全 文 ：研究报告
Research Report
十字花科黑腐病菌 dsbA基因控制的亚细胞蛋白质组分析
岑卫健 1 刘龙宇 2 于凯 2 甘永亮 2 付强 1 姜伯乐 1, 2*
1亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁, 530004; 2广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530004
*通讯作者, jbl1971@gxu.edu.cn
摘 要 本研究以十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc) 8004菌株为研究对象，采
用双向电泳－质谱技术分析比较了 dsbA1A2突变体和野生型菌株的分泌蛋白、周质蛋白表达谱。与野生
型菌株相比，选取的 31个差异蛋白中，14个蛋白点显著上调，17个蛋白点显著下调。对这些蛋白质点进
行质谱鉴定和分析，结果显示，dsbA1A2基因的缺失导致了周质蛋白中与 β桶结构膜蛋白形成有关的伴
侣蛋白 SurA的含量降低，几种未知功能的分泌蛋白的分泌量减少以及外膜蛋白 OmpW、OmpW1在周质
空间的积累。推测这些蛋白质对 Xcc 8004的致病性至关重要，为进一步研究 Xcc 8004中 DSB系统的作
用机理提供了依据。
关键词 Xcc, dsbA1A2,双向电泳,质谱, SurA
Identification of Subcellular Proteomes Controlled by dsbA in Xanthomonas
campestris pv. campestris
Cen Weijian 1 Liu Longyu 2 Yu Kai 2 Gan Yongliang 2 Fu Qiang 1 Jiang Bole 1, 2*
1 State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Guangxi University, Nanning, 530004; 2 College of Life Sci-
ence and Technology, Guangxi University, Nanning, 530004
* Corresponding author, jbl1971@gxu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.035.001428
Abstract This study analyzed the expression spectrum of the secreted proteins and periplasmic proteins between
the dsbA1A2 mutant and the wild type strain in cruciferous black rot pathogen (Xanthomonas campestris pv. ca-
mpestris, Xcc) 8004 strains. Two-dimensional electrophoresis combined with mass spectrometry identification me-
thod were utilized. Compared with the wild-type strains, dsbA1A2 mutant showed 14 significantly up-regulated
and 17 significantly down-regulated proteins in the 31 selected proteins. Identification and analysis of these
proteins by mass spectrometry, showed that the knockout of dsbA1A2 leaded to the chaperone SurA, which was
associated with the formation of beta-barrel membrane proteins, decreased in periplasmic proteins. The dsbA1A2
mutant strain exhibited the reduction of several kinds of unknown function proteins, and also caused accumulation
of the outer membrane protein OmpW and OmpW1 in the periplasmic space. It speculated that these proteins were
critical to the pathogenicity of Xcc 8004. Therefore, this study might provide the theory basis accounting for the
further mechanism research of DSB system in Xcc 8004.
Keywords Xcc, dsbA1A2, 2-DE, Mass spectrometry, SurA
基金项目：本研究由广西教育厅基金一般项目(KY2015YB012)和广西创新研究团队项目(2014GXNSFFA118005)共同资助
基因组学与应用生物学，2016年，第 35卷，第 6期，第 1428-1436页
Genomics and Applied Biology, 2016, Vol.35, No.6, 1428-1436
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.
campestris, Xcc)是能够引起几乎所有的十字花科植
物黑腐病，是研究病原菌与植物互作的模式菌株之
一。二硫键形成于蛋白半胱氨酸(Cys)残基之间，对于
蛋白的结构和稳定性起到至关重要的作用。分泌蛋
白和膜蛋白二硫键的形成需要 DSB 家族蛋白的加
工，DSB蛋白二硫键加工系统包括 DsbA/DsbB二硫
键氧化途径以及 DsbC/DsbD 二硫键异构化途径
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
(Peek and Taylor, 1992)。首先被鉴定的 DSB蛋白是
DsbA，最早是 1991年由 Jon Beckwith鉴定，dsbA基
因突变体由于周质蛋白正确折叠受阻，表现出碱性
磷酸酶、外膜蛋白 OmpA等水平降低。DsbA是一种
强氧化蛋白，蛋白内包含一对不稳定的二硫键，能直
接催化底物蛋白自由巯基之间二硫键的形成(Kadok-
ura and Beckwith, 2010)。DsbA与多种致病因子相关，
Paeruginosa中报道，DsbA蛋白会影响到金属蛋白酶、
脂蛋白酶的正确折叠和分泌(Braun et al., 2001; Urban
et al., 2001)；在 Yersinia pestis中，通过免疫印迹证实
T3SS 外膜装置复合体 YscC 的稳定表达依赖于
DsbA (Jackson and Plano, 1999)。基因组注释 Xcc 8004
菌株中存在 dsbA1 (XC0764)、dsbA2 (XC0765)。
双向电泳-质谱技术是广泛应用的传统蛋白质
组学技术，具有简便、快速、高分辨率和重复性等优
点，广泛应用于生物、农业、医学等研究领域。双向电
泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，现已经
实现了分离和分析几千个蛋白质的分辨率，而被广
泛用于病原菌致病机制的研究。在硬粒小麦中利用
双向电泳的方法分析了亲缘关系较近的不同株系
的遗传多样性(Picard et al., 1997)。Erwinia carotovora
subsp. atroseptica 中通过双向荧光差异凝胶电泳
(2D-DiGE)结合 LC-MS/MS鉴定了十几种受到 DsbA
影响较大的二型分泌酶，其中包括果胶裂解酶、金属
蛋白酶、纤维素酶、半乳糖醛酸内切酶等(Coulthurst
et al., 2008)。
本实验室前期研究证实 Xcc 8004 dsbB突变体
菌株的致病性显著降低，效应物的转运受阻。但是
没有直接证据证实与 DsbB相关的蛋白。为了进一
步证实二硫键合成缺陷导致的影响，本实验以与底
物直接作用的二硫键合成酶 DsbA为研究对象，构
建 dsbA1A2基因的突变体，分别提取野生菌株和突
变菌株的分泌蛋白质，采用双向电泳-质谱技术大
范围鉴定野生型菌株和突变体菌株的分泌差异蛋
白质。期望进一步揭示 DSB系统对 Xcc 8004菌株
的重要功能。
1结果与分析
1.1 dsbA1A2缺失突变体的构建和验证
将重组质粒 pJCdsbA1 通过三亲本接合导入
8004菌株，得到 8004/pJCdsbA1并以之为受体菌，经
pRK2073帮助再将供体菌中重组质粒 pKDdsbA1A2
导入 8004/pJCdsbA1，通过同源双交换基因组上的
dsbA1A2基因，得到 DdsbA1A2菌株的 dsbA1互补
菌株即 CdsbA1，然后根据质粒的不相容性，将与
pLARFJ不相容的质粒 pPH1JI两亲本接合导入 Cds-
bA1菌株，通过 Rif、Gm、Spc抗生素筛选得到了含有
pPH1JI质粒的双缺失突变体菌株 DdsbA1A2 (图 1)。
提取得到的候选菌株的总 DNA为模板，分别用引
物：YZdsbA1A2F/YZdsbA1A2R、CdsbA1A2F/CdsbA-
1A2R、XC_0765F/XC_0765R，PCR验证，并采用 Xcc
8004和 DdsbA1菌株的总 DNA作为对照(图 2)，将验
证正确的菌株命名为 DdsbA1A2，用于下一步研究。
1.2双向电泳鉴定差异分泌蛋白
1.2.1 DdsbA1A2与 Xcc 8004分泌蛋白质组差异分析
研究采用 XCM2诱导培养基诱导培养 12后提
图 1缺失突变体 DdsbA1A2的构建流程
Figure 1 Flow diagram to construct deletion mutant DdsbA1A2
图 2 DdsbA1A2的总 DNA PCR验证
注: A: DdsbA1A2验证; 1, 3, 5: 扩增 dsbA1A2 基因的外侧片
段; 2, 4, 6: 扩增 dsbA1A2 基因的互补片段; B: DdsbA1A2 验
证; 1, 2, 3:扩增 dsbA2基因内部片段
Figure 2 PCR amplification of deletion mutant DdsbA1A2
Note: A: PCR verification of DdsbA1A2; 1, 3, 5, The outside
fragment of dsbA1A2; 2, 4, 6: The complementary fragment of
dsbA1A2; B: PCR verification of DdsbA1A2; 1, 2, 3: The inside
fragment of dsbA1A2
1429
取分泌蛋白，按照 3.4中所述方法提取 Xcc 8004和
DdsbA1A2 的分泌蛋白质组，用 Bradford 方法测定
分泌蛋白的浓度，各取 150 μg样品上样，使用 24 cm，
pH 3~10，NL胶条。
根据 2D-PAGE 显示的蛋白差异 (图 3)，选取
DsbA1A2明显下调的 9个蛋白点，分别编号为 D1~
D9，进行质谱鉴定(表 1)。
对挑选的 9个蛋白的质谱鉴定显示，其中 4个
为胞内蛋白、4个胞外蛋白以及 1 个膜蛋白。表明
分泌蛋白的提取存在较为严重的泄漏，由于诱导培
养和提取过程中细胞裂解所致。鉴定的 4个胞外蛋
白都是假定蛋白，也没有找到具有含 2个 Cys以上
的，因此，都不是 DsbA蛋白的作用潜在底物。膜蛋
白 XC3694是 OmpW的同源蛋白，在多种革兰氏阴
性细菌中报道，DsbA 蛋白的缺失会导致 OmpA 等
蛋白的含量降低。
1.2.2 DdsbA1A2与 Xcc 8004周质蛋白质组差异分析
研究采用 XCM2诱导培养基诱导培养 12 h 后
提取周质蛋白，按照 3.4所述方法提取 Xcc 8004和
DdsbA1A2的周质蛋白质组，用 Bradford方法测定
周质蛋白的浓度，各取 150 μg样品上样，使用 24 cm，
pH 3~10，NL胶条。
根据 2D-PAGE 显示的蛋白差异 (图 4)，选取
DsbA1A2明显下调的 8个蛋白点，分别编号为 D1~
D8；选取选取 DsbA1A2明显上调的 14个蛋白点，分
别编号为 U1~U14进行质谱鉴定(表 2)。
对挑选的 5个下调蛋白的质谱鉴定显示，其中
有 2个预测为胞内蛋白，由提取过程中泄漏所致。其
中 D1号样品鉴定为周质蛋白 SurA，是一种肽酰-
注:表中未对胞内高丰度蛋白进行分析预测,为样品制备时泄漏造成;定位信息通过 PSORTb软件在线预测;结构域及同源信
息来自 KEGG数据库注释及 SMART软件在线预测
Note: It did not analyze the intracellular proteins of high abundance ratio, which leaked at the sample preparation. Location informa-
tion was from PSORTb online prediction; Domain and the homologous information came from KEGG annotation and SMART online
prediction
样品
Sample
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
注释
Annotation
50S核糖体蛋白 L9
50S ribosomal protein L9
50S核糖体蛋白 L10
50S ribosomal protein L10
外膜蛋白
Outer membrane protein
假定蛋白
Hypothetical protein
伴侣蛋白 GroES
co-chaperonin GroES
保守分泌蛋白
Conserved putative
secreted protein
延伸因子 P
Elongation factor P
假定蛋白
Hypothetical protein
假定蛋白
Hypothetical protein
半胱氨酸数目
No. of Cys
0
1
1
0
1
基因号
Gene ID
XC3694
XC2932
XC0534
XC4185
XC0007
XC2921
蛋白质定位
Location
胞内
Inside
胞内
Inside
细胞膜
Membrane
胞外
Outside
胞内
Inside
胞外
Outside
胞内
Inside
胞外
Outside
胞外
Outside
结构域 /同源性
Domain or homology
外膜蛋白 OmpW
OmpW
DUF结构域
DUF domain
脂蛋白
Lipoprotein
GroES hsp60家族结构域
GroES hsp60 family
Ysc84样结构域
Ysc84-like (0.3)
含 TPR结构域蛋白 NrfG
TPR-repeat-containing proteins NrfG
NAD依赖的乙醇脱氢酶
NAD-dependent aldehyde
dehydrogenase
文献报道
Related report
OmpA (2 cys),
X, F, E (E. coli)
ECA2118 HecA
Hemagglutinin-like
表 1 DdsbA1A2和 Xcc 8004差异分泌蛋白质的质谱鉴定
Table 1 MS identification of differential secretory proteins between DdsbA1A2 and Xcc 8004 strains
十字花科黑腐病菌 dsbA基因控制的亚细胞蛋白质组分析
Identification of Subcellular Proteomes Controlled by dsbA in Xanthomonas campestris pv. campestris 1430
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
脯氨酰顺反异构酶，在周质空间行驶分子伴侣的功
能，参与到多种外膜富含 β桶结构的蛋白的折叠。但
DsbA蛋白对 SurA的这种影响是间接的，因为 SurA
蛋白中不含 Cys，不是 DsbA蛋白参与二硫键合成的
底物。这种影响还需要进一步通过遗传学实验证实。
对挑选的 10 个上调蛋白的质谱鉴定显示，其
中有 5个预测为胞内蛋白，1 个为质膜蛋白，其余
为膜蛋白及周质蛋白。在鉴定的上调蛋白中，含有硫
酸盐 ABC转运结合蛋白(ABC transporter sulfate bi-
nding protein)以及多个外膜蛋白 OmpW、OmpW1同
源蛋白等。
2讨论
本研究中对 DdsbA1A2及 Xcc 8004的亚蛋白质
组进行了差异分析，结果显示，dsbA基因的缺失导致
了周质蛋白中与 β桶结构膜蛋白形成有关的伴侣蛋
白 SurA的含量降低，严重影响了细胞外膜的正常功
能。但这种作用并非 DsbA蛋白直接作用，可能是通
过其它水平的间接影响。蛋白质组差异还表明，几种
未知功能的分泌蛋白的分泌量减低，膜蛋白 OmpW，
OmpW1同源蛋白在周质空间的积累，但它们也并非
DsbA蛋白的作用底物。
在筛选的差异周质蛋白中，含有硫酸盐 ABC转
运结合蛋白，其能够特异地结合硫酸盐，并参与到其
跨膜的运输当中。硫酸盐分子中带电氧原子的稳定
图 3 DdsbA1A2和 Xcc 8004分泌组蛋白差异
注: A: 2D-PAGE对分泌组蛋白的分离; B:部分质谱鉴定的差
异蛋白点放大图示;图中 50 S ribosomal protein 包含两个样
品,自上而下分别为 D1, D2
Figure 3 Secretion protein difference of DdsbA1A2 and Xcc 8004
Note: A: The 2-DE gel of the extracellular proteins; B: Partial
enlarged difference MS identification points; The 50 S ribosomal
protein contains two samples, which represent D1, D2 from top
to bottom
图 4 DdsbA1A2和 Xcc 8004周质蛋白差异
注: A: 2D-PAGE 对周质蛋白的分离, D表示下调, U表示上
调; B: DdsbA1A2中显著下调蛋白中选择进行质谱鉴定的蛋
白点放大图示; C: DdsbA1A2中显著上调蛋白中选择进行质
谱鉴定的蛋白点放大图示
Figure 4 Periplasmic protein difference of DdsbA1A2 and Xcc
8004
Note: A: The 2-DE gel of the periplasmic proteins, D represents
down-regulated and U represents up-regulated; B: Significantly
down-regulated enlarged MS identification points in DdsbA1A2;
C: Significantly up-regulated enlarged MS identification points in
DdsbA1A2
1431
需要蛋白特定残基的氢键来维持，而不是靠盐桥的
形成(Pflugrath and Quiocho, 1985)。还有一些外膜蛋
白 OmpW、OmpW1，同源蛋白它们都具有 β-桶状结
构，能够维持外膜的通透性和结构稳定。折叠好的外
膜蛋白具有极强的稳定性，细菌的耐热相关蛋白
DegP/HtrA 通过 Skp 和 SurA 识别折叠态的外膜蛋
白来抵抗环境胁迫从而维持其致病性(Sklar et al.,
2007)。另外，质谱鉴定到一些预测的胞质蛋白，推测
可能是在提取过程中这些蛋白发生了泄露。
本研究主要鉴定了 DdsbA1A2与 Xcc 8004的分
泌蛋白、周质蛋白的差异，利用生物信息学手段，对
分泌蛋白质系统的功能、定位以及结构域作了分析，
为进一步研究分泌蛋白质提供了方法与理论指导，
有利于我们深入认识植物和微生物互作，致病机理
及防御反应等重要的事件。
然而，2D-PAGE对蛋白质组差异的研究还非常
文献报道
Related report
Denoncin et al.,
2010
表 2 DdsbA1A2和 Xcc 8004差异周质蛋白质的质谱鉴定
Table 2 MS identification of differential periplasmic proteins between DdsbA1A2 and Xcc 8004 strains
样品号
Sample
D1
D2
D3
D4
D5
U1
U2
U3
U4
U5
U6
U7
U8
U9
U10
注释
Annotation
SurA (肽酰脯氨酰顺反异构酶)
SurA (Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase)
MinD (隔膜点定位蛋白)
MinD (Septum site-determining protein)
AroE (莽草酸脱氢酶)
AroE (shikimate 5-dehydrogenase)
假定蛋白
Hypothetical protein
假定蛋白
Hypothetical protein
LeuB (3-异丙基苹果酸脱氢酶)
LeuB (3-isopropylmalate dehydrogenase)
假定蛋白
Hypothetical protein
SlyD (肽酰脯氨酰顺反异构酶)
SlyD (peptidyl-prolyl cis-trans isomerase)
假定蛋白
Hypothetical protein
DNA结合相关蛋白
DNA-binding related protein
双组分系统调节蛋白
Two-component system regulatory protein
3-羰酰-ACP合酶
3-oxoacyl-ACP synthase
2-氨基-3-丁酮酸CoA连接酶
2-amino-3-ketobutyrate CoA ligase
硫酸 ABC转运子底物结合蛋白
Sulfate ABC transporter
substrate-binding protein
假定蛋白
Hypothetical protein
半胱氨酸数目
No. of Cys
0
3
2
1
2
2
0
0
0
1
1
3
7
1
1
基因号
Gene ID
XC3438
XC3122
XC4041
XC2418
XC3696
XC0836
XC3694
XC2929
XC0970
XC1163
XC3452
XC3225
XC3296
XC3295
XC2932
蛋白质定位
Location
细胞周质
Periplasmic
细胞质
Cytoplasmic
细胞质
Cytoplasmic
未知
UK
未知
UK
细胞质
Cytoplasmic
细胞外膜
Outer membrane
细胞质
Cytoplasmic
细胞外膜
Outer membrane
细胞质
Cytoplasmic
细胞质
Cytoplasmic
细胞质膜
Cytoplasmic
Membrane
细胞质
Cytoplasmic
细胞周质
Periplasmic
细胞外膜
Outer Membrane
结构域 /同源性
Domain or homology
-
-
OmpW
OmpW1
ColR
FabF
Kbl
Sbp
-
注:表中相关预测及分析方法同表 1
Note: The prediction and analysis method were same to table 1
十字花科黑腐病菌 dsbA基因控制的亚细胞蛋白质组分析
Identification of Subcellular Proteomes Controlled by dsbA in Xanthomonas campestris pv. campestris 1432
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
局限，主观性也较强，鉴定量还不够，尤其是针对细
菌的分泌蛋白，大都属于中低丰度蛋白，需要进一步
采用高灵敏度、高分辨率的串联飞行时间质谱标记
定量或非标记定量能够有效地筛选差异蛋白。
3材料与方法
3.1菌株及培养条件
大肠杆菌(Escherichia coli)的培养：37℃，LB (lys-
ogeny broth)培养基培养(Miller et al., 1972)，Xcc的培
养：28℃，NYG (nutrient yeast glycerol) (Daniels et al.,
1984)和 XCM2 (岑卫健等, 2014)培养基培养。抗菌素
氨苄青霉素 (ampicillin, Amp)、四环素 (tetracycline,
Tc)、卡那霉素 (kanamycin, Km)、利福平 (rifampicin,
Rif)的使用参见文献(蒋国凤等, 2014)。本研究所使用
的菌株及质粒(表 3)。
3.2引物和试剂
DNA分子量 Marker、限制性内切酶、DNA聚合
酶和 T4 DNA连接酶购自美国 Sigma公司；胶回收
菌株和质粒
Strains and plasmids
Xcc 8004
8004/pPH1JI
DdsbA1
DdsbA1A2
Escherichia. coli
DH5α
pKDdsbA1
pKDdsbA2
pKDdsbA1A2
pLJCdsbA1
Plasmids
pK18mobSacB
pRK2073
pPH1JI
pLAFRJ
pKDdsbA1
pKDdsbA1A2
pLJCdsbA1
相关特征
Characteristics
野生型菌株; Rif
Wild type; Rif
8004 containing plasmid pPH1JI; Rif, Gm, Spc
dsbA1基因的缺失突变体; Rif
dsbA1 deletion mutant of 8004; Rif
dsbA1和 dsbA2双基因的缺失突变体; Rif, Gm, Spc
dsbA1A2 deletion mutant of 8004 containing plasmid pPH1JI; Rif, Gm, Spc
Ф80, ΔlacZM15, recA1, endA1, deoR
含有重组质粒 pKDdsbA1的 DH5α菌株; Kan
DH5α containing pKDdsbA1; Kan
含有重组质粒 pKDdsbA2的 DH5α菌株; Kan
DH5α containing pKDdsbA2; Kan
含有重组质粒 pKDdsbA1A2的 DH5α菌株; Kan
DH5α containing pKDdsbA1A2; Kan
含有重组质粒 pLJCdsbA1的 DH5α菌株; Tc
DH5α containing pLJCdsbA1; Tc
连有 sacB基因的自杀质粒; Km
Suicide plasmid containing sacB; Km
Helper plasmid; Tra+, Mob+, ColE1, Spc
Tra+, Mob+, IncP replicon, Spc, Gm
pLAFR3的衍生质粒,带有 pUC19多克隆位点; Tc
pLAFR3 derivate containing the multiple cloning sites of pUC19; Tc
克隆有 dsbA1基因上下游片段的 pK18mobSacB载体; Kan
pK18mobSacB containing the up and down stream fragments of dsbA1; Kan
克隆有 dsbA1A2基因上下游片段的 pK18mobSacB载体; Kan
pK18mobSacB containing the up and down stream fragments of dsbA1A2; Kan
克隆有包含 dsbA1基因 ORF的 pLAFRJ载体; Tc
pLAFRJ containing the ORF fragment of dsbA1; Tc
来源
Sources
Daniels et al., 1984
本研究
This study
本研究
This study
本研究
This study
Gibco BRL, Life
Technologies
本研究
This study
本研究
This study
本研究
This study
本研究
This study
Sch覿fer et al., 1994
Leong et al., 1982
Hirsch and Beringer, 1984
本实验室
Our lab.
本研究
This study
本研究
This study
本研究
This study
表 3本研究所使用的菌株和质粒
Table 3 Strains and plasmids used in this research
1433
试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和质粒抽提试剂盒购
自美国 Watson公司，双向电泳相关试剂购自美国
GE公司。引物均由华大基因合成(表 4)。
3.3缺失突变体的构建及验证
通过互补了 dsbA1 基因的 8004 菌株为出发菌
株，通过同源双交换基因组上的 dsbA1A2基因，得到
DdsbA1A2菌株的 dsbA1互补菌株即 CdsbA1，然后
根据质粒的互补相容性将重组质粒 pJCdsbA1排挤，
通过抗生素筛选得到了含有 pPH1JI质粒的双缺失
突变体菌株 DdsbA1A2。
3.4蛋白质的提取、纯化及定量
胞外分泌蛋白提取：按 2%的接种量转接过夜培
养的菌液于 50 mL NYGB 中，摇床培养至 OD600=
0.4~0.6，离心收集菌体；用 XCM2 培养基洗涤菌体
2次，去除菌体中的一些杂质和；20 mL XCM2培养
基重悬菌体，测定 OD600；按 8%的接种量转接于
400 mL XCM2培养基中，诱导培养 12 h；离心收集
上清，加入蛋白酶抑制剂 PMSF；上清液经 0.22 μm
的滤膜过滤除菌，得到胞外分泌蛋白的粗提液；将粗
提液用 15 mL，10 kD 超滤管超滤浓缩至 10 mL 左
右；加入 3~6倍体积的丙酮，3 h以上或过夜沉淀蛋白；
离心，弃去上清，将得到的沉淀块晾干约(10 min)，但
不能太干；用适当的蛋白溶剂溶解沉淀块，即得到了
胞外分泌蛋白液(岑卫健等, 2010)。
周质蛋白的提取：本实验采用 TSE Buffer提取
周质蛋白，将培养好的菌体转入 50 mL离心管中，
4℃，4 000 r/min，20 min离心收集菌体；沉淀用适量
TSE buffer 温和重悬；冰浴 30 min 后，转移至 2 mL
离心管；4℃，16 000 r/min，30 min离心，小心吸取上
清，即为周质蛋白液。
3.5双向电泳分离
用 Bradford方法测定蛋白液的浓度，各取 150 μg
样品上样，使用 24 cm，pH 3~10，NL胶条。加入 1%
的 DTT和 0.5%的相应 IPG Buffer，按照上样量和所
需蛋白样品体积混匀上样，撕掉 IPG胶条的支持膜，
胶面朝下，压入完整的胶条，不能产生气泡以免影响
样品聚焦；在胶条上加入 Immobiline DryStrip覆盖
油，按照如下程序进行等电聚焦：30 V 6 h、50 V 6 h、
200 V 1 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000V 1 h、80 000 Vs
10 h、1 000 V 10 h。一向电泳结束后转至第二向
SDS-PAGE胶 100 V，40 mA电泳，待指示剂迁移至
分离胶合适位置停止电泳。染色完成后，用 Image
Scanner软件扫描凝胶，用 Image Master 2D platinum
进行图像分析，差异的蛋白质点挖取出来置于 1.5 mL
的 EP内，-20℃保存备用(岑卫健等, 2015a; 2015b)。
3.6质谱鉴定
吸取 0.5μL经胶内酶解的样品点样于质谱 384孔
靶对应靶位，将样品置于室温自然晾干，加入饱和的
注: E: EcoRⅠ; B: BamHⅠ; H: HindⅢ; X: XbaⅠ
Note: E: EcoRⅠ; B: BamHⅠ; H: HindⅢ; X: XbaⅠ
引物名称
Primer name
XC_0764L-F
XC_0764L-R
XC_0764R-F
XC_0764R-R
XC_0765L-F
XC_0765L-R
XC_0765R-F
XC_0765R-R
XC_0765F
XC_0765R
CdsbA1A2F
CdsbA1A2R
YZdsbA1A2F
YZdsbA1A2R
引物序列(5-3)
Sequence (5-3)
GGGGAATTCCCTGCTGCCGCTGGCCGCCT
GGGGGATCCAGCGGGTCTTCATCGGATTG
GGGGGATCCTGGCCAAGTGACCCGAGCGA
GGGTCTAGACGATCACCAGGCTGTCGCTG
GGGGAATTCTCACGGGCCGGACGGCAACC
GGGGGATCCGTTCATGCGGGCTCCGAGGG
GGGGGATCCCTGAGCCGCATAACCGCCAT
GGGAAGCTTCTTGGCATAGAAACCGGCGA
GTTTTCCCGTCTGTCGCTGC
GCTTTTCGTGGATGGCGTCG
TAGGAATTCGTCAAGGACCTCACCGCGCAG
TAGAAGCTTCCAGCTGCGGGTCACGTAGTC
AAT GGACAAGAAGGCCCCGCCGGTGGAA
ATT GTGCGTCACGTGGCGTGCTCCAACG
酶切位点
Enzyme
E
B
B
X
E
B
B
H
E
H
产物长度(bp)
Product length (bp)
737
730
729
718
365
939
178
表 4本研究使用引物
Table 4 Primers used in this study
十字花科黑腐病菌 dsbA基因控制的亚细胞蛋白质组分析
Identification of Subcellular Proteomes Controlled by dsbA in Xanthomonas campestris pv. campestris 1434
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
溶解基质 α- 氰基 -4 羟基肉桂酸 (a-Cyano-4-hy-
droxycinnaniic acid, CHCA)，并用已知质量数的混合
肽段作外标校准。将靶盘放入质谱仪 MULDI
TOF/TOF 4 800内，设置质谱参数：一级质谱模式：反
射、激光：4 000、肽段质粒：800~4 000 Da；二级质谱
加速电压：20 KV。将一级、二级质谱数据导入 GPS
综合分析，并收索 Mascot数据库收索相匹配的蛋白
(黄愉淋等, 2014)。
作者贡献
姜伯乐负责实验项目的构思；岑卫健、于凯、甘
永亮和付强共同完成实验操作、数据分析；刘龙宇完
成数据整理分析和论文写作。全体作者都阅读并同
意最终的文本。
致谢
本研究由广西教育厅基金一般项目(KY2015YB
012)和广西创新研究团队项目(2014GXNSFFA118
005)共同资助。国家重点实验室技术支撑组人员对本
实验大力支持。
参考文献
Braun P., Ockhuijsen C., Eppens E., Koster M., Bitter W., and
Tommassen J., 2001, Maturation of Pseudomonas aerugi-
nosa elastase, Formation of the disulfide bonds, J. Biol.
Chem., 276(28): 26030-26035
Cen W.J., Cheng C.Y., Yang L.C., Wang L., and Jiang B.L.,
2015a, Establishment and optimization analysis of two-di-
mensional electrophoresis system for the secreted proteins of
Xanthomonas campestris pv. campestris, Jiyinzuxue Yu Yin-
gyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 34(2):
403-407 (岑卫健,成春燕,杨丽超,王凛,姜伯乐, 2015a,十
字花科黑腐病菌分泌蛋白质双向电泳条件的构建及优化,
基因组学与应用生物学, 34 (2): 403-407)
Cen W.J., Jiang B.L., Yang C., Wang J.Z., Yang L.C., He Y.Q.,
and Tang J.L., 2010, Establishment of a method for prepara-
tion of the secretome samples from Xanthomonas campestris
pv. campestris for two dimensional electrophoresiss, Jiy-
inzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied
Biology), 29(3): 588-592 (岑卫健,姜伯乐, 杨超, 王金子,
杨丽超,何勇强,唐纪良, 2010,野油菜黄单胞菌分泌组双
向电泳样品制备方法的建立,基因组学与应用生物学, 29
(3): 588-592)
Cen W.J., Liu J., Fu Q.X., Yang L.C., Zhu P.C., and Jiang B.
L., 2015b, Identification of two-dimensional electrophoresis
system for the secreted proteins controlled by HrcV in
Xanthomonas campestris pv. campestris, Xinan Nongye Xu-
ebao (Southwest China Journal of Agricultural Sciences), 28
(1): 120-126 (岑卫健,刘娇,付秋霞,杨丽超,朱平川,姜伯
乐, 2015b,利用双向电泳构建十字花科黑腐病菌 HrcV控
制的分泌蛋白质图谱,西南农业学报, 28(1): 120-126)
Cen W.J., Yu K., Gan Y.L., Huang D.L., Fu Q., and Jiang B.L.,
2014, Expression profile analysis of secreted proteins in
Xanthomonas campestris pv. campestris, Jiyinzuxue Yu Yin-
gyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 33(2):
386-391 (岑卫健,于凯,甘永亮,黄德伦,付强,姜伯乐, 2014,
十字花科黑腐病菌分泌蛋白表达谱分析,基因组学与应
用生物学, 33(2): 386-391)
Coulthurst S.J., Lilley K.S., Hedley P.E., Liu H., Toth I.K., and
Salmond G.P., 2008, DsbA plays a critical and multifaceted
role in the production of secreted virulence factors by the
phytopathogen Erwinia carotovora subsp. atroseptica, J. Biol.
Chem., 283(35): 23739-23753
Daniels M.J., Barber C.E., Turner P.C., Sawczyc M.K., Byrde R.
J., and Fielding A.H., 1984, Cloning of genes involved in
pathogenicity of Xanthomonas campestris pv. campestris us-
ing the broad host range cosmid pLAFR1, EMBO J., 3(13):
3323-3328
Denoncin K., Vertommen D., Paek E., and Collet J.F., 2010, The
protein-disulfide isomerase DsbC cooperates with SurA and
DsbA in the assembly of the essential β-barrel protein LptD,
J. Biol. Chem., 285(38): 29425-29433
Hirsch P.R., and Beringer J.E., 1984, A physical map of pPH1JI
and pJB4JI, Plasmid, 12(2): 139-141
Huang Y.L., Fu Q., Huang D.L., Chen F.M., Huang F.L., Liang
X.W., Zhang M., and Lu K.H., 2014, 2-DE differential anal-
ysis of ALB/IgG removal buffalo follicular fluid, Xumu
Shouyi Xueao (Chinese Journal of Animal and Veterinary Sc-
iences), 45(7): 1113-1119 (黄愉淋,付强,黄德伦,陈富美,
黄凤玲,梁贤威,张明,卢克焕, 2014,去除高丰度蛋白质
后水牛卵泡液的双向电泳差异分析, 畜牧兽医学报, 45
(7): 1113-1119)
Jackson M.W., and Plano G.V., 1999, DsbA is required for sta-
ble expression of outer membrane protein YscC and for ef-
ficient Yop secretion in Yersinia pestis, J. Bacteriol., 181
(16): 5126-5130
Jiang G.F., Wu Q.J., Liang X.X., Yang L.C., Yang L.Y., Wang
L., Wu X.J., and Jiang B.L., 2014, Putative promoter region
of typeⅢ effector gene avrACXcc8004 in Xanthomonas ca-
mpestris pv. Campestris, Weishengwu Xuebao (Acta Micro-
biologica Sinica), 54(2): 159-166 (蒋国凤,吴秋菊,梁晓夏,
杨丽超,阳丽艳,王凛,吴小建,姜伯乐, 2014,十字花科黑
腐病菌Ⅲ 型效应物基因 avrACXcc8004 推测的启动子
区,微生物学报, 54(2): 159-166)
Kadokura H., and Beckwith J., 2010, Mechanisms of oxidative
1435
protein folding in the bacterial cell envelope, Antioxidants &
Redox Signaling, 13(8): 1231-1246
Leong S.A., Ditta G.S., and Helinski D.R., 1982, Heme biosyn-
thesis in Rhizobium, identification of a cloned gene coding
for delta-aminolevu-linic acid synthetase from Rhizobium
meliloti, J. Biol. Chem., 257(15): 8724-8730
Miller J.H., ed., 1972, Experiments in molecular genetics, Cold
Spring Harbor Laboratory, New York, USA, pp.1-466
Peek J.A., and Taylor R.K., 1992, Characterization of a periplas-
mic thiol: disulfide interchange protein required for the
functional maturation of secreted virulence factors of Vibrio
cholera, Proc. Nall. Acad. Sci. USA, 89(13): 6210-6214
Pflugrath J.W., and Quiocho F.A., 1985, Sulphate sequestered in
the sulphate-binding protein of Salmonella typhimurium is
bound solely by hydrogen bonds, Nature, 314(6008): 257-260
Picard P., Bourgoin-Grenèche M., and Zivy M., 1997, Potential
of two-dimensional electrophoresis in routine identification
of closely related durum wheat lines, Electrophoresis, 18(1):
174-181
Sch覿fer A., Tauch A., J覿ger W., Kalinowski J., Thierbach G., and
Pühler A., 1994, Small mobilizable multi-purpose cloning
vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18
and pK19: selection of defined deletions in the chromosome
of Corynebacterium glutamicum, Gene, 145(1): 69-73
Sklar J.G., Wu T., Kahne D., and Silhavy T.J., 2007, Defining the
roles of the periplasmic chaperones SurA, Skp, and DegP in
Escherichia coli, Genes Dev., 21(19): 2473-2484
Urban A., Leipelt M., Eggert T., and Jaeger K.E., 2001, DsbA
and DsbC affect extracellular enzyme formation in Pseu-
domonas aeruginosa, J. Bacteriol., 183(2): 587-596
十字花科黑腐病菌 dsbA基因控制的亚细胞蛋白质组分析
Identification of Subcellular Proteomes Controlled by dsbA in Xanthomonas campestris pv. campestris
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