全 文 ：· 药理实验与临床观察
全脑缺血大鼠原瘤基因 c 一 f o s表达及小聚碱的影响△
南京医科大学药理教研室 ( 2 1 0 02 9)吴俊芳 .王 平 “ 王 洁 ` ” 潘鑫鑫 …, lJ天培…
摘 要 采 用结扎大鼠双侧颈总 动脉合并低血压后再恢复供血造成大 鼠脑缺 血再灌注模型 , 运用
斑点杂交技术 ,观察大鼠全脑缺血再灌注中海马 c 一 fo s m R N A 表达 的 动态 变化 ,并观察小粟碱
( B e r )的作用 。 结果表明 ,大 鼠全脑缺血 3 0 m in 后再灌注 1 0~ 18 0 m in , 海 马 。 一 f o s m R N A 出现 一过
性高表 达 , l h 达高峰 , 为假手术组的 5 . 1 倍 。 B er 20 m g / (k g · d) x 5 d iP 显著抑制脑缺血诱导的
c 一 fo s 高表达 , 且 明显升高 S O D 及 G S H 一P x 活力 ,降低 M D A 含量 。 这表明 ,脑缺血过程 中 c 一 f os 原
癌基 因呈 现一过性高表达 , eB r 的抗氧自由荃及降低 c 一 f os m R N A 水平 的作 用可能是其抗脑缺血
作用 机制之一 。
关链词 小粟碱 脑缺血 原癌基因 c 一 fo s 氧自由基
c 一
fo
s 原癌基 因是立 即早期 基 因家族 中
的一员 〔1〕 。 正常情况下 。一 f os m R N A 在细胞
内的水平很低 , 但在 一系列 生理或病理 刺激
因子作 用下其水平可在几分钟 内瞬时诱导 。
近年研 究表明 , 脑缺血可诱导和 激活脑内立
即早 期 基 因的表 达 〔2 , 。 小 聚 碱 ( b e r b e r i n e ,
B e r ) 是 从 毛 莫 科 黄 连 属 C户P t i s c h i n e s e s
F r a n c h
. 根状茎 中提取的一种异喳琳生物碱 ,
其具有抗 鼠实验性脑缺血作用 〔3〕 。 我们运用
斑点杂交技术 ,观察大 鼠全脑缺血再灌注过
程 中 c 一 f os 表达的动态变化 , 并观察 eB r 的作
用 。
1 材料和方法
1
.
1 动 物 : S p r a g u e D a w l e y 大 鼠 , 雄 性 ,体
重 3 50 一 4 50 9 , 由江苏省实验动物中心提供 。
1
.
2 药 品与试剂 : 硫酸小聚碱由中国药科大
学赵守训教授惠赠 , 纯度 > 9 % ,用蒸馏水配
制 。 c 一 f o s c D N A 探针 由北京医科大学心肺 内
分 泌 研 究 室 惠 赠 ; a 一 3 , P 一 d C T P ( 3 0 0 0 C i /
m m o l ) 购 自北 京 福瑞 同位素 公 司 ; 3 H C u R
( 0
.
1 m L /m C i) 购 自上海原子能研究所 ; 随机
引物试剂盒和异硫氰酸肌购 自上海华美生物
试剂公司 。 其它试剂均为分析纯 。
1
.
3 脑组 织 总 R N A 提 取及斑 点杂 交 : 取
1 0 0 m g 脑组织按 G o u g h 的改 良的异硫氰酸
孤一步法 〔4〕提取总 R N A 。 总 R N A 以 0 . 1%
焦碳 酸二 乙 醋 ( D E P C ) 水稀释后 , 用紫外分
光光度计测出样本在 入 2 60 n m 的吸光度值 ,
以 0 . 1% D E P C 水作 对 照 , 计算 R N A 浓 度
(拜g /拌L ) 。
各斑点样品用量均 为 5 拌g 总 R N A 。 点
样后将尼龙膜 80 ℃烘干 Z h , 置人 58 ℃预热
的含预杂交 液塑料袋 中 , 除气并热封 口 , 于
85 ℃水浴中反应 Z h , 再将含有标记 C一 fo s 基
因探针 和杂交液 的混合液加人塑料袋 内 , 在
5 8℃水浴反 应 16 ~ 24 h , 取 出尼龙 膜 , 将其
浸浴在 10 m L Z X S S C (柠檬酸钠和氯化钠
的缓 冲液 ) 中室 温漂洗 2 次 , 每次 s m in , 然
A d d r e s s
:
W
u
J
u n f a n g
,
eD p
a r t m e n t o f P h a r m a e o lo g y
,
N a n jin g U n i v e r s i t y o f M e d i e a l S e i e n e e s
,
N a n ji n g
吴俊芳 女 , 3 岁 , 1 9 8 6 年 获医学学士学位 , 1 9 9 2 年 获医学硕士学位 , 1 9 9 5 年获 医学博士学 位 , 1 9 9 7 年 8 月从中国医学科学院药学博士后流动站 出站 , 同时 留药物研究所 工作 , 被聘为副研究员 . 主要研究方 向为 : 神经药理 学 。 至今 已发表及 已接受待发表 的文章有 4 0 篇 ,参 与编写 的著作 4 部 , 承担 过江苏省 科委资助 基金项 目 、 国家 自然 科学基金重 大项 目 、 国家科委
1 0 3 5 项 目 、 “ 九 . 五 ” 攻关项 目等 。
` ’ 江西省上饶地 区传染 病院
伪 . 骨 中国医学科 学院药物研究所药理 室
△本研究为江苏省科委 资助项 目 ( N o . B S 9 4 0 2 1)
·
3 2
·
与假手术组相 比没有明显差异 ( 图2 )。
J O2 4
`
100 1翻侧钱
后 再 将 膜 浸 浴 在 10 m2 L XC S S0 /.1 %
SD S( 十二烷基硫酸钠 )液 中 ,于 “ ℃水浴 中
漂洗 2 次 , 每次 10 m in ,最后将膜浸浴在 10
m L 0
.
1 X S S C 液中于 “ ℃水浴漂洗 2 次 ,每
次 3 0 m in , 取 出尼龙膜 , 晾干后进 行放射 自
显影 ,通过图像分析仪对胶 片进行光密度扫
描 , 以测量各斑点相应 的灰度 ( IO D )值 。
1
.
4 急性不完全性脑缺血实验 : 参照文献 〔 5〕
方 法结扎大 鼠双侧颈 总动脉合并低血压 30
m i n 后再恢复供血 , 分别 在再灌 注 0 、 1 0 、 2 0 、
3 0
、
6 0
、
9 0
、
1 2 0
、
1 8 0 m i n 后 断头处死 ,每次处
死 6 只 , 取海马组织 1 0 m g 提取总 R N A ,并
与 a 一 3 , P 标记的 。一 fo s 。 D N A 探针进行斑点杂
交 , 计算各斑点 的灰度值 。 假手术组 (6 只 ) 除
不夹闭血管外 , 处理同缺血对照组 。
另取 S D 大 鼠 18 只 , 分为 3 组 。 药物组 :
B e r 2 0 m g / ( k g
·
d ) x 5 d i p
, 缺血对照组 : i p
生理盐水 。 二组均于末次给药后 30 m in 施 以
缺血手术 , 于 缺血 30 m in 后再灌注 60 m in
断头处死 , 同前提取海马组织 中总 R N A , 斑
点杂交 。 假手术组 ( 6 只 ) 除不夹闭血管外 ,其
余处理同缺血对照组 。
1
,
5 S O D
、
G S H
一
P x 活力及 M D A 含量 的测
定 : 取海 马组织约 0 . 2 9 , 制成 10 %匀浆 , 经
分级离 心后 取上 清液 , 按 M iz u n o 的方 法 〔的
测定 SO D 及 G S H 一 P x 活力 ;按硫代巴 比妥酸
法 〔7〕测定 M D A 含量 。 蛋 白质定量用 F ol in 酚
法 〔8〕 。
2 结果
2
.
1 大 鼠全脑缺血再灌注时海 马 c 一 fo s 基
因的表 达 : 由图 1 可见 , 大 鼠脑缺血 30 m in
后再灌注 1 0 m i n ,海 马组织 c 一 f o s m R N A 水
平 即有 升高趋势 , 6 0 m in 达高峰 , 为假手术
组的 5 . 1 倍 。 6 0 m i n 后 e 一 f o s m R N A 水平渐
渐降低 , 90 一 1 80 m in 降至假手术组水平 。
2
.
2 B e r 对大 鼠全脑缺血时海 马组织 c 一 fos
基 因表 达的影 响 : B e r 2 0 m g / ( k g · d ) x s d
i p 显著抑制大 鼠全脑缺血 30 m in 后再灌 注
6 0 m i n 时海马组织 。 一 f o s m R N A 的表达 , 与
缺 血对 照组 比较有显著差异 (尸 < 0 . 0 1 ) , 但
《中草 药 》 19 9 9 年第 30 卷第 1 期
时间 ` (而 n )
与假手术组 ( C ) 比较 : 肠 尸 < 0 . 05 “ 尸 < 0 . 01
圈 1 大限急性不完全性脑缺血 3 0 m in 再灌注 不同
时 间海马 c 一 f os m R N A 裹达的动态变化伽 一
6
,牙士 s )
10 r 今盆
昌6
划侧撰
O L ~ 一~ ~日` 一一~ ~ - ~ ~ ~ ~ L -乃` ` 盏~
1 2 3
l
一假手术组 ; 2一对照组 ; 3一 eB r 2 0 m g / ( k g · d ) x s d
与假手术组 比较 : 璐 苦 尸 < 0 . 01 ; 与对照组 比较 : 竹 璐 尸 < 0 . 01
图 2 B er 对大 鼠脑缺血 30 m in 再灌注 60 im n 时海
马 c 一 fo s m R N A 表达的影响 (n 一 6几万士 , )
2
.
3 B er 对大 鼠全脑缺血时海马组织 S O D 、
G S H
一
P x 活 力及 M D A 含 量的影 响 : 大 鼠全
脑缺血 30 m in 后再灌注 60 m in 时海马组织
的 S O D 及 G S H 一 P x 活力明显 降低 , M D A 含
量 明显升高 , 而 B e r 2 0 m g / ( k g · d ) 只 5 d i p
能显著提高 S O D 、 G SH 一 P x 活力 , 降低 M D A
含量 , 但不能达到假手术组水平 (表 1 ) 。
3 讨论
脑卒 中是严重威胁人类健康的重大疾病
之一 , 但由于对其发病机制 尚未弄清 , 临床上
一直缺乏有效的防治措施 。近年来 , 国内外对
裹 1 B e r对海马 SO D、 S GH一 P x活力及 M D A含 ,
的影响 (n ~ 6 ,王士 s)
(吨 / kg · d) (U /吨 蛋白)
假手术组 一
对照组 一
eB r 20
4
.
85士 0 . 53
1
.
13士0 . 22 番 .
3
.
87士0 , 38△ △
GSH
一
Px
( U /m g蛋白)
44
.
6士7 . 8
10
.
7士3 . 2拼 .
32
.
9士 6. 1△△
MDA
( n m o l/ m g 蛋白)
8
.
27士1 . 04
23 6士6 . 1 告 位
10
.
8士2 . 5△△
与假手术组比较 : 白 ` 尸< 。 . 01 与对照组比较 : △△尸< 。 . 01
脑 缺血诱导和激活脑内立 即早期基 因 ( 如 c -
fo
s , 。 一 iu n) 和晚期基 因 (如神经生长 因子 、 脑
源性神经营养因子 ) 等基因表达的研究 十分
活跃 , 试 图从基 因水平 阐述脑卒 中后继发性
神经元损伤的机制 , 并从基因调控上寻 找新
的防治方法和措施 。
研 究证 实 , 脑 缺血 可促使 c 一 fo s 基 因表
达 ,且这种表达是快速而一过性的 。 以 结扎双
侧颈总动脉合并低血压致大鼠急性不完全性
脑缺血为模型 , 运用斑点杂交技术观察大 鼠
脑缺血 过程 中 c 一 fos 基 因表达 的动态 变化 。
结果显示 , 大 鼠脑 缺血 30 m in 后再灌注 10
m i n 海马组织即出现 。 一 f o s 表达增强 , 6 0 m i n
达高峰 , 90 m in 以后降至假手术组水平 。 目
前对 c 一 f os 基因在 中枢神经元 内表达的功能
意 义还缺乏 足够 的认 识 , 但 。一 fo s 基 因表达
作 为一种标识物 ,反 映了脑 内神经元受到缺
血损伤后的功能活动状态 , 同时 ,脑缺血诱导
的 c 一 fo s 表达编码一种核磷酸蛋 白 ( f os ) , 后
者作 为第三信使与同激活的另一核磷酸蛋 白
iu n 构成二聚体 ,调节靶基 因的表达 , 产生功
能蛋白 ,对促进神经细胞生长 、分化和对损伤
的修复 、 重塑起着重要的作用 。
目前认为 〔的 , 脑缺血后 c 一 fo s 基因表达增
强可能与脑内兴奋性氨基酸受体激活和胞内
钙超载有关 ,并与氧 自由基之 间存在某种必
然的联系 〔103 。 本实验结果表明 ,大 鼠脑缺血
3 0 m i n 后再灌注 6 0 m i n , 海马 S O D 及 G S H -
P x 活力明显降低 , M D A 含量 明显升高 , B er
能 显 著 提 高 S O D 及 G S H 一P x 活 力 , 降 低
M D A 含量 ,具有抗氧 自由基作用 。 B e r 还能
显著降低新生大 鼠脑细胞 内游离钙浓度 〔 , 1〕 。
提示 B er 可能通过抗氧 自由基和降低胞 内钙
水 平而抑制 c 一 fo s 表 达 , 这可 能是 其抗脑 缺
血作用机制之一 。
参 考 文 献
1 S a g a r S M
, e t a l
.
S e i
,
19 8 8
,
24 0
:
1 3 28
2 W
e s s e l T C
, e t a l
.
B r a in R e s
,
1 9 9 1
,
5 6 7
:
2 3 1
3 吴俊芳 ,等 . 中国药理学与毒理学杂 志 , 1 9 5 , 9 ( 2) : 10 。
4 G o u g h N M
.
A n a l B i o e h e m
,
1 98 8
,
17 3
:
9 3
5 潘鑫鑫 ,等 . 南京 医学 院学 报 , 1 9 92 . 12 : 2 3 7
6 M i z u n o Y
.
E x p N e u r o l
,
1 9 8 4
,
8 4 ( 1 )
: 5 8
7 Y o s h id a S
, e t a l
.
J N
e u r o e h e m
,
1 9 8 5
,
4 4
:
1 5 9 3
8 1
,
o w r y O H
, e t a l
.
J Bi
o l C h e m
,
1 9 5 1
,
1 9 3
:
2 6 5
9 黄旭晃 , 等 . 国外医学 一脑血管疾病分册 , 19 95 , 3 : 3
1 0 R a o G N
, e t a l
.
C i r R e s
,
19 9 2
,
7 0
:
5 9 3
11 W u J F
, e t a l
.
C h in J P h a r m a e o l T o x i e o l
,
1 9 9 7
,
1 1 ( 1 )
:
7
( 1 9 9 8
一
0 3
一
0 3 收稿 )
E f f e e t s o f B e r b e r i n e o n P r o t o
一
o n e o g e n e e
一
f o s E x P r e s s i o n I n d u c e d
b y G l o b a l C e r e b r a l I s e h e m i a i n R a t s
W
u
J u n f
a n g
,
W
a n g P in g
,
W
a n g Ji
e , e t a l
.
( D e p a r t m e n t o f P h a r m a e o lo g y
,
N a n j in g M
e d i e a l U n i v e r s it y
,
N a n j in g 2 1 0 0 2 9 )
A b s t r a e t OD
t b l o t t in g a s s a y w a s e m p l o y e d in t h i s s t u d y t o o b s e r v e d y n a m ie e h a n g e s o f e
一
f o s m R N A
e x p r e s s i o n d u r i n g r e P e r f u s io n a f t e r e e r e b r a l is e h e m ia i n r a t s
, a n d e f f e e t o f b e r b e r i n e ( B E R ) o n e
一
fo s e x p r e s
-
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i
o n i n d u e e d b y g l o b a l e e r e b r a l i s e h e m ia w a s s t u d ie d
.
T h e r e s u lt s s h o w e d t h a t e
一
f o s g e n e e x p r e s s io n w a s t e m
-
p o r a ll y in e r e a s e d in g l o b a l e e r e b r a l is e h e m ia b y s
.
1 t im e s
, a s e o m p a r e d w i t h s h a m
一 o p e r a t e d g r o u p
·
H
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a n g e s o f e
一
f o s g e n e e x p r e s s io n e o u l d b e i n h i b it e d d r a m a t i e a ll y b y B E R 2 0 m g / ( k g
·
d ) X 5 d i p
.
T h
e
s a m e d o s a g e o f B E R s ig n if i e a n t ly i n e r e a s e d a e t iv i t i e s o f S O D a n d G S H
一
P x a n d r e d u e e d e o n t e n t o f M D A
o
f
b
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s s u e s
.
T h e r e s u lt s s u g g e s t e d t h a t t h e i n h i b i t o r y a e t io n s o f B E R o n e
一
fo s e x p r e s s i o n in d u e e d b y g l o b a l
e七r e b r a l i s e h e m i a m a y b e r e la t e d t o i t s p r o t e e t iv e a e t io n a g a i n s t b r a i n is e h e m ia .
K e y w o r d s b e r b e r in e e e r e b r a l i s e h e m i a p r o t o
一 o n e o g e n e e 一 f o s o x y g e n f r e e r a d i e a l
·
3 4
。