全 文 ：六种中草药有效成分对钙调素依赖环核昔酸
磷酸二醋酶的作用△
皖南医学院 (芜湖 2 4 1 0 0 1 )
中山医科大学
杨东丽 . 陈 婪
顾熊飞 马涧泉 轰 磊 任 晖
摘要 用正交设计观察了 6种中草药有效成分和三氟啦嗓 ( T F P ) 对钙调素依赖环核普酸 礴酸二
醋酶 ( C a M一 P D E ) 激活活性的影响 ,结果表明: a ) 两面针碱 ( N i t ) 、 拼皮素 ( Q u 。 ) 和 T F P
对 C a M 一 P D E激活活性具有明显抑制作用 ( p < 0 . 0 1 ) , 其抑制强度 : Q u e > T F P > N it ; 小粟碱
( B e r )
、 麻黄碱 ( E P h ) 和鱼腥草素 ( H o u ) 对 C a M 一 P D E无明显作用 ( P > 0 . 0 5 ) , 青藤碱
( S i n ) 对酶的作用可疑 ; c )Q u e 与T F p 、 N i t与T F p之间有协同作用 。 结果提示 N i t 和 Q u e可
能是 C a M拮抗剂 , 两者的作用位点似乎不同于 T F P 。
关健词 环核普酸磷酸二醋酶 钙调素 拮抗剂 两面针碱 拼皮素 正交设计
钙调素 ( c al m o d ul i n , C a M )是一种广泛存在于生物界 的重要 C a “ + 受体蛋白 , 具有多
种调节功能 〔工, 2〕 。 自从 1 9 74 年W ie s s及其同事首先发现三氟啦嗦 ( T F P )抑制 C a M 依 赖环核
昔酸磷酸二酷酶 ( C a M 一P D E ) 以来 , C a M 及其靶酶与药物相互作 用 的研 究受 到 人 们的关
注 , 陆续发现了多种 C a M拮抗剂〔 3, 。 , 有的已作为研究 C a M 构象和生理功能 的重 要 工具
〔1 〕 , 有的可望作为肿瘤治疗或辅助治疗的药物〔。 。 中草药具有作用温和 、 资 源 丰 富等特
点 , 从中草药有效成分中寻找毒性低 、 专一性强的 C a M拮抗剂及激活剂具有重要意 义 。 长春
花碱等中草药有效成分对 C a M一 P D E具有抑制作用〔` , 5 〕, 两面针碱等对 C a M一 P D E是否有作
用 , 未见文献报道 。 本研究将正交设计应用到 C a M 一 P D E分子模型 , 观察两面针碱 等 6 种中
草药有效成分对 C a M 一P D E激活活性的影响 , 并对药物间的交互作用进行了初步分析 。
1 材料与方法
材料 : D E A E 一 S e P h a d e x A 一 2 5 , P h a r m a e i a产品 ; D E A E一 C e l l u l o s e , W h a t m a n产
品 , 蛇毒 , 中山医科大学药理教研室惠赠 ; T F p , s i g m a 产 品 ; 两面针碱 ( n i t i d i n e , N i t ) ,
小璧碱 ( b e r b e r i n e , B e r )和鱼腥草素 ( h o u t t u y n i n , H o u )由中山医科大学天然 药物研究室
提供 , 青藤碱 (s i n o m e in en , S i )n 由陕西凤县秦岭植物开发研究所陈冲赠 ; 盐酸麻黄碱 ( e p -
h e d r i n e e h l o r i d e
,
E p h ) 扣懈皮素 ( q u e r c e t i n , Q u e )购自中国药品生物制品检定所 , 其
余试剂均为分析纯级 。 牛皋丸和牛心取自广州市越秀食品公司 , 一 50 ℃冻存或 新 鲜 使 用 。
53 W B U V / V ls 分光光度计 , H I T A C H 2I 0 P R一 52 D 型高速冷冻离心机 , 日本 。
2 方法
2
.
1 高纯度 C a M 的制备 : 按文献〔 “ , 了〕的方法 , 从牛攀丸中纯化 。 纯 化 的 C a M具 有 激 活
C a M 一 P D E的能力 , 1 2 . 5% P A G E和 1 2 . 5% S D S一P A G E鉴定呈 一单一区带 。
2
.
2 C a M 一 P D E的制备 : 参照文献 c8 〕 , 由牛心肌制备 。
2
.冬 蛋白质含量的测定 : 按 B r a d f or d法〔幻 , 以 B S A为标 准 。
2
.
4 C a M 一 P D E活性测定 : 按文献卿略加改动 。 反应体系含 1 0 5一 1 5 8协 9 C a M一 P D E 、 药
物 、 4 o m m o l / L T r i s / H C I p H 7 . 5 、 4 o m m o l / L 咪哇 、 5 m m o l / L醋酸 镁 、 0 . 3 3 m m o l / L
*
^ d d
r e s s : Y a n g n o n g l i
,
D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y
,
W
a n n a n M e d i e a l C o ll e g e
,
W
u h u
现在地址 : 北京医科大学生化和生物分子实验室
△美国中华医学会 ( C M B ) 基金资助项目
.
5 8 2
.
Ca C I
:、 40ng CaM
、
1
.
2m mo 扮 /L e AM P 。 加入 e AM P后立 即计时 , 3 0℃保温 Z o m i n ,加蛇毒
o
.
l m g
, 3 0℃保温 l o m i n , 加 5 5% T C A终止反应 。 反应液离心 ,取上清液定磷 〔 1 0〕 ; 此为 C a M
一 D E激活活性 。 不加 c a M ,并以 o . 3 3m m o l / L E G T A替代 C a c l : ,所测活性为 C a M一 p n E
基础活性 。
2
.
5 实验设计 : 本实验利用 C a M一 P D E分子模型 , 用正交设计来观察 7种因素即S in 、 E p .h
B e r
、
N i t
、
Q u e
、
H o u 和 T E p对 c a M 一p D E激活活性的影响 。 各因素均定为 2个水平 :选用 L : .
( 2
` “
)正交表安排实验 。 l水平浓度为。 , 2水平浓度为 10 0卜m o l选用 L : 。 ( 2 : ’ “ )正交表安排实验 。
3 结果
3
.
1 S i n
、
E p h
、
E e r
、
N i t
、
Q u e
、
H o u 和 T F P对 C a M 一P D E激活活性的影响 : 由麦 l可
知 , B e r 、 E p h和 H o u对 C a M 一p D E活性无明显作用 ( p > 0 . 0 5 ) , 而 Q u e 、 T F P 、 s i n和 N i t对
c a M 一 P D E的 C a M 激活活性有显著抑制作用 (尸< 0 . 0 1 ) , 从 R值来看 , 抑制强度 是 Q u e >
T F P > s i
n > N i t
。 此外 , 交互作用 B e r x E p h 、 B e r x H o u 、 E P h x H o u 、 E p h x N i t也不容
忽视 。
裹 1 6种中草药有效成分对 C a除 P O E滋活活性的影晌
列号
因素 B e t E P h B e r x E P h H o u B . r x H o u E P h x H o u
1
。
0 7 0
1
。
8 0 1
0 。 1 3 8
1
。
3 1 7
0
。
7 8 0
7
。
3 8 8
1
。
1 5 9
0
。
9 9 2
2
。
0 8 8
1
。
3 2 2
0
。
8 2 9
6
。
1 6 2
1
。
3 5 9
0
。
8 9 1
4
。
6 1 2
1
。
0 8 5
1
。
0 6 6
0 。 2 3 8
> 0
。
0 5 > 0
。
0 5 < 0
。
0 1 > 0
。
0 5 < 0
。 0 1 > 0
。
0 1
j
19曰X`日KR妇尸
1 3 1 5
. . . . . . . . . . . . . . . .
8 q 1 0 1 1 1 2 一一 `1 4N i t E P h x N i t O u e 5 i n T F P .1 。 2 4 40 。 9 0 7
4 。 2! 2
1
。
0 7 3
1
。
0 7 8
一
0
。
0 6 2
1 。 19 9
0
。
9 5 2
3
。
0 8 8
1
。
46 6
0
。
6 8 5
9
。
7 6 2
1
。
0 5 6
1
。
0 9 5
一
0
。
0 4 9
l
。 3 1 7
0
。
8 3 4
0
。
0 3 8
i 。 3 9 3
0
。
7 5 8
7
。
9 3 7
l 一 1 3 2
1
。
0 1 9
l
。
4 1 3
< 0
。
0 1 一 < 0 。 0 5 < 0 。 0 1 一 < 0 。 0 1 < 0 。 0 1 一
△本实验按 L 1 6 ( 2 ’ . )正交表设计
为了使 实验结果更可靠 , 我们还用 L 。
.
C a M拮抗剂作为阳性对照
裹2
( 2
7
)正交表安排了实验 , 除 S i n和 B e r x E P h
的作用有 出入外 , 其余结果都一致 。 3批正
交试验结果均表明 Q u e 、 T F P和 N i t 能显著
抑制 C a M 一 D E P 激活活性 ( p < 0 . 0 1 ) 。 因此 ,
我们对Q u e 、 N it 和 T F P作了进一步分析 。
3
.
2 N i t
、
Q u e和 T F P之间的交互作用 : 本
Q u e x N i t
,
Q u e x T F P及N i t x T F P
交互作用分析裹
Q u e
:
Q
二 e Z
0
。
5 9 9
0 。 5 8 0
0
。
0 4 7
O
。
2 2 2
N i t l N i t Z
N i t l
N i t Z
T F P I
T F P Z
2
。
3 43
1
。
7 95
3
。 4 9 5
0
。
6 4 3
。
2 7 4
。
6 6 8
。
1 6 8
。
3 0 7
项试验通过分析 N it 、 Q u e和 T F P的交互作 ’ Q u 。表示 Q ue 取 1水平 ,余类推
用 ,试图得到有关Q u e 、 N it 作用位点的信息 。 3种 药均取 2个水平 , 1水平浓度为 0 , 2水平浓
度为 。 0协m o l / L ,结果见表2 。 当 N i t和Q u e取 2水平 , T F P取 2水平时对 c a M 一p D E激活活性的
抑 制作用更强 , 这说明在对 酶激活活性 的抑制上 , Q u e 与 T P F 、 N i t 与T F P之间 具有协 同
《中草药 》 1 9 , 5年第 26 卷第 n 期 · 5 8 3 -
作用 。
4讨论
本实验将正交设计应用到 Ca M一 P E D分子模型 , 从中草药有效成分中筛 选 C a M 一 P D E
拮抗剂 , 能同时研究多个药物的作用 , 具有实验条件均一 , 对 比性强 、 结果 可 靠 、 经济 、
速等优点 。 实验不仅能从统计学角度得出何药有作用 , 何药无作用 , 而且还能从R 值直观快
判断何药作用强 , 何药作用弱 。 本实验表明Q u e 、 T F P和 N it 是 C a M一 P D E的拮抗剂 , 其中
Q u e和 T F P 与文献结果 〔峨 , “ 〕相符 , N i t未见文献报道 。 我们还 观 察 到 Q u e 、 T F P和 N i t对
C a M 一 P D E基础活性几乎无影响 ,而对该酶的 C a M激活活性有明显抑制作用 , I C S。 值分别为
1 1
、
17 和 86 件m ol / L (另文发表 ) , 其强弱顺序与正交试验结果一致 。
值得一提的是正交设计虽然具有上述优点 ,但不是只做一批实验 即可作出可靠的结论 。 表
l中 S i n ( 13列 )对 C a M 一 P D E活性具有抑制作用 , 但与用 L : ( 2 7 )正交表安排实验所得结果 (观
察资料 )不一致 。 为此 , 作者进一步观察了 0一 5 0叩 m ol / L is n刘 C a M 一P D E基础活性和激活
活性的影响 , 结果表明s in 对酶活性不仅无抑制作用 ,反而对 C a M 一P D E的激活活性似有轻微
激活作用 。 表 1中 S i n ( 13列 )对 C a M一 P D E活性的抑制作用可能系 Q u e ( 1 2 列 ) 和 E p h x H o u
( 6列 )的交互作用存于该 列所致 。
C a M及其靶酶与C a M拮抗剂相互作用的研究 ,除用动力学方法外 , 目前多采用 生 物物理
学的手段 c4 , 1 〕。 己知 C a M 上有多个位点与其拮抗剂和靶蛋白相互作用〔 4〕。 T F P 是研’ 究得较
为清楚的C a M拮抗剂 , 用正交设计分析Q ` le 、 N it 和 T F P之间的交互作用 , 结果表明Q u e与
T F P
、
N it 与 T F P之间有协 同作用 , 提示 Q u e和 N it 在 C a M 一 P D E反应体系中作用位点可能
不 同于 T F P 。
参 考 文 献
C h e u n g W Y
。
S
e i e n e e
, 1 9 8 0
, 2 0 7
:
1 6
Z h
a o
S H
。
A e t a P h a r m a e o l S i
n , 1 9 9 2
,
1 3 ( 1 )
:
7 8
G i e t z 七 n K 。 I n I n t r a e e l l u l a r C a l e i u ut R e g u
l a t i o n
.
M a n o h e s t e J U n i v e r s i t y P r e s s
,
1 9 8 6
。 4 0 5
V
e i g l M L
, e t a l
.
P h a r n a e T h e r
, 1 9 8 9
,
44
:
1 8 1
N i
s h i n o H
, e t a l
。
G a n n
,
19 8 4
,
7 4 ( 5 )
:
3 1 1
G u X F
, e t a l
.
i n
:
G u a n g d o n g
一
H
o n g k o n g
R 气n e h e nt C o n f e r c n o e 。 1 9 8 8 。 1 1
D e d 也 a n I R , e l a l . M e t h o d s E n z y 皿 0 1 ,
1 9 8 3
, 1 0 2 : 1
H o H C
, e t 几 l 。 B i o c h i m B i o P h y s A e t a ,
1 9 7 6
,
4 2 9
:
46 1
B r a d f
o r d M M
。
A n a l B i o e h e m
,
1 9 76
,
7 2
( 2)
: 2 4 8
V a n V e l d h o 一
e n P P
, e t a l
。
A n a l B i o c
-
h e m
,
1 9 8 7
, 1 6 1
:
4 5
张遂坡 , 等 :生物 化学 与生物物理进展 . 19 “ , 15
( 4
矛
: 2 7 5
( 1 9 9 4一 0 3一 1 5 收稿 , 1 9 9 5 一 0 1一 2 4收稿 )
上海市清华科技函授学院中医函授院招生
经上海教育局批准面向全国招生 , 免试人学 , 学制 2年 , 选用全国高等中医院校函授教材 , 确保大专
水平 , 各科均由专家教授亲自执教 , 精心辅导并负责解答学员提出的疑难问题 , 与全国高等教育中医专业
自学考试紧相配合 。凡高 、 初中文化程度者均可报名 。详见简章 , 来函即赠 , 地址 : 上海 08 5一 3 14 信箱中医函
授院李琳收 。邮编 2 0 0 0 85 。
一 5 8 4
6
。 9 1
.
T h e
e r a t U t C S
r e s u l t s u g g e s t o d t h a 多 t h e s t a b i l i t y e o n s t a n t e a n b o im P t o v e d a t d e e r e a s e d t e m P -
a n d i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n s o f MG
。
(o r i g i n a l a r t i c l e o n P a g e7 54)
E f f e e 0f S i xE f f e e t i v e C o 爪 P o n e n t s o f C h i n e s e He r b a l D r u g s o n林
C a lm o d u l i n 一D e p e n d e n t C y c l i c N u c l e o t id e P h o s P h o d i e s t e r a s e
Y a n g D o n g l f
,
G u X i o n g f e i
, e t a l
E f f e c t s o f n i t i d i n e ( N i t )
,
b e r b e r i n e ( B e r )
, s i n o m e
n i n e ( S i n )
, e P h e d r i n e ( E P h )
,
h o
-
u t t u y n i n ( H o u )
,
q u e r e e t i n ( Q
u e ) a n d t r i f l u o P r a z i n e ( T F P ) o n c a l m o d u l i n
一
d e p e n d e n t c
-
y e l i e n u e l e o t i d e P h o s P h o d i e s t e r a s e ( C a M
一
P D E ) w e r e i n v e s t i g a t e d b y
·
d r t h 6 g o n a l d e s i g n
.
o u r o b
s e r v a t i o n e a m e o u t t h公 t N i t , Q u e a n d T F P s i g n i f i e a n t l y i n h i b i t e d t h e C a M 一 a c t i v a -
t e d P D E a e r i v i t y ( P < 。 . 0 1 ) i n t h o o r d o r o f Q u : ) T F P ) N i t . B e r , E P h , a n d H o u h a d n o e -
f f e e t s o n t h e e n z y m e a e t i v i t y ( P ) 0
.
0 5 )
.
T a o e f f e c t o f S i
n o n C a M
一
P D E w a s u n c e r t a i n
。
1 t w a s a l s o s h o w n t h a t t h e r e w e r e e o o P o r a t i v i t y b
e t w e e n N i t a n d T F P a n d s y n e r g i s 血 b e t -
w e e n Q u e a n d T F P
。
T h e s e r e s u l t s s u g g e s t o d t h a t N i t a n d Q u e m a y a e t a s e a l m o d u l i n a n
-
t a g o n i s t s a n d m i g h t h a v e
_
d i f f e r e n t s i t e s o n c a l m o d u l i n i n c o m P a r i s o n w i t h t h o s e f o r T F P
.
( o
r i g i n a l a r t i o l e o n P a g e 5 8 2 )
In :1 ib i t i o o o f R e : Pi r a t o
,
y S y o e y 之i a l V i r u ; b y W J ’ l u七a o g , A T r a j i七i o n a l
C h i n e s e P r e s c r ip t i o n C o m Po s e d o f F iv e M e d i c i n a l H e r b s
H
e S h u a n g t e n g
,
o u Z h
e n g w u
,
W
u C a n r o n g
W卫 h u t江 n g ` a w e l l k n o w n t r a d i t i o n a l C h i n e s e h e r b a l d 峨c o c t j o n f o r t h . t r e a t城 。 n t o f a s -
t h m a w a s f o 从n d t o h a v o a n a n t i v i r a l e f f 眨 e t o n r e s p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s ( R s V ) b o t h i n
v i t r o a n d i n v i v o
.
A 5 0石 r e d u p t i o 林 o f P l a q u e f o r m a t i o n w a s o b s e r v e d o 肚 H “ p 一 2 c e l l 班 o n o l -
a y e r a t a c o n c e n t r a t i o n o f l
, 8 0
.
A t s u c h c o n c e n t r a t i o n
, t h o v a l u e o f 19 T C I D 5 0 of
`
v i r a l
y i e l d w a s 2
. 二 , a n d 5 5不 R N A s y n t h e s i s o f R SV w a s i n h i b i t e d . I t w a s f o u n d t h a t a m o n g t h e
f i v e m e d i e i n a l h e r b s i n P r e s c r i P t i o n E P 人e d r a 5 1” i e a S t a P f 1 5 r e s P o n s i b l e f o r t h e a n t i v i r a l
a e t i v i t y o n R S V
.
I C 5 0 f o r P l a q u e i n h i b i t i
o n w a s f o u n d t o b
e 1
. 6 m g / m l
.
I n a n i m a l m o d e l
,
W
u h u t a n g , i n g n f z e a n r l y r e d u e e d’ t h e t i t r。 。 f 、 R SV a n d a e e e l e r a t e d R S V e l e a r a n e e i n m i e e ,
a n d a l l e v i a t o d v i r a l P n e u m o n i t i s b y e i t h e r Q r a l o r a , r o s o l r o u t e
.
( o r i g i n a l a r r i c l e o n p a g e s ` 8 5 )
E f f e e 七 o f C o二 m o lr T h r e e w l o g n u t ( T r i P t e r夕 g i u二 。 亡l j o r d玄￡) 0 0 B l o o 」 R h e o ! o g y
i n E x p e f im e n t a l A r t h r i t i s R a t s
L 1a n g w 七几 b o
,
J i n Z h e n g n a n
,
P i a o H
u i s h u n
, e t a l
E t h y l a 。 。 t a t e 。 x t r a o t o f T r i P t 召r y g ` : `川 。 了I f o r d i ( 2 0二 g / k g , 4 0二 g / k g ) , g i v e n t o a d j u v a n t
a r t h r i t i s r a t s ( 19 ) f o r 7 e o n s : 。 u t i v e d 己 y s , m a r k e d l y d e e r e a 3 e d b o t h h i g h a n d l o w s h e a r w -
h o l e b l
o o d v i s e o s i t y
,
P l a s m a v i s c o s i t y
,
w h o l e b l o o d r e d u e t i o n v i s e o s i t y
,
h e m a t o沁 r i t a n d f i -
b r i n o g e n c o n t e n 全 , b u t w i t h o u t e f f e e t o n b l o o d s e d i m e n t a t i o n a n d K v a l u e i n b l o o d s e d j m e -
n t 城 t 1 o n e q u a t i o n . T h e : e r 。 s u l t s i n d i e a t e d t h a t t h e d e e r e a s i n g e f f o e t o f T . w i l f o r d f i o n b l o o d
v i s e o s i t y m a y b
e r e l a t e d t o i t s i n f l 通 e n : 2 o n r e d b l o o d e e l l s a n d P l a s沮 a c o m P o s i t、 10 从:
( 0
r i g i n a l a r t i e l e o n p a g e 5 8 9 )
.
6 1 6
.