全 文 ：传因素、生态环境和人文因素综合作用的结果 ,根据
各种因素对道地药材形成的贡献大小 ,有人将道地
药材的形成模式分为生境主导型、种质主导型、技术
主导型、传媒主导型以及多因子关联决定型 [8 ]。本研
究的结果表明 ,遗传因素是影响细辛道地药材微量
元素含量的内在因素 ,也是主要因素。从微量元素的
角度来看 ,遗传因素是细辛道地药材形成的主要影
响因素。此外 ,土壤等生态环境条件是构成道地药材
最重要的外在条件 ,虽然这些外在条件在某些情况
下起着关键的作用 ,但这些外在条件是在优良种质
的基础上通过对药用植物内在基因的表达及某些生
理生化反应施加影响而起作用的 ,是道地药材形成
的外因 ,是次要因素。 综上所述 ,从微量元素的角度
来看 ,细辛道地药材的形成模式可能是以种质为主
导的多因子关联决定型。
3. 5　细辛道地药材中的重金属和砷盐含量:对重金
属和砷盐的检测 ,国际国内均提到议事日程 ,面临我
国开放改革的大好形势 ,若在药品质量的要求上与
国外更好接轨 ,必须要重视质量标准的提高 ,检查项
中重金属与砷盐为其内容之一 ,许多国家均有具体
质量要求。如对砷、铜、铅、汞 ,新加坡的要求依次为
5, 150, 20, 0. 5μg /g ,马来西亚为 6, 20, 10, 0. 5μg /
g ,香港砷限量为 10μg /g[9 ]。我国对中药材中铅和砷
的含量限度尚无明确而具体的规定 ,根据国内现有
资料 ,一般要求中药材中铅的含量 < 20μg /g ,砷的
含量 < 10μg /g。
从表 2中可知 ,细辛道地药材中铅的含量在
2. 22～ 17. 13μg /g之间 ,平均 6. 83μg /g;砷的含量
在 8. 75～ 33. 82μg /g之间 ,平均 19. 12μg /g。铅的
含量虽高于 Bow en值 ( 2. 7μg /g ) ,但各样品均不超
标 ( 20μg /g ) ;而砷的含量不仅远高于 Bow en值
( 0. 2μg /g ) ,而且多数样品超标 ( 10μg /g )。作者认
为在栽培药材前 ,有必要先检测土壤中的重金属和
砷盐含量 ;此外 ,在药材上也不能喷施含重金属和砷
盐的农药 ,以控制药材中重金属和砷盐含量。
参 考 文 献
1　米秋雯 ,等 .中国药学杂志 , 1990, 25( 3): 173
2　米秋雯 ,等 .中国药学杂志 , 1989, 24( 12): 712
3　 Bow en H J M. Trace elements in biochemis try. Academic Press ,
Lond on and New Yo rk , 1966: 260
4　王　夔主编 .生命科学中的微量元素 (第二版 ) . 北京:中国计量
出版社 , 1996: 132
5　孔祥瑞编 . 必需微量元素的营养、生理及临床意义 . 合肥:安徽
科学技术出版社 , 1982: 86
6　刘钟栋主编 .植物生理学 . 北京:高等教育出版社 , 1989: 201
7　范俊安 ,等 .中药材 , 1991, 14( 1): 3
8　肖小河 ,等 .中国中药杂志 , 1995, 20( 6): 323
9　王北婴主编 . 中国新药研制与申报 . 北京:中国中医药出版社 ,
1995: 152
( 1999-12-03收稿 )
农杆菌介导的 GUS基因在枳壳中的转移
广州中医药大学中药学院 ( 510405)　　贺　红
广西林业科学院　　　　　　　　　　韩美丽
摘　要　用枳壳 Poncirus trif oliata Ra f.实生苗的上胚轴为材料 ,探索以根癌农杆菌介导的 GU S基因在枳壳中的
转移 ,结果表明:抑菌剂选择头孢霉素较好 ;卡那霉素作为选择试剂 ,浓度为 50 mg /L;外植体与农杆菌共培养时间
以 2～ 3 d为宜。 GUS基因瞬时表达检测 , 80%的外植体呈阳性反应 ; GUS基因稳定表达检测 ,抗性植株中 , GU S反
应呈阳性所占比例为 70. 0%。
关键词　枳壳　农杆菌　 GU S基因
A Study on the Agrobacterium-mediated GUS Gene Transfer to
Trifoliate Orange (Poncirus trifoliata )
　　 College of Chinese Ma teria Medica , Guang zhou Univ ersity of TCM and Chinese Ma teria Medica ( Guang zhou 510405)　
He Hong
　　Guangxi Academy o f Fo r estry　 Han Meili
·295·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 4期
Address: He Hong, College of Chines e Materia Medica, Guang zh ou University of Tradi ti onal Ch inese Medicine and Materia Medica,
Guangzh ou贺　红　女 , 33岁 , 1997年毕业于华南师范大学生物系 ,获理学博士学位。现为广州中医药大学中药资源室副研究员。长期从事植物细胞工程方面的研究工作 ,作为主要成员 ,参加了国家自然科学基金及香港 Croucher基金等课题的研究 ,现主持广东省自然科学基金博士启动项目。 目前主要研究方向为中药生物工程。 发表论文 20余篇。
Abstract　　 The transforma tion of GU S gene by Agrobacterium-mediation was studied. The explants
used fo r t ransfo rmation were the epicotyls f rom Poncirus tri foliata Raf. The results indica ted that
Cefo taxime used as antibio tics w as better than carbenicillin. The concentra tion of kanamycin used as the
reagent of choice w as 50 mg /L. Shoo t regeneration f requency w as high when cocultiva tion time was 2～ 3
days. Histo chemical GU S assay showed that 80. 0% of the explants had the transient expression of GUS
gene and 70. 0% of the resistant plants were GUS-posi tiv e.
Key words　　 Poncirus tri foliata Raf.　 Agrobacterium tumefaciens　 GUS gene
　　随着对植物形成冠瘿瘤分子机制的阐明 ,植物
细胞培养技术的发展及以根癌农杆菌和 Ti质粒为
载体的植物细胞转化系统的建立 ,大大推动了植物
遗传转化的研究 ,转基因成功的植物种类不断扩大 ,
特别是在重要农作物及经济作物方面有重大的突
破 [1～ 3 ] ,但在药用植物方面的研究较少报道。 枳壳
Poncirus trifol iata Raf.为芸香科植物 ,其幼果及成
熟果实入药。 枳壳的离体培养工作 ,国内已有报
道 [4～ 5 ]。本文在离体培养的基础上 ,采用农杆菌转化
法 ,研究了 GU S基因转化枳壳的过程 ,旨在通过建
立高效的转化系统 ,为导入有价值的目的基因 ,获得
具有预期性的优良品种创造条件。
1　材料与方法
1. 1　植物材料: 枳壳种子经表面消毒培养无菌苗 ,
当苗长至一定大小时 ,采取上胚轴切成约 1 cm长的
小段作转化的外植体。
1. 2　细菌菌株及培养: 农杆菌菌株为 EHA101,含
有质粒载体 PGA482GG,质粒上插入了 GUS及
N PTⅡ基因。 菌株在含 50 mg /L卡那霉素的 YEP
培养基上繁殖保存 ,感染前 ,在 YEP液体培养基中 ,
28℃振荡 20～ 25 h,达到菌对数生长期 ,培养物即
可用于感染。
1. 3　外植体的转化:将枳壳上胚轴切段浸入到准备
好的菌液中 20 min,随后转到无菌滤纸上以吸掉多
余的菌液 ,将外植体接种于 M T培养基上共培养 3
d后 ,再转到含卡那霉素 ( Kanamycin, Km) 50 mg /
L和头孢霉素 ( Cefotaxime, Cx ) 300 mg /L的选择
培养基上 ,诱导抗性芽的产生。
1. 4　组织化学法检测 GUS活性: GUS组织化学染
色法参见《植物遗转化手册》 [6 ]。
2　结果与分析
2. 1　抑菌剂的选择:在用农杆菌转化植物细胞时 ,
常用羧苄青霉素和头孢霉素抑制农杆菌的过量生
长。试验结果表明 ,两种抗菌素在浓度为 500 mg /L
时 ,对外植体出芽均无明显影响。 抑菌试验中 , 300
mg /L的头孢素能完全抑制农杆菌的生长 ,而相同
浓度的羧苄青霉素杀菌效果不太好 ,农杆菌仍少量
生长。因此 ,枳壳转化试验中 ,抗菌素采用头孢霉素
较好 ,浓度为 300 mg /L。
2. 2　选择培养基中卡那霉素浓度的优化:以卡那霉
素作为选择试剂 ,筛选抗性芽的产生。枳壳上胚轴感
染后平放于选择培养基上 ,本试验观察了不同浓度
的卡那霉素对出芽的影响 , 1个月后统计结果。在无
Km的对照中 ,出芽率较高。 Km处理中 , Km 25
mg /L仅个别外植体有芽形成 ,当 Km增加至 50
mg /L以上时 ,所有外植体均无芽形成 ,外植体逐渐
变白。因此以 Km 50 mg /L作为常用的选择水平。
2. 3　共培养时间的选择:枳壳外植体分别与农杆菌
共培养不同时间 ( 1～ 4 d)后 ,取部分外植体小块检
测 GUS基因的瞬时表达活性 ,其余转入选择培养
基 , 1. 5个月后测定其转化再生频率 (表 1)。 结果表
明:共培养 1 d时 , GUS表达频率中等 ,转化再生频
率为 9. 6% , 2 d与 3 d时 , GU S表达频率及转化频
率均表现较高 , 4 d时 ,转化效率有所下降 ,同时还
可观察到 ,共培养 4 d时 ,培养基上形成菌斑 ,难以
除去。因此共培养时间以 2 d～ 3 d为宜。
表 1　共培养时间对转化效率的影响
共培养天数
( d)
GUS基因瞬时表达 转化再生频率
(% )
1 + + 9. 6
2 + + + 18. 2
3 + + + 20. 0
4 + + + 14. 0
　　注: + + 示中等　+ + + 示强
2. 4　转化外植体分化成苗及初步鉴定:枳壳上胚轴
切段与农杆菌共培养 3 d后 ,转至附加 300 mg /L头
孢霉素和 50 mg /L卡那毒素的选择培养基中进行
培养 , 1个多月后可看到抗性芽的产生 (图 1) ,待芽
长至 2 cm左右 ,从外植体上切下诱导生根 ,生根培
养基为 M T+ NAA 1 mg /L。
　　外植体与农杆菌共培养 3 d后 ,进行 GU S基因
瞬时表达活性的检测 ,取部分外植体进行 GU S检
测 ,发现 80. 0%的外植体 ,在切口处细胞中可测到
·296· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 4期
GUS活性 ,显蓝色 (图 2)。
转化处理获得的抗性植株生长 5个月后 ,进行
GUS基因稳定表达活性的检测 ,结果表明: 70. 0%
的植株呈阳性反应 ,这是茎段染色的结果 ,又取其叶
片进行 GUS染色 ,大多数呈阳性反应 ,少数不显蓝
色 ,说明有些植株已有稳定的 GU S基因表达 ,也有
些植株可能是嵌合的转化体 (图 3)。
　　图 1　在选择培养上获得抗性芽 图 2　 GUS基因在被感染的
上胚轴中的瞬时表达
图 3　 GUS基因在抗性植株的叶片、
茎段及根尖中的稳定表达
参 考 文 献
1　余叔文 . 植物生理与分子生物学 .北京:科学出版社 , 1992: 63
2　 Hooyk aas P J J, et al . Plan t Mol Biol, 1992, 19: 153
3　 Pena L, et al . Plan t Cell Report s, 1995, 14: 616
4　张进仁 ,等 . 中国柑桔 , 1985, ( 1): 22
5　贺　红 .中草药 , 1998, 29( 12): 824
6　傅荣昭 ,等 .植物遗传化技术手册 . 北京:中国科学技术出版社 ,
1994: 168
( 1999-06-11收稿 )
香青藤的生药鉴定
广西中医学院 (南宁 530001)　　廖月葵 　潘小姣　辛　宁
摘　要　利用药材性状、显微特征、紫外吸收光谱和薄层层析等鉴别方法对香青藤进行生药鉴定研究 ,为该药材的
鉴别和开发利用提供科学依据。
关键词　香青藤　性状鉴定　显微鉴定　理化鉴定　紫外分光光度法　薄层层析
Pharmacognostic Identification of Xiangqingteng ( Illigera aromatica ) Stem
　　Guangxi Co lleg e of TCM ( Nanning 530001)　 Liao Yuekui, Pan Xiao jiao and Xin Ning
Abstract　　 Pharmacognostic identification o f the stem of Illigera aromatica S. Z. Huang et S. L.
MO was carried out by studying i ts microscopic cha racteristics, UV spectra and TLC. The resul ts may
provide a scientific basis for the comprehensiv e development and uti li zation of the drug.
Key words　　 Illigera aromat ica S. Z. Huang et S. L. MO　 cha racteristic identification macro scopic
identi fica tion　 phy sico chemical identi fication　 UV spect ra　 TLC
　　香青藤又名吹风散 ,为青藤科植物香青藤
Il ligera aromatica S. Z. Huang et S. L. Mo的干
燥藤茎。具有祛风活血等功效 ,用于风湿骨痛 ,跌打
损伤 ,肥大性脊椎炎等症 [1 ] ,对解痉镇痛 ,降温和局
麻有显著功效 [2 ] ,生药鉴别未见有报道 ,为利于开发
利用 ,就此进行研究。
1　仪器与材料
1. 1　仪器: UV -160A可见紫外分光度仪 (岛津 )
2F-1型三用紫外分析仪。
1. 2　材料: 香青藤采于广西南宁市郊区 ,经广西药品
检验所黄燮才教授鉴定为青藤科植物香青藤 Ill igera
aromatica S. Z. Huang et S. L. M o的藤茎。硅胶 H
(青岛海洋化工厂 ) ,实验试剂均为分析纯。
2　药材性状
·297·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 4期
Address; Liao Yuekui, Guang xi College of Tradi tional Chines e Medicine, Nanning