全 文 ：收稿日期：２０１４－０３－２６
修回日期：２０１４－０３－３１
作者简介：岑卫健（１９８２－），女，实验师，主要从事大型仪器的管理
及技术指导研究。
＊广西自然科学基金项目（２０１３ＧＸＮＳＦＡＡ０１９０９７），广西大学科
研基金项目 （ＸＪＺ１３０３６４），广西研究生教育创 新 计 划 项 目
（Ｔ３２４０１）资助。
＊＊通讯作者：姜伯乐（１９７１－），男，研究员，硕士生导师，主要从
事植物病理学方面的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｂｌ１９７１＠ｇｘｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
网络优先数字出版时间：２０１４－３－３０
网络优先数字出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｏｉ／１０．１３６５６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｇｘｋｘ．２０１４０３３０．００２．ｈｔｍｌ
广西科学Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　２０１４，２１（２）：１０３～１０７
基于ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ策略建立十字花科黑腐病菌蛋白质表
达谱的方法研究＊
Ｍｅｔｈｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　Ｐｒｏｆｉｌｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｎ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｂｙ　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
岑卫健１，甘永亮２，于　凯２，付　强１，韦宇拓１，２，姜伯乐１，２＊＊
ＣＥＮ　Ｗｅｉ－ｊｉａｎ１，ＧＡＮ　Ｙｏｎｇ－ｌｉａｎｇ２，ＹＵ　Ｋａｉ　２，ＦＵ　Ｑｉａｎｇ１，ＷＥＩ　Ｙｕ－ｔｕｏ１，２，ＪＩＡＮＧ　Ｂｏ－
ｌｅ１，２
（１．亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁　５３０００５；２．广西大学生命科学
与技术学院，广西南宁　５３０００５）
（１．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ　Ａｇｒｏ－ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，
Ｎａｎｎｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｘｉ，５３０００５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ－
ｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｘｉ，５３０００５，Ｃｈｉｎａ）
摘要：【目的】建立十字花科黑腐病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ，Ｘｃｃ）的蛋白质组学研究平台，用
于分离、鉴定该菌的致病相关蛋白质。【方法】Ｘｃｃ　８００４经过液体培养，分别提取胞内蛋白质和胞外蛋白质，对
所有蛋白质进行液体酶解，通过强阳离子交换色谱预分离多肽混合物，预分离后的馏分采用ＥＡＳＹ－ｎＬＣ结合
ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ质谱鉴定蛋白质表达谱。【结果】建立了基于ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ策略的蛋白质组鉴定方法，采用第一维离
子交换预分离和第二维反相色谱分离结合，实现了高通量鉴定蛋白质组表达谱的技术体系。通过ＳＥＱＵＥＳＴ检
索，在胞内蛋白质样品中共鉴定蛋白质数目为１５９５个，胞外蛋白质样品共鉴定蛋白质数目为１２４１个。【结论】
建立的ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法适合用于十字花科黑腐病菌蛋白质组学的研究，为研究微生物植物相互作用奠定了方
法与理论基础。
关键词：Ｘｃｃ　蛋白质表达谱　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ
中图分类号：Ｑ－３３１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００５－９１６４（２０１４）０２－０１０３－０５
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ａ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ｐｌａｔｆｏｒｍ　ｏｆ　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｐｖ．
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ（Ｘｃｃ）ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｔｈｅ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｘｃｃ　８００４
ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ．Ａｆｔｅｒ　ｉｎ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｈｅ
ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｍｉｘｔｕｒｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｓｔｒｏｎｇ　ｃａｔｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ（ＳＣＸ）ｃｏｌｕｍｎ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｐｒｏ－
ｆｉｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｂｙ　ＥＡＳＹ－ｎＬＣ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】Ｂａｓｅｄ
ｏｎ　ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｃａｔｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ａｎｄ　ｎａｎｏｆｌｏｗ　ｒｅ－
ｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｒｅａｌｉｚｅｄ．Ｔｈｅ
ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ｄａｔａ　ｗｅｒｅ　ｓｅａｒｃｈｅｄ　ｗｉｔｈ
ＳＥＱＵＥＳＴ．Ａｓ　ａ　ｒｅｓｕｌｔ，ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１５９５ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ａ
ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１２４１ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｅｘｔｒａ－
ｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　ｗｏｒｋ－
ｆｌｏｗ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｔｉｌｉｚｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏ－
ｔｅｏｍｉｃｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　Ｘｃｃ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏ－
ｖｉｄｅｓ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉ－
ｃｒｏｂｅ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｘｃｃ，ｐｒｏｔｅｏｍｅ　ｐｒｏｆｉｌｅ，ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ，
ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ
３０１广西科学　２０１４年４月　第２１卷第２期
　　【研究意义】十字花科黑腐病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ，Ｘｃｃ）又称野油菜黄单胞
菌野油菜致病变种，是一种能在全球范围内引起所有
十字花科黑腐病的重要植物病原细菌［１］。弄清植物
病原微生物致病分子机理是有效控制病害的前提。
【前人研究进展】目前，Ｘｃｃ已经完成了全基因组的测
序，这些基因组信息为我们从分子水平全面认识植物
病原微生物的致病机理奠定了基础。Ｘｃｃ注释预测的
与致病性相关的基因大约３００个，鉴定致病蛋白并研
究其功能，对于阐明病原菌的致病机理、寄主范围、分
子进化以及鉴定药物靶标具有极其重要的意义［２］。
【本研究切入点】蛋白质组学不仅研究特定细胞、组
织、体液及亚结构中的蛋白质，而且还研究蛋白质异
构体、翻译后修饰及其相互作用等，其中基因组、转录
组和蛋白质组之间的关联也是蛋白质组学研究的一
项重要内容。虽然常用的２－ＤＥ技术可以有效地结
合胶上提取酶切和质谱技术，实现对几千种蛋白的分
离和分析，但是由于其有限的动态范围及对极端蛋白
的歧视等因素，限制了该方法的进一步发展。因此，
基于多维液相色谱 －串联质谱联用（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）的
ｓｈｏｔ－ｇｕｎ技术［３，４］迅速发展，并广泛应用于蛋白质表
达谱、修饰谱、蛋白复合物及药物检测等的研究
中［５～７］。【拟解决的关键问题】目前鉴定的植物病原
菌致病因子包括胞外多糖（ＥＰＳ）、脂多糖（ＬＰＳ）、胞
外酶、植物毒素、ＩＩＩ型效应物（Ｔ３ＳＥ）等［８］，而很多致
病因子都是低丰度蛋白。因此，建立高通量高分辨率
的Ｘｃｃ蛋白表达谱显得更为重要。本研究拟通过
ＨＰＬＣ阳离子交换柱分离多肽，采用ＥＡＳＹ－ｎＬＣ结
合Ｏｒｂｉｔｒａｐ质谱鉴定Ｘｃｃ各组分的蛋白表达谱，为
下一步鉴定致病相关因子和研究微生物－植物互作提
供方法学基础。
１　材料和方法
１．１　材料
　　菌株：本研究使用菌株为Ｘｃｃ　８００４野生型［１］。
　　仪器：ＬＴＱ　Ｏｒｂｉｔｒａｐ高分辨率质谱仪（美国
Ｔｈｅｒｍｏ公司），液相色谱仪（美国 Ｗａｔｅｒｓ公司），紫
外分光光度计（美国ＰＥ公司），冷冻高速离心机（美
国Ｂｅｃｋｍａｎ公司），台式高速冷冻离心机（德国Ｅｐ－
ｐｅｎｄｏｒｆ公司），超纯水仪（美国 Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司），数控
超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），ＰｏｌｙＬＣ
ＳＣＸ阳离子交换柱，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＥＡＳＹ－ｎＬＣ
１０００纳升级液相色谱，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｏｒｂｉｔｒａｐ　Ｅｌｉｔｅ组合
式质谱，北京六一仪器厂电泳设备。
　　试剂：ＣＨＡＰＳ、ＰＭＳＦ、丙烯酰胺等购自 Ａｍｒｅｓ－
ｃｏ公司，二硫苏糖醇（ＤＴＴ）、碳酸氢铵、氯化钠、三氟
乙酸（ＴＦＡ）、吲哚－３－乙酸（ＩＡＡ）、磷酸二氢钾、胰蛋
白酶均购自美国Ｓｉｇｍａ公司，乙腈购自 Ｔｈｅｒｍｏ公
司，１０ｋＤ超滤管购自 Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司，所有使用水均
使用 Ｍｉｌｉｐｏｒｅ过滤的超纯水。
　　ＮＹＧＢ培养基：蛋白胨５ｇ，酵母提取物３ｇ，甘油
２０ｇ，定容至１Ｌ，调节ｐＨ值为７．０，用于扩大培养。
　　ＸＣＭ２培养基：磷酸氢二钾１０．５ｇ，磷酸二氢钾
４．５ｇ，琥珀酸２．３６ｇ，水解酪蛋白０．１５ｇ，定容至１Ｌ，
调节 ｐＨ 值为６．６～７．０，使用前加入终浓度为
０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁，用于诱导培养。
１．２　方法
１．２．１　菌种培养
　　接一环 Ｘｃｃ　８００４于１０ｍＬ　ＮＹＧＢ培养基中，
２８℃，２００ｒｐｍ摇床培养１６ｈ至ＯＤ６００ ＝０．６左右；按
５％转接量转接于新鲜 ＮＹＧＢ 培养基中，２８℃，
２００ｒｐｍ摇床扩大培养４～６ｈ，至ＯＤ６００ ＝０．４～０．６；
用５０ｍＬ离心管分装后，４０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ离心收集菌
体，用ＮＹＧＢ培养基洗涤菌体２～３次，再用ＸＣＭ２
培养基洗涤菌体１次，适当调节ＯＤ６００；按５％转接量
转接于 ＸＣＭ２培养基中，２８℃，２００ｒｐｍ 摇床培养
１２ｈ。
１．２．２　蛋白样品制备
　　（１）胞内蛋白的制备
　　取培养好的菌液１ｍＬ于离心管中，１２０００ｒｐｍ离
心收集菌体，０．９％ ＮａＣｌ洗涤菌体２次，加入裂解液
冰上裂解３０ｍｉｎ，超声波破碎，１２０００ｒｐｍ，４℃离心取
上清，加入３倍体积预冷的丙酮于－２０℃沉淀过夜，
１２０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ离心沉淀蛋白，将得到的沉淀块晾
干去除残留的丙酮后，用适量的１００ｍｍｏｌ／Ｌ三乙胺－
碳酸缓冲液（ＴＥＡＢ）溶解，ＢＣＡ法测定蛋白浓度后
－２０℃保存备用。
　　（２）胞外蛋白的制备
　　将诱导培养好的菌液转移至５００ｍＬ离心管中，
８０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ离心，收集上清，加入蛋白酶抑制剂
ＰＭＳＦ后，用２２μｍ的细菌过滤器过滤除菌；无细胞
上清通过 Ｍｉｌｉｐｏｒｅ的１０ｋＤ超滤管浓缩至５ｍＬ左
右；浓缩后的蛋白粗体液用４∶１的氯仿／正丁醇抽
提［９］，收集两相之间的沉淀块即为分泌蛋白；将得到
蛋白沉淀块用适量的水化液复溶，再加入３倍体积预
冷的丙酮－２０℃沉淀过夜；１２０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ离心沉
淀蛋白，将得到的沉淀块晾干去除残留的丙酮后，用
适量的１００ｍｍｏｌ／Ｌ的ＴＥＡＢ溶解，ＢＣＡ法测定蛋白
浓度后 －２０℃保存备用。
４０１ Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．２１Ｎｏ．２，Ａｐｒｉｌ　２０１４
１．２．３　蛋白样品酶解
　　变性：取１００μｇ蛋白样品，加入５μＬ　２％ ＳＤＳ，
５μＬ　２００ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸三（２－氯乙基）酯 （ＴＣＥＰ），补
水至 １００μＬ 后，５５℃ 孵 育 １ｈ；烷 化：加 入 ５μＬ
３７５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＡＡ，室温避光孵育３０ｍｉｎ；加入３～６倍
体积的预冷丙酮，－２０℃沉淀３ｈ或过夜；酶解：
８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ离心沉淀蛋白，将得到的沉淀块晾
干去除残留的丙酮，用１００μＬ　１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＴＥＡＢ溶
解沉淀，加入２．５μＬ胰蛋白酶（１μｇ／μＬ），３７℃酶解
过夜。
１．２．４　ＨＰＬＣ阳离子交换分离多肽
　　蛋白样品经液体酶解，真空抽干，复溶于流动相
Ａ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾，２０％ ＡＣＮ），使用ＳＣＸ强
阳离子交换柱作为第一维分离，收取６个分离馏分。
液相 条 件：色 谱 柱：ＳＣＸ 阳 离 子 交 换 柱 （５μｍ，
１００ｍｍ×２．１ｍｍ）；流动相 Ａ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢
钾，２０％乙腈；流动相 Ｂ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ 磷酸二氢钾，
５００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾，２０％乙腈；流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ；梯
度：０～１５ｍｉｎ，０％ Ｂ；１５～５０ｍｉｎ，０～４０％ Ｂ；５０～
５５ｍｉｎ，４０％～１００％ Ｂ；５５～６３ｍｉｎ，１００％ Ｂ；６３～
６５ｍｉｎ，１００％～０％Ｂ；检测波长为２１４ｎｍ。
１．２．５　ＥＡＳＹ－ｎＬＣ结合Ｏｒｂｉｔｒａｐ质谱分析
　　第一维分离得到的６个馏分的肽段，经过脱盐处
理，真空抽干，重溶于流动相Ａ（１０％ ＡＣＮ）采用ＬＣ－
ＭＳ／ＭＳ分析，液相条件：色谱柱：Ｃ１８反相毛细管
柱；流动相：Ａ：２％乙腈＋０．１％甲酸；Ｂ：９８％乙腈＋
０．１％甲酸；流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ；梯度：０～５ｍｉｎ，５％Ｂ；
５～５０ｍｉｎ，５％～３５％Ｂ；５０～５２ｍｉｎ，３５％～１００％Ｂ；
５２～５５ｍｉｎ，１００％Ｂ。
　　质谱条件：电喷雾电压１．５ｋＶ，采用正离子模式
Ｏｒｂｉｔｒａｐ检测一级全谱，扫描分辨率为６００００；质量
扫描范围是 ｍ／ｚ＝３５０～２０００；１０个ＬＴＱ二级质谱
用ＣＩＤ碰撞模式完成，二级扫描分辨率为１５０００；串
联质谱ＣＩＤ碰撞能量是３５％归一化能量，数据依赖
的自动化模式采集信号。将质谱结果在 ＮＣＢＩ下载
的Ｘｃｃ　８００４蛋白数据库中进行检索，数据库检索软
件为ＳＥＱＵＥＳＴ。
２　结果与分析
２．１　蛋白样品的质量检测
　　按照１．２．２所述的蛋白提取方法，分别制备胞内
及胞外蛋白样品，经过ＢＣＡ方法测定蛋白浓度，取
１０μｇ蛋白样品及酶解之后的样品上ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶
（图１）。结果表明，提取的蛋白样品条带清晰，样品
经酶解后，没有残余的蛋白条带，表明酶解充分，符合
下一步的质谱鉴定。
图１　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱
Ｆｉｇ．１　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
　　Ａ１：胞内蛋白；Ｂ１：胞外蛋白；Ｍ：蛋白标品；Ａ２：酶解后的
胞内蛋白；Ｂ２：酶解后的胞外蛋白
　　Ａ１：Ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｂ１：Ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｍ：
Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｒｋｅｒ；Ａ２：Ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｂ２：Ｄｉ－
ｇｅｓｔｅｄ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ．
２．２　质谱条件的优化
　　蛋白样品进行酶解处理后，ＨＰＬＣ阳离子交换柱
分离多肽，经ＥＡＳＹ－ｎＬＣ分离后结合Ｏｒｂｉｔｒａｐ　Ｅｌｉｔｅ
质谱进行分析，通过改变流动相Ａ和流动相Ｂ的比
例优化色谱分离条件，色谱条件优化后的总离子流图
见图２。在色谱条件不变的情况下，将对照品牛血清
白蛋白（ＢＳＡ）的酶解样品分别采用ＣＩＤ和 ＨＣＤ两
种不同的碰撞模式，得到了不同的肽段覆盖率。在
ＣＩＤ 模 式 下，牛 血 清 白 蛋 白 的 覆 盖 率 达 到 了
７６．１１％，而在 ＨＣＤ模式下覆盖率只有５０．０８％，表
明采用ＣＩＤ的碰撞模式得到的肽段覆盖率较高，结
果见表１。
图２　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ离子总流图
Ｆｉｇ．２　Ｔｏｔａｌ　ｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
Ａ：胞内蛋白样品；Ｂ：胞外蛋白样品
Ａ：Ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｂ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
２．３　蛋白的鉴定
　　液体酶解样品采用 ＨＰＬＣ经ＳＣＸ柱进行分离，
收集６个多肽馏分，每个馏分分别进样ＥＡＳＹ－ｎＬＣ
５０１广西科学　２０１４年４月　第２１卷第２期
分离后结合Ｏｒｂｉｔｒａｐ　Ｅｌｉｔｅ质谱分析，将质谱结果与
ＮＣＢＩ下载的Ｘｃｃ　８００４蛋白数据库通过ＳＥＱＵＥＳＴ
检索，在胞内蛋白样品中得到了１５９５个蛋白，胞外蛋
白样品中得到１２４１个蛋白，表２中列出了胞内蛋白
样品部分蛋白的质谱鉴定数据。
表１　不同碰撞模式下的ＢＳＡ肽段覆盖率（％）
Ｔａｂｌｅ　１　ＢＡＳ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｃｏｖｅｒａｇｅ　ｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
碰撞模式
Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ｔｙｐｅ
登录号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒ
名称
Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
分值
Ｓｃｏｒｅ
覆盖率
Ｃｏｖｅｒａｇｅ
（％）
唯一肽段数
Ｕｎｉｑｕｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
总肽段数
Ｔｏｔａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ
ＣＩＤ　 ３０７９４２８０
牛血清白蛋白
Ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ［Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓ］ ２８２４．５１　 ７６．１１　 ２　 ５９
９４９６６８１１ α１－酸性糖蛋白前体ａｌｐｈａ－１－ａｃｉｄ　ｇｌｙｃｏ－ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ［Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓ］ ４１　 ３５．６４　 １　 ８
ＨＣＤ　 ３０７９４２８０
牛血清白蛋白
Ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ［Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓ］ ２５４．１１　 ５０．０８　 １　 ３０
９４９６６８１１ α１－
酸性糖蛋白前体ａｌｐｈａ－１－ａｃｉｄ　ｇｌｙｃｏ－
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ［Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓ］ ２．１３　 ４．４６　 １　 １
表２　部分胞内蛋白质谱结果列表
Ｔａｂｌｅ　２　Ｓｅｖｅｒａｌ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ＭＳ　ｒｅｓｕｌｔｓ
登录号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒ
名称
Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
分值
Ｓｃｏｒｅ
覆盖率
Ｃｏｖｅｒａｇｅ（％）
唯一肽段数
Ｕｎｉｑｕｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ
总肽段数
Ｔｏｔａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ
氨基酸长
ＡＡｓ
分子量
ＭＷ［ｋＤａ］
等电点
Ｃａｌｃ．ｐＩ
６６７６８０４４
热休克蛋白９０
Ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　９０
１２４．８６　 １００．００　 １１　 １２３　 ６３４　 ７０．８　 ５．２７
６６７６９８４４
转录调控因子ＮｒｄＲ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ＮｒｄＲ
２５．９３　 １００．００　 １　 ３７　 １７４　 １９．９　 ７．３７
６６７６７７６９
ＬｙｓＲ家族转录调控因子
ＬｙｓＲ　ｆａｍｉｌｙ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａ－
ｔｏｒ
４．２８　 ９９．６８　 １　 ３７　 ３１０　 ３４．３　 ７．３７
６６７６８５３１
依赖ＡＴＰ的Ｃｌｐ蛋白酶亚基
ＡＴＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｌｐ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｓｕｂ－
ｕｎｉｔ
１５．１７　 ８１．２７　 ４　 ４０　 ３３１　 ３６．６２　 ８．５４
６６７６９３８０ ＨｒｐＸ
蛋白
ＨｒｐＸ　ｐｒｏｔｅｉｎ
１．６９　 ８１．９３　 １　 ５７　 ４７６　 ５２．２　 ８．０９
６６７６９３８１ ＨｒｐＧ
蛋白
ＨｒｐＧ　ｐｒｏｔｅｉｎ
１０．３１　 ７１．７６　 １　 ２９　 ２６２　 ２９．１　 ７．８８
６６７６７１０５
双组分系统感受蛋白
Ｔｗｏ －ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ｓｅｎｓｏｒ
ｐｒｏｔｅｉｎ
７．７６　 ６９．６８　 １　 ５３　 ４９８　 ５４．２　 ７．７５
６６７６７９８３ ＧｕｍＣ
蛋白
ＧｕｍＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ
１１．７２　 ７７．２８　 １　 ６３　 ４４９　 ５０．４　 ６．４４
７７７６１２７３ ＤＮＡ
修复蛋白ＲａｄＡ
ＤＮＡ　ｒｅｐａｉｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＲａｄＡ
２９．９０　 ７８．０２　 ２　 ５０　 ３３０　 ４８．７　 ７．１５
６６７７０１３９ ＮＡＤＨ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　 ４０．４　 ７９．０３　 ４　 ７２　 ７４４　 ７９．０　 ６．６０
６６７６８６４６
应激调控因子ＲｐｆＧ
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ＲｐｆＧ
９．２０　 ７６．９８　 １　 ４１　 ３７８　 ４２．１　 ５．５５
６６７７０４４６
乙酰辅酶Ａ合成酶
Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ
４８．８３　 ７４．１９　 ６　 ７３　 ６４７　 ７１．４　 ５．６９
６０１ Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．２１Ｎｏ．２，Ａｐｒｉｌ　２０１４
３　结论
　 　２００１ 年，Ｍｅｈｔａ 和 Ｒｏｓａｔｏ 首 次 建 立 了
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ　ｐｖ．ｃｉｔｒｉ在寄主体内增殖，
再回收菌体进行２Ｄ－ＰＡＧＥ蛋白组差异鉴定细菌致
病相关蛋白的方法［１０］。Ａｎｄｒａｄｅ等对寄主内生长的
Ｘｃｃ菌株进行回收，并通过２Ｄ－ＰＡＧＥ对其蛋白表达
谱进行分析，建立了Ｘｃｃ与寄主互作的蛋白组研究方
法［１１］。对不同状态下的蛋白质在表达和修饰水平上
进行精确定量，对于探索蛋白质的生物功能、发现疾
病的生物标志物都具有重要意义，也是当前蛋白质组
学的一个重要研究前沿。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ是近年来用于
定量蛋白质组学研究的主要技术。与质谱技术结合
可以研究细胞和组织等在不同的生理状态下蛋白质
水平的差异，可以同时对多个样品进行定量比较，尤
其适用于观察不同生理、病理过程中蛋自质组的动态
变化［１２］。本研究通过 ＨＰＬＣ阳离子交换柱分离多
肽，采用ＥＡＳＹ－ｎＬＣ结合Ｏｒｂｉｔｒａｐ质谱鉴定了一大
批蛋白质，成功建立了适合于鉴定十字花科黑腐病菌
的不同组分内蛋白表达谱的实验技术方法，为深入研
究植物病原细菌的致病分子机理，筛选潜在的细菌药
物靶标奠定基础。
参考文献：
［１］　Ｄａｎｉｅｌｓ　Ｍ　Ｊ，Ｂａｒｂｅｒ　Ｃ　Ｅ，Ｔｕｒｎｅｒ　Ｐ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ
ｇｅｎｅｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｂｒｏａｄ　ｈｏｓｔ　ｒａｎｇ
ｃｏｓｍｉｄ　ｐＬＡＦＲ１［Ｊ］．ＥＭＢＯ　Ｊ，１９８４，３（１３）：３３２３－３３２８．
［２］　Ｎｏｍｕｒａ　Ｋ，Ｈｅ　Ｓ　Ｙ．Ｐｏｗｅｒｆｕｌ　ｓｃｒｅｅｎｓ　ｆｏｒ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｖｉｒｕ－
ｌｅｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００５，１０２：
３５２７－３５２８．
［３］　Ｊｏｈｎ　Ｒ，Ｙａｔｅｓ　ＩＩＩ．Ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｐｒｏｔｅｏｍｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，１９９８，３３（１）：１－１９．
［４］　Ｌｉｎｋ　Ａ　Ｊ，Ｅｎｇ　Ｊ，Ｓｃｈｉｅｌｔｚ　Ｄ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｍａｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｂｉｏ－
ｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９，１７：６７６－６８２．
［５］　Ｓｃｈｉｒｍｅｒ　Ｅ　Ｃ，Ｆｌｏｒｅｎｓ　Ｌ，Ｇｕａｎ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｕｃｌｅａｒ　ｍｅｍ－
ｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｌｉｎｋｓ　ｆｏｕｎｄ　ｂｙ　ｓｕｂ－
ｔｒａｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，３０１（５６３８）：１３８０－
１３８２．
［６］　Ａｎｄｅｒｓｅｎ　Ｊ　Ｓ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　Ｃ　Ｊ，Ｍａｙｏｒ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ　ｂｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ
ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２６（６９６６）：５７０－
５７４．
［７］　潘艳坤，莫建光，韦英亮，等．高效液相色谱———串联质
谱法测定青刀豆中毒死蜱代谢物磷酸二乙酯［Ｊ］．广西
科学，２０１２，１９（４）：３４８－３５１．
Ｐａｎ　Ｙ　Ｋ，Ｍｏ　Ｊ　Ｇ，Ｗｅｉ　Ｙ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｌ－
ｏｒｐｙｒｉｆｏｓ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　ＤＥＰ　ｉｎ　ｇｒｅｅｎ　ｓｔｒｉｎｇ　ｂｅａｎ　ｕｓｉｎｇ
ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ［Ｊ］．Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，１９（４）：３４８－
３５１．
［８］　Ｍａｒｔｉｎ　Ｇ　Ｂ，Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ　Ａ　Ｊ，Ｓｅｓｓａ　Ｇ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｔｈｅ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ
Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ，２００３，５４：２３－６１．
［９］　Ｗａｎｇ　Ｊ　Ｚ，Ｗａｎｇ　Ｆ　Ｚ，Ｓｈａｎｇ　Ｊ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｅｔｈ－
ｏｄ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ａ　ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ
ｆｕｎｇｕｓ，Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ　ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ［Ｊ］．Ｊ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ
Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ，２０１１，４（６）：１２５－１２８．
［１０］　Ｍｅｈｔａ　Ａ，Ｒｏｓａｔｏ　Ｙ　Ｂ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ　ｐｖ．ｃｉｔｒｉ
ｗｉｔｈ　ｌｅａｆ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｏｓｔ　ｐｌａｎｔ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，
２００１，１（９）：１１１１－１１１８．
［１１］　Ａｎｄｒａｄｅ　Ａ　Ｅ，Ｓｉｌｖａ　Ｌ　Ｐ，Ｐｅｒｅｉｒａ　Ｊ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｐｒｏ－
ｔｅｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｐｖ．
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈｏｓｔ　ｐｌａｎｔ
Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ［Ｊ］．ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔ，２００８，２８１
（２）：１６７－１７４．
［１２］　Ｕｎｗｉｎ　Ｒ　Ｄ，Ｐｉｅｒｃｅ　Ａ，Ｗａｔｓｏｎ　Ｒ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｉｖｅ
ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ｉｓｏｂａｒｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔａｇｓ　ｅｎａｂｌｅｓ
ｒａｐｉｄ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ
ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃｅｌ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，
２００５，４（７）：９２４－９３５．
（责任编辑：陆　雁）　　
７０１广西科学　２０１４年４月　第２１卷第２期