全 文 ：对 5 个样品中黄芩苷含量分析,黄芩苷含量为
5# > 3# > 6# > 2# ,差异不明显,而 4# 中的含量明显
低于其他批号样品,故 X射线衍射分析结果表明该
样品应属次品。
3. 2 双黄连片剂: 7# , 8# , 9# 样品的 X射线衍射图
谱的几何拓扑图形一致, 经分析计算获得 X 射线
Fourier 标准指纹图谱(图 5)。所含的 19个特征标
记峰均值为: 10. 42/ 160, 7. 11/ 220, 6. 04/ 380, 5. 90/
39, 5. 36/ 44
0
, 5. 23/ 42
0
, 4. 75/ 36, 4. 54/ 37, 4. 31/
50
0
, 4. 13/ 55
0
, 3. 92/ 100, 3. 76/ 46
0
, 3. 51/ 34
0
,
3. 19/ 30
0
, 3. 05/ 23
0
, 2. 599/ 28
0
, 2. 147/ 18
0
, 2. 099/
17
0
, 2. 017/ 16
0。
3 个样品 X 射线衍射图谱的几何拓扑图形一
致,衍射峰的相似度依次为 95%, 90%, 100%。结果
表明其含量基本相同。
4 讨论
分析计算结果表明:应用 X射线 Fourier 指纹
角 2/°
图 5 双黄连片剂的 X 射线 Fourier标准指纹图谱
图谱分析方法可实现中成药双黄连制剂的鉴定, 该
方法具有简便易行、直观及结果可靠的特点。通过对
指定化学成分的含量分析, 本法还可以建立中成药
的质量控制标准 [ 3]。
参考文献:
[1] 吕 扬,郑启泰,章 菽, 等 . 中药材山萘的 X衍射 Fourier 图
谱分析[ J ] . 药学学报, 1998, 33( 8) : 587-590.
[ 2] 吕 扬, 郑启泰,吴 楠,等 . 中药材牛黄的 X 衍射全谱分析
研究[ J] . 中国医学科学院学报, 1997, 19( 5) : 331-336.
[ 3] 郑笑为, 吕 扬,赵 斌,等 . 牛黄解毒片的 X 射线付里叶图
谱分析研究[ J] . 药物分析杂志, 2000, 20( 3) : 202-205.
甲基茉莉酮酸对悬浮培养南方红豆杉细胞自由基清除系统酶的影响
路 明, 王艳东,许明丽,元英进
(天津大学化工学院 制药工程系,天津 300072)
摘 要: 目的 研究外加甲基茉莉酮酸对南方红豆杉 Taxus chinens is var . mair ei 细胞培养体系氧自由基清除系统
中超氧化物歧化酶( SOD )、过氧化物酶( POD)和过氧化氢酶( CAT )酶活的影响规律。方法 酶活分析技术。结果
甲基茉莉酮酸能够诱导南方红豆杉细胞 SOD 的活性;对 POD 活性的诱导作用极为显著(约为对照组的 10倍 )且
POD 活性在培养第 10 天达到峰值; 在甲基茉莉酮酸作用下 CAT 活性先升高后降低, 即在表现出较强的诱导作用
之后又抑制了 CAT 的酶活水平。结论 甲基茉莉酮酸的加入刺激细胞产生了防御应答反应,诱导了相关的自由基
清除酶类, 其中 POD对甲基茉莉酮酸的信号转导贡献最大。
关键词: 南方红豆杉;甲基茉莉酮酸; 超氧化物歧化酶;过氧化物酶;过氧化氢酶; 悬浮培养
中图分类号: R286. 02; R282. 13 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2002) 11 0985 04
Effects of methyl jasmonate on SOD, POD and CAT in cell suspension culture
of Taxus chinensis var. mairei
LU Ming , WANG Yan-dong , XU Ming-li, YUAN Ying-jin
( Depar tment o f Pharmaceutical Engineering , Schoo l o f Chem ical Eng ineering
and Technolog y , T ianjin Univ ersit y, T ianjin 300072, China)
Abstract: Object T o study the ef fects of methy l jasmonate( M J) on SOD, POD and CAT in cell sus-
pension culture of T axus chinensis var . mair ei ( Lemee et Lv l. ) Cheng et L . K. Fu. Methods SOD,
POD and CAT enzymes analysis. Results M J could induce the activity o f SOD and especially of POD ( ap-
proximately ten t imes as much as the control ) , w ho se act ivity reached its peak on the 10th-day-cultured
cells. Act ivity of CAT also increased, but then decreased af ter the tr eatment o f M J, w hich enhanced CAT
first then inhibited it . Conclusion Addition of M J to the cell suspension cultures of T . chinensi s var.
mair ei could cause the cells to elicit the defence r esponse and induce the act ivit ies o f relat iv e enzymes, in
·985·中草药 Chinese T raditiona l and Herbal D rugs 2002 年第 33 卷第 11期
收稿日期: 2002-03-07
* 通讯作者
which POD would play the most important role for the signal t ransduct ion of M J.
Key words: Taxus chinensis var . mairei ( Lemee et lvl . ) Cheng et L . K. Fu; methyl jasmonate( M J) ;
SOD; POD; CAT; suspension culture
紫杉醇( taxo l)是继顺铂和阿霉素后最有前途
的抗癌药物之一。甲基茉莉酮酸( methyl jasmonate,
M J)是一种重要的植物生长调节剂和非生物诱导
子。Ketchum 等 [ 1]用 M J作为诱导子诱导悬浮培养
的红豆杉细胞,发现紫杉醇产量增长速率可达到每
天 23. 4 mg/ L , 因此 M J在生物合成提高紫杉醇产
量的研究中备受关注[ 2～4]。然而,大多数研究只集中
于 M J对紫杉醇产量的影响,其对自由基清除系统
酶的作用规律却鲜有报道。本实验研究了 MJ 在细
胞培养中期对超氧化物歧化酶( SOD)、过氧化氢酶
( CAT )和过氧化物酶( POD)这 3种自由基清除系
统酶[ 5]的影响规律, 以期揭示 M J对红豆杉细胞代
谢水平的影响及其生理作用机制。
1 实验材料
1. 1 细胞培养:研究用细胞系是南方红豆杉 T axus
chinensis var . mair ei Lemee et Lvl, Cheng et L .
K. Fu 细胞 T 系,由中国科学院植物研究所提供。
在改良 B5固体培养基[含蔗糖 25 g / L、水解酪蛋白
1 g / L , 萘乙酸 ( NAA ) 2 mg/ L , 6-苄基嘌呤 0. 15
mg / L ]上继代培养, 每 30 d接种一次。然后将细胞
转入含 50 mL 改良 B5液体培养基的 250 mL 锥形
瓶中, 25℃, 110 r/ m in黑暗振荡培养 5代以上。选
取长势良好的细胞, 培养第 7天加入 M J, 终浓度达
100 mol/ L ,同时设立空白对照组。在加入诱导子
的第 0, 3, 4, 6, 8天取样测定酶活指标。
1. 2 酶液的制备:取 0. 1 g 鲜细胞放入研钵中,加
入 0. 01 g PVP 和 3 mL 酶提取液( pH= 7. 8的 0. 1
mol / L 磷酸盐缓冲液中含 0. 2 mmol/ L EDTA 和
0. 4 mmol / L DT T ) , 研磨细胞, 于 4 ℃, 10 000 r/
min 离心 20 min后取上清液作为酶待测液。
2 实验方法与结果
2. 1 SOD活性测定方法:取 0. 25 mL 胞内待测液,
加入 3 mL SOD 反应液( pH= 7. 8的 50 mmo l/ L 磷
酸盐缓冲液中含 54 mL 14. 5 mmol/ L d l-甲硫氨
酸、2 mL 3 mo l/ L EDT A、2 mL 2. 25 mmol / L
NBT 和 2 mL 60 mol/ L 核黄素)后,于 4 000 lx 荧
光灯下照射 20 m in, 反应前后分别在 560 nm 处测
量吸光度( A )值, 以 A 560 / t= 0. 1/ ( 20 min)表示
一个酶活单位( u)。
2. 2 POD 活性测定方法: 在 50 mL 100 mmol / L
磷酸盐缓冲液( pH= 6. 5)中加入 28 L 愈创木酚,
溶解冷却,加入 19 L 30%的 H2O2 作为 POD反应
液。取 0. 5 mL 待测液与 2 mL POD 反应液和 1 mL
0. 2 mol/ L 磷酸二氢钾反应, 于 470 nm 处每隔 1
m in 测其吸光度( A )值,以 A 470 / t= 0. 01/ min 表
示一个酶活单位( u)。
2. 3 CAT 活性测定方法: 在 50 L 待测液中加 1
mL 0. 6%的H 2O 2和2 mL 磷酸盐缓冲液( pH= 6. 0)
后,于240 nm 处以15 s 为间隔测定其吸光度( A )值,
并以A 24 0/ t= 0. 01/ s表示一个酶活单位( u)。
2. 4 正常培养条件下南方红豆杉细胞 POD, SOD
和 CAT 酶活变化规律:如图 1所示, SOD活性先升
高后下降,然后维持在一定水平; SOD和 POD在培
养的中期均有活性峰出现,且出峰顺序为SOD先于
POD( SOD 活性峰的出峰时间为培养的第 10天,
POD活性峰的出峰时间为培养的第 11天) ;在培养
的第 10天 SOD活性处于峰值而 POD 活性处于同
时期最低水平; 与之对应,在培养的第 11天POD活
性处于峰值, 而 SOD 活性处于同时期最低水平;
CAT 酶活在此培养时期内除第 11天有所提高外基
本上呈逐渐下降的趋势。
时间 t / d
图 1 南方红豆杉细胞培养过程中
SOD, POD 和 CAT活性变化
2. 5 MJ 作用下 SOD 酶活变化规律:结果如图 2所
示。经 M J 处理后 SOD 活性变化趋势与对照组相
似, 同为先升高后降低, 最后维持在一定水平; 但其
相对于对照组而言, 酶活始终高出一定水平; 同时保
留了正常培养条件下的酶活性峰,且出峰时间未受
影响。因此,从整体上看M J的加入诱导了悬浮培养
的南方红豆杉细胞 SOD 的活性, 但诱导作用不
显著。
2. 6 M J 作用下 POD酶活变化规律: 结果如图 3
·986· 中草药 Chinese T raditiona l and Herbal D rugs 2002 年第 33 卷第 11期
时间 t/ d
图 2 经MJ处理后 SOD 活性变化
所示。POD 活性在M J作用下发生较大变化。首先,
从整体上看POD活性较之对照组有很大提高(实验
组酶活峰值约为对照组峰值的 10倍) ;其次,与对照
组的单位峰相比经 MJ 处理后的实验组 POD除保
留了原有的那个活性峰之外还出现了第二个活性
峰, 出峰时间为 MJ 加入后的第 6 天 (培养第 13
天) ,其活性约为同时间对照组酶活的 14倍;再次,
M J的加入使 POD活性峰提前 1 d 出现;最后, POD
活性虽有所波动,但在本实验所考察的细胞培养时
期内始终维持居高不下的趋势。因此, M J的加入对
悬浮培养的南方红豆杉细胞 POD 表现出显著的诱
导作用。
时间 t/ d
图 3 经MJ 处理后 POD 活性变化
2. 7 M J 作用下 CAT 酶活变化规律: 结果如图 4
所示。CAT 活性先升高然后又急剧下降; M J加入后
的第 3天实验组 CAT 活性值明显高于对照组(约
为对照组的 2倍) ; MJ 加入后的第 4天实验组 CAT
活性水平显著低于对照组(约为对照组的 1/ 6) ; 且
M J作用下细胞的 CAT 活性下降速率较之对照组
更快。从整体上看, M J的加入对悬浮培养的南方红
豆杉细胞 CAT 在表现出了较强的诱导作用之后又
显著地抑制了培养体系中的 CAT 活性。
3 讨论
正常培养南方红豆杉细胞在第 10天处于指数
生长期,此时细胞代谢旺盛, 呼吸作用增强, 胞内产
生大量氧自由基。由于植物SOD酶是一种典型的诱
导酶[ 5] , 所以 SOD酶活被诱导用于清除过多的氧自
由基,即代谢水平和呼吸作用的增强是诱导 SOD活
时间 t / d
图 4 经MJ 处理后 CAT活性变化
性峰在培养中期(第 10天)出现的原因。随着多余的
超氧自由基被还原为 H 2O 2,超氧自由基的数量不断
减少,第 10天后 SOD活性开始下降;此后, 细胞进
入指数生长期末并于第 15天左右转入停滞期,已经
完全适应新环境且环境氧分压处于相对恒定水平,
所以环境氧分压的高低等外部环境条件不会再诱导
SOD 酶活, 这也是促成 SOD 活性峰后伴随着酶活
的下降以及维持一定水平的原因之一。由于 H 2O 2
既是 SOD催化反应的产物又是 POD催化反应的底
物,且在 SOD活性峰出现时胞内还没有产生大量的
H 2O 2,因此 H2O 2的浓度水平还不足以诱导 POD 活
性, 这就导致了培养第 10天时 SOD 活性处于峰值
而POD 活性处于同时期的最低水平。随着 SOD催
化反应的进行, H2O 2在胞内过量积累,诱导了培养
中期(第 11天) POD活性峰的出现与 CAT 酶活水
平的增加;这同时也导致了 SOD活性峰较之 POD
活性峰的提前出现和培养第 11天POD活性处于峰
值,而 SOD活性处于同时期最低水平的结果。
近期研究表明 M J在植物抗病中参与了局部或
系统抗性[ 6] ,是抗病信号传递体之一, 它不但可以激
活特定的防御相关基因的表达和诱导植物自卫防御
反应的发生,而且还可以启动植物体内与信号转导
相关的基因[ 7]。由于SOD是与植物抗性密切相关的
酶,因此细胞的 SOD 活性水平在 M J作用下有了一
定程度的提高, 但在本研究中提高程度不大、抗损害
能力并不十分显著。这可能是 M J作用下细胞内某
些物质与 SOD 共同作用完成清除自由基这一功能
的缘故,关于这一点有待进一步研究。
另外, POD是与植物抗胁迫密切相关的酶, 在
酚类聚合成木质素的过程中及 HRGP 高级结构的
形成中起着重要作用,其活性的高低在一定程度上
可以反映细胞抗病能力的强弱。从本实验结果分析,
实验组 POD 活性虽有所波动但始终维持居高不下
的趋势,这说明 M J作用下细胞中 POD对于抗损害
能力有较大的贡献。由于 M J是一种典型的信号分
·987·中草药 Chinese T raditiona l and Herbal D rugs 2002 年第 33 卷第 11期
子,而包括POD在内的氧化还原酶类参与细胞信号
转导过程中的信号级联放大过程 [ 8, 9] ,因此可以推测
POD 在 MJ 的信号转导中起很大作用。如前所述,
M J加入后并未显著诱导细胞 SOD 的活性而在 M J
作用下胞内必然会产生大量活性氧自由基, 所以
SOD 必须借助胞内其他物质共同完成清除自由基
的任务。在这种协同作用下, 胞内 H2O 2的积累可以
提前达到诱导 POD 活性的浓度水平, 从而造成了
POD活性峰的提前出现。在培养的第13天,实验组
CAT 活性水平受到显著抑制而 POD同样可以完成
CAT 消除 H2O2 损害的功能, 因此出现了第 2 个
POD活性峰,即 CAT 与 POD的功能互补性是导致
POD多产生一个活性峰的原因。此外, 有文献报道
POD 活性的增高在一定程度上表征了细胞次生代
谢水平的增强, 有利于抗毒素的合成,因此 MJ 的加
入也刺激了细胞的次生代谢活动。
CAT 是清除活性氧的关键酶, 是维持活性氧代
谢平衡的重要因素。MJ 加入后细胞产生了防御应
答反应, 产生的过多活性氧自由基需要包括 CAT
在内的自由基清除酶类加以消除,因此 M J对 CAT
首先表现出较强的诱导作用; 而随后 CAT 酶活的
急剧下降是同时期 POD酶活的高水平所导致的,即
CAT 与 POD功能上的互补性抑制了 CAT 的活性
水平。除此之外,还有多种因素都能够对CAT 活性
产生影响,因此有关 MJ作用下细胞 CAT 活性的变
化规律需要更加深入的研究。
综上所述, 外源加入 MJ 能够诱导南方红豆杉
细胞 SOD 的活性;对 POD活性的诱导作用极为显
著(约为对照组的 10倍) ,且 POD 活性在培养第 10
天达到峰值; CAT 活性先升高后降低, 即外源 M J
在表现出较强的诱导作用之后又抑制了 CAT 的酶
活水平。M J作用下细胞产生了防御应答反应,次生
代谢水平增强, POD 在 M J 的信号转导中贡献最
大。M J通过影响细胞 SOD, POD和 CAT 的活性改
变胞内氧自由基分布状况, 进而影响细胞的氧代谢
及其他生理代谢活动。
参考文献:
[1] Ketchum R E B, Gibson D M, Croteau R B, et al. T he kin et-
ics of taxol accumulat ion in cell s uspension cultur es of T axus
f oll ow ing elicitat ion w ith methyl jasmonate [ J ] . Biotech nol
Bioeng, 1999, 62: 97-105.
[2] M irjal ili N , L inden J C. Methyl jasmonate induced pr od uct ion
of taxol in suspen sion cultures of Tax us cusp idata: eth ylene
in teract ion and induct ion models[ J ] . Biotechnol Prog, 1996,
12: 110-118.
[3] Furm anow a M, glown iak K, Syklow ska-Baranek K, et al . Ef-
fect of picloram and m ethyl jasmonate on grow th and taxane
accumulat ion in cal lus cultur e of Tax us media var. hat f ieldii
[ J ] . Plant Cel l T is s Org Cul t , 1997, 49: 75-79.
[4] 苗志奇, 未作君,元英进 . 甲基茉莉酮酸诱导下紫杉醇合成途
径中拟稳态转移模式及其作用位点的研究[ J ] . 生物物理学
报, 2000, 16( 2) : 204-211.
[5] 余叔文,汤章城 . 植物生理与分子生物学[ M ] . 第 2版 . 北京:
科学出版社, 1998.
[6] Cr eelman R A, Mellut J E. Biosynthesis and act ion of jas-
monates in plant [ J] . Annu Rev Plant Ph ysiol Plant Mol Biol,
1997, 48: 355-381.
[7] Choi D, Bos tock R M, Avdiu shko S, et al . L ipid-der ived s ig-
nals that discriminate w ound and p athogen-responsive iso-
prenoid pathw ays in plants [ J ] . Proc Nat l Acad Sci U SA,
1994, 96: 2329-2333.
[8] Doke N, Chai H B. Act ivation of superoxide gen erat ion and
enhancement of res isit an ce again st compat ible r aces of Phy-
t op hthror a inf estans in potato p lan ts t reated w ith d igiton in[ J] .
Phys iol Plan t Path ol , 1985, 27: 323-334.
[9] Lamb C, Dix on R A. T he ox idat ive bu rst in p lan t dis ease re-
s istan ce [ J] . Annu Rev Plant Phys iol Plant Mol Biol, 1997,
48: 251-275.
杭白菊总黄酮的提取工艺及其含量的动态变化研究
杨 俊, 蒋惠娣* ,徐娟华
(浙江大学药学院, 浙江 杭州 310006)
摘 要: 目的 确定杭白菊总黄酮的最佳提取工艺,并考察总黄酮含量随杭白菊不同采摘时间的动态变化。方法
采用正交试验法,考察提取温度、提取时间、乙醇浓度及提取次数对提取液中总黄酮含量的影响, 确定最佳提取条
件, 然后在该条件下对同一种植区域,不同时间采摘的杭白菊进行总黄酮提取并进行含量测定。结果 在所考察的
因素中, 对杭白菊黄酮提取影响程度为:乙醇浓度> 提取温度、提取次数> 提取时间,不同时间采摘的杭白菊 ,其总
黄酮含量未见明显变化。结论 杭白菊黄酮最佳提取条件为: 75%乙醇, 100 ℃水浴回流提取 3次, 每次 1. 5 h;杭白
菊总黄酮含量与采摘时间无关。
·988· 中草药 Chinese T raditiona l and Herbal D rugs 2002 年第 33 卷第 11期
收稿日期: 2002-01-14基金项目:浙江省教育厅资助项目(G20062) ;浙江省桐乡市科委资助项目(H 20000792)
* 通讯作者 E-mail: Hdjiang@ zju. edu . cn