全 文 ：眼镜蛇毒中蛋白质成分和微量元素锌 、 镁的分离
湖南中医学院中药系 ( 长沙 41 0 0 0 4 ) 彭新君 辛 王 娟 曾献秋料 周 小 兰料
摘要 用 CM C 一52 柱和 CM 一s eph a dx cC 一25 柱分离了眼镜蛇 Na jon a a j L. 毒中的蛋 白质及其
金属离子 Zn Z十和Mg ’ ` , 分离出20 多个蛋白峰 , 且能除去绝大多数蛋白馏分中的 z n 和 M g 。还对一
种毒性最强的不含金属离子的神经毒组分作了初步鉴 定 , 用小 鼠测得 共 半 数 致 死 量 L D 。 。 二
0
.
0 9 2m g / k g
。
关键词 眼镜蛇毒蛋 白质 锌 镁 阳离子交换柱色谱 紫外分光光度法 原子吸收分光光度法
眼镜蛇毒含有许多效应很强的有毒蛋白质 ( 神经毒和心脏毒或细胞毒素 ) 和生物酶及丰
富的微量元素〔 1一 5 〕。 本世纪初就发现眼镜蛇毒中含有异常 高二的 微 量 元 素 锌 ( 4 . 6一 5 . 6 X
105 ) 〔“ , 7 〕 。 随后发现眼镜蛇等蛇毒对卵黄的热凝固和脱水酶活性 的阻障作用 , 可被 Z n Z + 强
烈地抑制 , 开始了研究高含量锌在蛇毒中的生物学意义〔幻 , 而且 Z n “ + 和 M g “ 十对眼镜蛇毒 在
狗眼的痛觉和炎症反应中都具有阻断作用〔的 。 另外 , 眼镜蛇毒中的 5一核背酸酶活性 受 毒 中
Z n
“ + 的抑制 , 除去 Z n “ + , 其活性增加 3倍 , 而 M g “ + 则为该酶所必需〔’ ” , 1 〕 , 也为该蛇毒 中的
心脏毒素 I ( 含一 4 m g / m ol ) 的 无 机 焦 磷酸晦所必需〔’ “ 〕 。 M g Z + 还能增加该蛇毒 中 乙 酸
碱胆醋酶的稳定性和活性〔 ` ” 〕 。 近年来国外利用柱色谱等分离方法和现代仪器检测手段 来 研
究 Z n Z + 、 M g “ 十等金属元素在眼境蛇毒中及其各分离组分中的含量与毒素功能的关系 。 例 如
用活化分析法测定蛇毒透析液 ( 含 Z n3 5叩 g ) , 得 到 庄 神 经毒和出血毒中的分布分 别为
~ 42 。和 4 6 0 终g 〔14 〕 , 用同步加速器辐时法测定用阴离子交换色谱或凝胶色谱法分离的一些 组
分— 神经毒 、 细胞毒和磷酸二酷酶中的多种金属元素含量 〔’ 5〕 。 以上报道都提示 眼镜蛇 毒中的毒素或酶能结合 Z n Z十和M g “ 十而显示出各种功能 。 为研究该毒 中各种蛋 白成分中 z n Z十 、
M g
“ 十与其镇痛消炎及 酶活力等作用的关系 , 有必要制备脱 Z n “ + 、 M g “ + 的蛋 白成分 。 我 们
用 e M 一 e e l l u 一o s e和 e M 一 S e p h a d e x C 一 2 5阳离子交换柱色谱对眼镜蛇 ( N . o a j a ) 毒 中 的
蛋白质组分和金属 Z n “ 十 、 M g Z + 进行了分离 , 以紫外吸收光度法和原子吸收光度法检 测各馏
分 。 结果表明使用 C M一 eS p h a d xe C 一 25 柱色谱能从眼镜蛇毒中分离出 20 多个蛋白 峰 , 且能
除去绝大多数蛋白组分中的 Z n Z十和 M g “ 十 。 对除去金属离子 的一种神经毒组分作小 鼠半数致
死量测定 , 结果提示金属离子不影响该神经毒 之毒性 。
1 仪器与试药
1
.
1 样品 : 湖南临湘人工喂养很镜蛇 ( 万 . 。 。 aj ) 毒结晶 ( 下称湖南毒 ) , 上海 花木公司
动物采购站购得 2批眼镜蛇毒粉末 ( 下称上海毒 ) 。
1
.
2 试剂和材料 : C M一 C e l l u l o s e ( C M C一 5 2 , W h a t m a n 产品 ) , C M 一 S e p h a d e x C 一 2 5
( P h ar m
a ic a 产品 , 进 口分装 ) 。 试剂均为优级纯 , 分析纯 , 光谱纯 。 所 有 试液均用去离
子水配制 , T ir s 一 H CI (三经甲基氨基甲烷 )缓冲溶液用 C 1C 4一双硫 踪 萃 取 除 去 Z n Z十 。 3周龄
小鸡 , N I H种小鼠 。
*
A d d r e s s
:
P e n g X i n j
u n D e P a r t m e n t o f C h i
n e s e M e t e r i a M e d i e a
,
H u n a n C o l l e g e o f T r a d i t i o n a l
C h i n o s e M e d i e i n e
,
C h a n g s h a
. 中分别为我院中药系90 和91 届毕业生
了礴茜下而丽二确丽骊而 “ “ “ `
1
.
3 仪器:7 5 l G紫外分光光度计 , w F x 一 1 10 原子吸收分光光度计 , 70 型离子交换纯水器 ,
C X 一 2 05 超声波清洗仪 , p H计 , B S一 10 A 自动部分收集器 , H L 一 I恒流泵 , 硬质玻璃色谱 柱
如 . s x 4 0 c m和小2 x 50 。 m , Y S D 一 4型药理生理多用仪 ,二道生理记录仪 。 所有容器都 经 1 : 1
硝酸浸泡 , 去离子水洗净后供使用 。
2
_ 一方法和结果
1751.0
4
.
6 P Pm
2,5 0.10. 0
ǎ洲兹、如县加足公污的二à巴N
一 A Z幻 m m
… A 2 6 0 m m
“
?曰
l
引讲
ǎ哎)娜欲奎
2
.
1 C M C一 52柱色谱 : 取湖南毒 0 . 2 7 9 ,
用 4m l p H 7 . 2 , o . o l m o l / L T r i s 一 H C I
缓冲溶液放置过夜溶解 ( 冬天 5 ~ 10 ℃ ) ,
4 0 0 o r / m i
n离心 l o m i n , 上清液加到由上
述缓冲溶液平衡的 C M C一 52 柱上 (小1 . s x
4 o e m )
, 然后用 3 2 o m l p H 7 . 2 , o . o l m o l
/ L T r i s一 H C I缓冲液和 3 6 o m l o . 4 m o l /
L N a C l( 含上述缓冲液 ) 作 N a C I直 线
梯度洗脱 。 用分步收集器收集 洗 脱 液 ,
每 10 m in 一管 , 4 . s m l/ 管 , 洗脱 液 以 紫
外分光光度计分别测定 2 6 0 n m 和 2 8 0 n m
处的吸收度 ( A ) , 再用原子吸收光 度计
测定各管中的 Z n 、 M g 浓度得洗 脱 曲线
( 图 1 ) 。 且 将 所 分离的主要蛋白 峰处 . 1
一飞犷 . 6b 5 0 20 0 12 0 1 4 0
管 数
湖南眼镜蛇毒的 C M C一 52 柱色谱圈
:
、呱一加
馏分中的 z n 、 M g 浓度列于表 1 。 另外 , 用原子吸收法测得第 4 、 1 0 、 3 3 0 、 3 42 管有。 . 0 12 ~
0
.
0 2 2协 g / m l的 e u Z十 , 其余各管均未检出 。
表 1 图 1的蛋白洗脱峰馏分中 Z n和 M g的浓度 (卜 g / m l)
加l6950蛋白峰 号
馏分管号
3 4 5 6 7
8 1 6 2 1 2 8 3 1
一 Z n浓度
M g 浓度 :::: :::: :::; ;:;: :!;; ::;:
0 。 12 0
. 19
一 1 3 。 3
蛋白峰号
馏分管号
1 1 1 2 13 1生
7 1 75 9 4 1 0 1
Z n 浓度
M g浓度
0
。
9 8
5
。
7 5
0
。
0 9
0
。
7
1 5 1 6 17
1 1 0 13 0 1 37 1 4 0
0
。
4 6 2
.
2 7 4
.
6 3 4
。
5 5
注 : 表中 a 一 ” 为浓度低于。 . 01 协g / m h 1 37 号管为 Z n 峰 。
2
.
2 C M 一 S e p h a d e x C一 2 5柱色谱 : C M 一 S e p h a d e x C一 2 5柱 ( Z x s o e m ) , 用 p H S . 5 ,
0
.
05 m ol / L N H
4
A c缓冲溶液平衡 。 称取 上海毒或湖南毒 19 , 置 于 10 m l p H S . 5 , 0 . 05
m ol / L N H
4
A c 含受冲溶液中放置过夜溶解 ( 10 ℃左右 ) 或超声处理 Z h溶解 , 离心 , !取 上 清
液上柱 。 用 N H 4 A o 3个盐直线梯度和 p H梯变洗脱 。 第 l梯度为 p H S . 5 , 0 . % m ol / L N H 、 A c
缓冲溶液 , 第 2梯度为 p H 3 . 5 , 。 . s m ol / L N H ; A c缓冲溶液 , 第 3梯度为 p H 7 . o , 1 . ; m ol /
L N H
`
A c缓冲溶液 。 分 邹收集器收集洗脱浓 , 每管 15 m in , 7 . s m l/ 管或 s m l/ 管 。 洗 脱 液
按上法测定 2 6 : n m和 2 8 0n m处的吸收度及 z n 、 M g浓度 , 得洗脱曲线 ( 图 2一 4所示 ) 。 且将
分离出的主要蛋 白峰馏分中的 z n 和M g 浓度列于表 2 。 还 用紫外吸收光度法 〔 , “ 〕测得图 3的 2 02
, 1 34
.
表2 日 2的蛋白洗脱峰姗分中Z n 和M g的浓度 ( 卜g / m l)
蛋白峰号
馏分管号
Z n 浓度
M g 浓度
6 7
0
。
15
。 .
{
。 。
!:
。 1 8
0
。
0 2
8 7
0
。
0 4 ;{:
2
1
;:
0
。
0 3
3 2 7 3 4 2
4 0
。
5 4 4 。 5
O曰
203一.
nQ八”
蛋白峰号
馏分管号
Z n 浓度
M g 浓度
,
;:
1 4
2 1 0
1 4
。
4
1 5 1 6
2 2 4 2 4 0
0
。
0 8 0
。 0 3
1 6
。
8 一
1 7 1 9
2 4 7 2 8 5
0 。 0 3
注 : 表中 u一 ” 为浓度低于 0 . 0 1协g /m l , 3 2 7和 5 4 2管为无蛋白的 Z n洗脱峰 。
nLJ1人nU
、一已、山乡曰乙
兀L一
哪书爪以
二日\山à口N
碱侧絮叠
号管 ( 峰外 ) 的蛋白质浓度
为 l . 7 2 m g / m l , 用 原 子 吸
收光度 法测得其馏分中 Z n 、
M g
、
C u C a 浓 度 均 小 于
0
.
0 1件 g / m l 。
2
.
3 脱金属的神经毒 蛋 白
的鉴定和半数致死量 ( L D 。 。 )
测定 : 将图 3中的 2 02 号管馏
分上 S e P h a d e x G 一 2 5柱 ,去
离子水洗脱 , 收集脱盐的蛋
白质成分 ( 经奈氏试剂检验
无 N H + ` ) , 得脱盐 、 脱金属
离子 的神经毒 。 用小鸡颈二
腹肌实验初步鉴定该组分为
神经毒以Z〕 。 将该 馏 分用紫
外吸收光度法〔 ’ 6〕测定蛋 白 质 浓
度 , 用去离子水定量稀释作 L D S 。
实验 。
用 6 0只 小 鼠 , 体 重 1 5一 2 3
g , 随机 分 为 6个剂量组 , 每 组
1 0只 , 腹腔给药 o . Z m l / 10 9 , 观察
2 4 h死亡率为 : 剂 量 ( 协g / k g )
〔死亡只 数 / 实 验 只 数 〕 : 2 50
概
p尽钟 , ,
0
·
U协m切 L
J又 H
` A c
3 50
禅、
公O
闷
〔 1 0 / 20 〕 、 17 6 . 5 〔 1 0 / 1 0 〕 、
1 2 4
.
6 〔 6 / 1 0 〕 、 5 7 . 9 〔 5 / 10 〕 、
6 2
.
1 〔 3 / 1 0 〕和 4 3 . 8 〔 o / 1 0 〕 ,
经加权机率 单位法计算 , 得到该
神经毒素的 L D 。 。为 o . o 9 2 m g / k g ,
创架澎
圈 3 上海眼镜蛇毒的 C M一 S e ph a d e x C一 25 柱色谱图
(样品为超声处理溶解上柱 , 洗脱速度: 7 . s m l/ 管 , 1 s m in /管 )
9 5 %可信限为 0 . 0 7 6 ~ o · l l o m g / k g 。
啦中草药 》 1马, 5年第 2 6卷第 3期
.
1 3 5 ,
: {
. *,
. . _
.
_
_ _
一二t , ` 夕 v ~ . 沪、 ` ~ 人 j 呀一一 一—— .八一尸成/功一ōù人
l
日以日卫!l
3 讨论
3
.
1 由于 z n 和M g在该蛇毒 中含
量很高〔 5〕 , 且明W F X 一 1 10 原子吸
收光度计能非常灵敏地检测洗脱液
中的 Z n和 M g , 所 以选择研究这 2
种金属元素在柱色谱分离的蛇毒组
分中的分布特性 。
3
.
2 从 图 1一 4看出 , Z n 不11M g随蛇
毒蛋 白的分离而 出现多处洗 脱峰 ,
提示 Z n Z十 和 M g “ 十 与蛋白组 分 具
有一定的结合 。 就除去蛋 白成分中
的 Z n和 M g而言 , C M 一 S e p h a d e x
C 一 2气柱 色谱系统为较好 。 且以样品
一入 佗只厂l m n 飞
一 ’谈’价川 公从
1几即 。 12’ L仁_口 N 1 1一 A `召阅曰入钱 火月 ` 人 c
图 4 湖南眼镜蛇毒的C M一 S e ph a d e x C 一25 柱色谱图
( 条件同图 )
放置溶解上柱比超声处理溶解后上柱更佳 。 c M一 s eP h a d xe c 一 2 :柱色谱比 C M C一 52 柱色谱系
统使 Z n 、 M g 浓度的降低近平均高约一个数量级 ( 见表 1~ 2 ) 。可见用 C M一 eS p h a d xe C一 25
柱色谱分离该蛇毒 , 可得几乎不含 Z n 、 M g等的蛋 白质组分 。
3
.
3 绝大部分的M g 在色谱图的中部出现 。 在 C M C一 52 柱色 一谱 系 统 中 ( 图 l ) , 主要的 2个
M g峰与 2个蛋 白质峰几乎重迭 , 可能为 2种 含M g蛋白质所致 。 在 C M一 se p h a d xe C一 25 柱 色
谱系统中 ( 图 2 ) , 主要的 2个M g峰很靠近 , 仅与 2个浓度很低的蛋白质峰重迭 。
3
.
4 大量的 Z n 主要出现在色谱图的尾部 , 说明 Z n能强烈地保留在这 2种阳离子交换柱上 ,
而最后被洗脱 。 同时 , 在 C M一 S e p h a d xe C一 25 柱色谱系统中 , 放置溶样上柱作分离 , 在 蛋
白质全部流出后 , 产生 2个 Z n 高峰 ( 图 2 ) , 而在超声溶样上柱作分离 , 在蛋 白质几乎 都 流
出后 , 只出现一个 Z n 高峰 , 但它与最后一个蛋白峰部分重迭 ( 图3 、 4 ) , 原因有待研究 。
3
.
5 从图 1和图 2看出 , 对于吸收度 A 2 8 o n m < A 2 6 0 n m 的蛋白质的分离 , C M C一 52 柱色谱系
统优于 C M一 s e p h a d e x c 一 2 5柱色谱系统 , 前者可清晰地分出 5个蛋 白峰 , 而后者只勉强分 出
2个蛋 白峰 。 但对 J 二 A 2 8 O n m > A 2 6 0n m 的蛋白质 的分离 , C M一 S eP h a d ex C一 25 柱色谱系统
的效果要好得多 , 且 以流速为 7 . s m l/ 管 , 超声处理溶样上柱的情况为更佳 。
3
.
6 从 图 2一 4看出 , 蛇毒的产地和批次不 同 , 其中某些蛋 白质成分的相对含量差别很 大 。
从图 3 、 4中。 ,一 8 。管区域 },9I 峰高看 , 湖南毒和上海毒差别较大 , 而在 2 50 一 2 80 管区域 , 湖 南
毒 比上海毒少 一了一个很强的蛋 自峰 , 显示出极大的差别 。
3
.
7 对分离出的神经毒中毒性最强的蛋白质成分进行了 Z n 、 M g 、 C u 和 C a 测定后 , 表明它
的金属元素含母均 !卜常低 , 越其 : !介性似乎不受影响 , 因为我们测得 的L D : 。和以往的文献值非常
一致〔 1 , 1 8〕 。
参 考 文 献
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, 2 1 5 : 1 6 3
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B i o e ll e m e t B i o P h y s A e t a
,
1 9 5 5 , 18 : 吐5 6
1 1 K
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C o n g r I n t e r n B i o e h i m
,
R e
-
s u m e s C o m m
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,
B r u s s e l s
.
1 9 5 5
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3 6
1 2 A e h y u t h a n K E
, e 之 a l . B i o s e i , 19 3 3 , 6
( l ) : 1
1 5 K l
a s B
.
A
u g u . t i n s s o n A
r k i v K e m i
,
1 9 5 2
4 1 2 7 7
1 4 M o a v B
, e t a l
.
R
a d i o e h . m m e t h o d s A n
,
a l
,
P r o e S y m P
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S a l z b u r g A u s t r a
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1 1 3
( 19 9 3
一 1 1一 3 0收稿 )
( 上接第 12 5页 )
讨论
黄柏薄层鉴别中首先将样品酸化或碱化 ,
再用 氯仿萃取均比直接萃取效果好 。
进行含量测定时 , 使用多种有机溶剂均不
能将盐酸小果诚萃取完全 , 故采用全量蒸干后
上柱处理 , 洗脱剂选用无水 乙醉 。 如用 95 % 乙
醇洗脱 (中国药典一部 . 19 90 . 47 4 ) , 杂质洗脱
下来的要多 , 进行薄层扫描时 , 色谱背景有些
干扰 。 用无水乙醇 4 o m l洗脱后继续洗脱 , 所收
集的洗脱液中未检出盐酸小粟碱斑点 。
盐酸小桑碱的含量测定方法 已 有 不 少 报
表 复方黄柏液中盐酸小案碱含且
批 号 含量 ( m g / 1 o o m l ) 平值均
9 1 0 70 1
9 1 0 80 1
9 10 9 0 1
9 0 1 3 G2
孕10 8 0 5
9 1 0 9 0 6
9 2 G1 0 1
9 2 0 6 0 3
9 2 0 7 0谧
9 2 0 9 0 5
0
。
2 1 6
0
。
2 6 1
0
。
2 2 9
0
。
1 7 0
0
。
15 4
0
。
19 2
0
。
1 7 4
0
。
1 7 3
0
。
1 9 3
0
.
15 3
0
。
2 2 7
0
。
25 7
0
。
2 1 7
0
。
1 7 9
0
。
1 4 8
0
。
1 9 2
0
。
1 8 1
0
.
1 69
e
.
18 8
0
.
15 3
0
。
2 2 2
0
。
2 5 9
0
.
2 2 3
0
.
1 7 4
0
。
1 5 1
0
。
1 9 2
0 . 1 7 8
0
。
1 7 1
0
。
1 9 0
0
。
1 5 3
道 , 由于本品为滚体制剂且盐酸小粟碱含量较低 ,其他成分千扰大 ,柱层一紫外分光光度法 , 计
算紫外分光光度法等均不适用 。 将样品蒸至近干用氯仿一盐酸 ( 1 0 : l ) 回流提取 〔李同芬 .
中国中药杂志 , 19 8 9 , 14 ( 6 ) : 3 3 〕 , 制备供试品溶液 , 薄层扫描测定结果偏 低 。 经 过反
复试验摸索 , 采用了柱层分离后 , 再用薄层扫描法测定 。 文中所述定性和定量方法简便易行 ,
结果可靠 , 专属性强 , 重现性好 ,可用于监测产品的内在质量 。
( 19 9 3
一 2 0一 1 2收稿 )
《 中草药 》 1 9 9 5年第 2 6卷第 a 助 . 13 7 -