .中国中药杂志 , 1997, 22( 9): 522.
·1116· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期