全 文 ：袂等原生质体融合种栽培试验初报
安徽中医学院 (合肥 2 60 0 38 ) 朱泉禅 . 唐 荣华 程晓 i
摘鹅 首次报道用原生质体傲合技术对获芬作生物工程育种 , 取得徽合菌种 , 在安徽霍山县境内
进行野外栽培试验的结果 。 亲本P : 、 P . , . 经获芬苗丝体万生质体分离 、 徽合、 标记和生合 子检
出、 培养和鉴定等步骤后 , 制成栽培种F : 、 与P : 、 P . , . 同时进行了对比栽培 。 试验结果 : P :均
产为0 . s k g /窖 , P。 , . 为2 . 2 0 k g /窖 , F : 为1 . 7 3 k g /窖 , F : 产l 介于2个亲本之间 ,产t 不够理想 ,
对其原因作了初步分析。
关健词 获荃 原生质体敬合 徽合子 栽培 产t 质t
用原生质体融合技术对获等作生物工程育种 , 改 良获等尸or 沁 。oc os (s o hw . ) w ol f性
状 、 选育抗逆力强 、 稳产 、 高产的新品系 , 是当前获荃育种的一种新赏试 。 我们在对安徽大
别山获等主产区进行深入调查及品比试验的基础上cl 〕, 以经过多年筛选获得的2个优 株作亲
本 , 进行获荃菌丝原生质体分离 、 融合和标记 , 取得了融合子 。 经纯化稳定后制种 , 于 19 91
年在安徽霍山县高山乡长冲村新获等基地进行了野外栽培试验 , 现将结果报道如下 。
1 材料与方法
1
.
1 获荃菌丝原生质体的分离与融合 :
1
.
1
.
1 亲本来源 : 2个亲本为P :与P o s号菌株 。 前者系霍山县漫水河区野荃驯化而得 , 后者
系从中科院微生物所引进 , 已为当地荃农采用多年 。两者都是经我们做了大量野外栽培试验 ,
后筛选出来的优株〔1〕。
1
.
1
.
2 亲本原生质体的分离 、融合与标记 :将P :与P。。的新鲜斜面分别接入培养基中 , 经3 ℃
振荡培养后 , 离心收集菌丝体 , 用缓冲液洗两次 , 然后将菌丝体酶解 、 保温 、 镜检适宜后制
成原生质体悬液 。 在酶解过程中 , 采用荧光色素标记法 , 用两种不同颜色的荧光染料 , 标记
两个亲本的原生质体 , 然后混合 , 同时加入融合剂 ,促进原生质体的融合 。原生质体融合 、 原生
质体再生及形成率 、 再生率计算按文献〔2 〕。融合诱导剂选用聚乙二醇(PE G )一钙离子系统 。
1
.
2 融合子的检出 、 培养和鉴定 : 根据亲本荧光显色的特征用机械分离方法选出融合 子 ,
接种在再生培养基中 , 在3 ~ 35 ℃下培养形成融合菌丝体 , 再经纯化 , 多代培养, 淘汰不稳
定的融合子 , 达到稳定时将其保存并交付试验。 融合子鉴定根据: a ) 融合子与 2个亲本菌丝
体自然形态 、 生理性状及原生质体荧光标记之不 同。 b ) 酸性磷酸酶和醋酶同功酶谱电泳分
析之差异 。
1
.
3 栽培试验 :
1
.
3
.
1 栽培菌种 : P , ; P二 。; F , ; 前两昔为亲本对照组 : 后者为融合子第 1代栽 谙种 。
1
.
3
.
2 制种和权堵: 栽墙种配方 (% ): 松木棒60 , 松木屑 1 5 , 鼓皮20 , 石膏粉 l , . 蔗糖 3 ,
尿素。 . 5 , 磷肥 0 . 5 , 含水量约65 写。
1
.
3
.
3 栽墙规 洛: 窖长〕s e m , 宽 毛se :n , 深4 5 e m , 每窖段木干重Z o k g , 每个菌株 栽 x o窖 。
1
.
3
.
4 栽堵 j寸间 : 19 9 卜 一。3 一0 7上窖 , 19 9 2一 12 一 0 8采收 。
2 试验结果
2
.
1 融合株与亲 仁灼产量比较 : F :单窖最高产量和均产均处于两亲本之间 , F :最大个荃重
.
A d d r . s s . Z h u Q
u a 几d i, A 立h u i C o ll。吕e o f T r a d itio n a l C h in e , e M e d ic in e , H e fo i
《中草药 》1 . , 5 年第2 6 卷第 5 期 · 2 6 1 ·
量达 1 . 6 5 k g , 与P o 7。相似 , 见表 1 。
2
.
2 获荃切片质量 比较 : 从外观色泽 、
看 , F :均和 2个亲本相似 , 无明显区别 ,
表1 胜合株与亲本的产t 比较
组织致密度 、 透明度 、 传统饮片收购等 级 等 项 来
见表 2 。
表2 胜合株与亲本往等切片质 , 比校
菌株
号
最大个菩
(k g )
单窖最高产量
(k g )
均产
(k g / 窖)
空窖率
(% )
P 1 1 0
F 1 1 0
P .
7 a 1 0
0
。
5 5
1
。
6 5
l
。
5 5
0
.
fi 0 0
。
5 0 1 0
2
。
2 5 1
。
7 3 0
5
。
7 5 2
。
2 0 0
编号
P i
F -
P 一 , -
色泽
纯白
纯白
纯白
细密度
细密
细密
细密
透明度
半透明 网纹状
同上
同上
等级
1
1
窖数
注 : 切片厚度 1 ~ Zm m
3 讨论
鉴定融合菌株 , 我们除采用统计融合菌种菌丝体与亲本菌丝体的形态和生理状况的差异
外 , 还采 用了同功酶谱电泳分析法 。 同功酶是基因表达的直接产物 , 对不 同品系和个体其同
功酶可存在差异 。本试验用的融合种 (F , ) , 在相 同条件下 , 出现浅色新谱带 , 在相 同谱 带
中 , 也有加深加宽的结果 , 显示了与亲本的差异 , 因而证明为融合种 。 从栽培试 验 的 结果
看 , 融合种的产量介于 2个亲本之间 , 平均每窖产鲜荃 1 . 73 k g , 明显高于P l , 其个体成形好 ,
质量坚实 , 结荃大 , 但产量仍低于P 57 。 , 而P l则没有显示其以往栽培试验中的优势〔1〕, 显示
性状不够稳定 , 分析其原因可能与 1 9 91 年栽培季节正遇安徽遭到特大洪灾 , 大别山区困于雨
水过 多 , 荃场条件变劣有关 。 由于杂种优势是一复杂的遗传现象 , 是多基因的综合结果 , 即
使在原生质 体融合技术中 , 我们筛选了异核体 , 并保证了它的纯度 , 但在多大比重上 , 实现
了基因重组或互补 , 并能在野外栽培试验中 , 稳定地 、定向表达出具有2个亲本的优良性状 , 成
为希望得到的 “ 目的融合子” , 还待进一 步探索 。
参 考 文 献
朱泉娣 , 等
王岳五 , 等
中草药 , 1 9 9 2
生物工程学报
2 3 ( 1 1 ) : 5 9 7
1 9 8 8
, 4 ( 3 )
: 2 3
( 29 0 4
一 0 2一 2 5收稿 )
(上接第 2 5 4 页 )
代谢的影响中 , 银杳内醋可能起重要 作用 。
致谢 : 陈大 为副教授 为本研完给予 大力 支持。
参
1 游 松 , 等 . 沈阳药学院学报 , 1 9 8 8 , 5 : 14 2
2 L e P o n e in L a f itt e M
, e t a l
。
A r c h ln t
P h a r m a e o dy n
, 1 9 8 0
,
2 4 3
: 2 36
3 K a r e h e r L
, e t a l
.
N a u n y n
一
S e h m ie d e be
-
r g
l s A r e h Ph a r m a e o l
, 1 9 8 4
,
3 2 7 : 3 1
4 S u b h a 口 z , e t a l. I n t J C li n P h a rm a e o l
R e s
,
1 9 8 4
,
4
: 8 9
6 W i
n te r E
.
P h a r m a e o l B io e h e m B e h a v
,
1 9 9 1
,
3 8
:
1 0 9
6 P o r s o lt R D
, e t a l
.
P h a rm a e o l B io e h e m
B c h a v
一
1 9 9 0
, 3 6
: 9 6 3
7 M
o r ie r
一
T e s s ie r E
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.
B io g e n A m in
-
0 5 一 1 9 8 7 一 4 : 3 5 1
8 M ic h
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, e t a l
.
G in k g o li d e s : C h e m
ist r y
一
B io lo g y
,
Ph a r m a e o lo g y a n d C li
-
n ic a l Pe r sPe e tie s
,
B r a q u e t P ( e d )
,
考 文
认
献
B a r e e lo n a i
,
J
.
R
.
P r o u s S A
,
1 9 8 8
,
1 : l
张林魁 , 等 . 药学学报 , 1 9 5 7 , 2 2 ( 8 ) : 5 9 1
吴春福 , 等 . 中药药理与临床 , 1 9 9 2 , 8 : 5
S c h w a r t in g R K W
, e t a l
.
P h a rm a e o ll
B e h a v
,
19 9 2
一 4 1 : 6 7 5
C o m m is s io n g J W
.
B io e h e m P h a rm a e o l
,
1 9 8 5
, 3 4 : 1 1 2 7
C l o st re F
, e t a l
.
G i n k g o lid e s
,
C h e ra i
-
s t r y
,
B io lo g y
一
P h a rm a e o lo g y a n d C lin i
-
e a l P e r s r e e t ie s
,
B r a q u e t P ( e d )
,
B a r e e
-
lo n a : J R P r o u s S A
,
1 9 8 8
,
1 : 64 9
P o rs o lt R D
, e t a l
.
E u r J P h a r m a e o l
,
1 9 7 9
。
5 7
,
2 0 1
( 19 9 4
一0 5一0 7收稿 )
.
2 6 2
.
Q u a n t it a t iv e A n a ly sis o f Ole a n o lic A c id fr o m the F ru it s o f G lo ss y P riv e t
( L￡g u s tr u o lu e宕d “ , ) in D iffe re n t G r o w in g Pe r io d s
M i H
e m in
,
C a o Y o n g bi n g , S o n g H o n g ta o
B y m e a n s o f T L C
一
d e n s三to m e r y , th e c o n t e n ts o f o le a n o lic a c id e x t ra e te d fr o m th e f r u i t s
o f L ig u s tr u 沉 l。。id 。价 w o r e d e te r m in e d to b e a . o‘% ( g / g ) in th o u n r iP e d fr u it c o lle c t e d in
A u g u s t a n d 2
.
7 3 % ( g / g ) i
n r iP e d fr u it g a th e r e d in D e c 七m be r .
T h i s r e s u lt sh o w e d t h a t t h e o le a n o lic a c id c o n t e n t i n fr u c tu s L
.
Iu e id u 阴 d e c re a se s g r a ‘
d u a lly w it h g r o w in g u n t il th e f r u it 1 5 fu lly r iPe d
.
( o r ig i n a l a r tie le o n Pa g e 2 5 8 )
A P r e lim in a ry St u dy o n C u ltiv a t io n T e st o f
P r o to Pla st F u sio n St ra in o f Fu lin (P o
r fa e o e o s )
Z h u Q u a n d i
,
T a n g R o n g h u a
,
C h e n g X ia o y u
R e s u lt o f fie ld c u ltiv a tio n t e st b y Pr o to Pla s t ic f u s io n t e e h n iq u e f o r b io lo g ic a l e n g i n
‘
e r in g br e e d in g o f P o r ia e o e o s i n H u o s h a n e o u n t y
,
A n h u i Pr o v in e e w a s r e P o r te d fo r t h e fir
-
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.
A f u s io n s t r a in F
:
w a s o bt a in e d fr o m Pa r e n t s P
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b y s e P a r a t io n
,
f u s io n
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r k e r o f h yP h a P r o t o P la st a n d id e n t if ic a t io n o f r e c o m b in a t
.
It w a s e u ltiv a te d s im u lta n e o u sly
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P 。 ? 。 f o r c o m Pa r is o n
.
R e s u lts s h o w e d th a t th e a v e r a g e e e lla r o u t Pu t s w e r e 1
.
7 3
,
0
.
5
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.
2 0k g r e s Pe e tiv e ly
.
A s t h e o u t Pu t o f st ra in F l 1 5 i n t e r m e d ia te b e t , e e n it s Pa re n t P i a n d
P
。 , 。 , t h e r e s u lt 15 e o n s id e r e d t o b e u n s a t is fa c to r y
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T h e re a s o n f o r s u e h r e s u lt w a s d is c u s s
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( o ri g in a l a r tic le o n P a g e 2 6 1 )
B e n e a o lo g ie a ! St u d ie s o n C h a n g pu
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R e s u lt o f B e n e a o e o g ie a l s tu d ie s o n C h a n g Pu s h o w e d t h a t i t o r ig in a t e d f r o m tw o d if fe r
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e n t s o u r e e , o n e 1 5 S h u ie h a n g P比 ( A , o : “ 5 e a la m : s )w h ile a n o th e r 15 S h ie h a n g P u ( A
. 才a ta r i” o 功 fi
a n d A
.
g r a 仍f”e u s ) . U s u a lly , C h a n g P u g r o w n o n s t o n y g r o u n d w a s r e f e r r e d t o a s S h ie h a n g P u .
Ju ji
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th a t w h ie h 15 u se d i n N o r th w e st C h in a 1 5 a n e n t i re ly d iffe r e n t h e r b A 泞e 沉o n e o lta fe a .
( o r ig i u a l a r tie le o u Pa g e 2 6 3 )
(上接第2 7 3 页 )
参 考 文 献
1 等 . 中国药用地衣 . 北京 : 科学出版社
2
魏江春 ,
1 9 3 2
。
孙汉董 ,
3 10
张振杰 ,
4
6
等 . 云 1L j或亡七物石,于了艺, 19 8 3 , 5 ( 3 )
李 波 , 等 . 中草药 , 1 9 9 2 ( 3 ) : 1 2 0
孙汉蜚 , 织 . 云南植物研究 , 1 9 8 6 , 8 ( 4 ) :
4 8 3
7 8 3
3 等 . 恤物 J仁报 , 1 , 8 3 , 2 5 仁 l ) ; , 3
c 孙汉怡 , 等 . 丈直物学报 , 1 9 0 0 , 5 2 ( 1 0 ) :
( 、, , 4 一 0 9 一 12 收稿 )
.
2 8 0
.