全 文 :基因组学与应用生物学,2014年,第 33卷,第 2期,第 386-391页
Genomics and Applied Biology, 2014, Vol.33, No.2, 386-391
研究报告
Research Report
十字花科黑腐病菌分泌蛋白表达谱分析
岑卫健 1 于凯 2 甘永亮 2 黄德伦 3 付强 1 姜伯乐 2*
1亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁, 530004; 2广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530004; 3广西大学动物科学与技术
学院,南宁, 530004
*通讯作者, jbl1971@gxu.edu.cn
摘 要 本文旨在分析 Xcc 8004菌株分泌蛋白的蛋白表达谱,建立 Xcc 8004分泌谱分析方法。首先将诱导
的 Xcc 8004分泌蛋白进行液体酶解,通过 HPLC阳离子交换柱分离多肽,采用 EASY-nLC结合 Orbitrap质
谱鉴定分泌谱。经过过滤筛选后,共精确鉴定蛋白 1 532个,SignalP分析其中包含 286个含信号肽且不含跨
膜区,其中 118个为假定蛋白。对 286个可能的分泌蛋白进行基因本体评注分析,其中,主要为行驶水解酶
类,受体蛋白,信号传导等重要的微生物-植物互作介导蛋白。本研究通过液相色谱-质谱联用能够高效鉴
定 Xcc 8004的分泌蛋白,对这些鉴定的分泌蛋白的信息学分析有利于我们进一步研究 Xcc 8004的致病机
制,为研究微生物植物相互作用鉴定了方法与理论基础。
关键词 Xcc,分泌蛋白, Orbitrap, Gene ontology
Expression Profile Analysis of Secreted Proteins in Xanthomonas campestris
pv. campestris
Cen Weijian 1 Yu Kai 2 Gan Yongliang2 Huang Delun 3 Fu Qiang1 Jiang Bole 2*
1 State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Nanning, 530004; 2 College of Life Science and Technology,
Guangxi University, Nanning, 530004; 3 College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530004
* Corresponding author, jbl1971@gxu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.033.000386
Abstract This study aimed at setting up a research method and analyzing expression profile in allusion to secreted
proteins in Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) 8004. After digesting secreted proteins of Xcc 8004
under introducing, and separating peptides through cation exchange column by HPLC, we identified the protein
sample by Orbitrap Elite combined with EASY-nLC. After screen with filtration, 1 532 proteins were obtained
from different part of Xcc 8004 . SignalP and trans-membrane analysis indicated that 286 proteins with signal
peptide but no trans-membrane, including 118 hypersensitive proteins. Gene Ontology annotation of these 286
proteins showed that most of them take part in an important role in micro-plant interaction such as hydrolase,
receptor, and signal transduction, and so on. We made conclusion that it is possible to identify secreted proteins of
Xcc 8004 efficiently based on LC-MS/MS. The bioinformatic analysis of secreted proteins also made benefit for
our further study on Xcc pathogenesis.
Keywords Xcc, Secreted protein, Orbitrap, Gene ontology
基金项目:本研究由广西大学科研基金资助项目(XJZ130364)和广西研究生教育创新计划资助项目(T32401)共同资助
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.
campestris, Xcc)又称野油菜黄单胞菌野油菜致病变种,
能够引起几乎所有的十字花科植物黑腐病,是研究
微生物-植物相互作用的模式菌株之一。Xcc侵染十
字花科植物过程包括接触、侵入、识别、定殖、发展和
发病六个阶段,每个阶段都存在复杂的分子相互作
用,侵染过程植物涉及到分子识别、信号传导、蛋白
分泌、营养获取、转录调控等早晚期事件,这些作用
过程大都由细胞表面蛋白,分泌蛋白等各种致病相
关因子介导,目前鉴定的植物病原菌致病因子包括
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)、胞外酶、植物毒素、Ⅲ
型效应物(T3SE)等(Martin et al., 2003)。这些致病因
子大多需要通过病原菌的分泌系统的分泌或转运起
作用,其中,很多致病因子都是低丰度蛋白。因此,
建立高通量高分辨率的 Xcc 分泌蛋白表达谱显得
更为重要。
2001年Mehta和 Rosato (2001)首次建立了 Xan-
thomonas axonopodis pv. citri在寄主体内增殖,再回
收菌体进行 2D-PAGE蛋白组差异鉴定细菌致病相
关蛋白的方法。Smolka等(2003)通过 2D-PAGE结合
低浓度 SDS-PAGE 对 Xylella fastidiosa 分泌蛋白进
行了研究,对鉴定的分泌蛋白进行了功能分类,发现
分泌蛋白中存在大量的蛋白酶、毒力蛋白、菌毛蛋白等
与植物免疫相关的功能蛋白。Watt等(2005)在 2005年
通过对 Xcc的分泌蛋白 2D-PAGE分析,鉴定了如
OmpA-related 蛋白、纤维素酶、超氧化物歧化酶(su-
peroxide dismutase, SOD)、内切半乳糖苷酶等涉及微
生物侵染植物过程的关键因子。Andrade等(2008)对
寄主内生长的 Xcc菌株进行回收,并通过 2D-PAGE
对其蛋白表达谱进行分析,建立了 Xcc与寄主互作
的蛋白组研究方法。
虽然常用的 2-DE技术可以有效地结合胶上提
取酶切和质谱技术,实现对几千个蛋白的分离和分
析,但是由于其有限的动态范围及对极端蛋白的歧
视等因素,限制了该方法的进一步发展。因此,基于
多维液相色谱 - 串联质谱联用(LC-MS)的 shot-gun
技术(Yates, 1998; Link et al., 1999)迅速发展,并广泛
应用于蛋白质表达谱、修饰谱及蛋白复合物等的研
究中(Schirmer et al., 2003)。为了进一步分析与鉴定
与 Xcc 8004致病相关的作用因子,我们在之前建立
的分泌蛋白样品制备方法(岑卫健等, 2010)的基础上
建立了高效高分辨率的分泌蛋白分析方法。本研究对
提取的分泌蛋白进行了液体酶解,强离子交换色谱分
离,最后通过 LTQ-Orbitrap进行质谱鉴定,得到了高覆
盖率的分泌蛋白数据,根据蛋白数据分析了 Xcc 8004
分泌蛋白的详细分类,为下一步鉴定致病相关因子和
研究微生物-植物互作提供了方法学基础。
1结果与分析
1.1 Xcc 8004分泌蛋白的提取
按照 3.3所述的蛋白提取方法,制备了富含Xcc8004
分泌组分的蛋白样品,经过 Bradford方法测定蛋白浓
度,根据标准曲线计算得到蛋白浓度为 2.1μg/μL,取
10 μg蛋白样品及酶解之后的样品上 SDS-PAGE胶
并以 BSA为对照。
1.2 分泌蛋白的鉴定
酶解样品采用 HPLC经 SCX柱进行分离,收集
6个多肽馏分,每个馏分进样 EASY-nLC分离后结
合 Orbitrap Elite质谱分析,将质谱结果与 NCBI下
载的 Xcc 8004蛋白数据库经行比对,得到了 1 532个
蛋白,图 1 中展示了 Xcc 8004 中纤维素酶蛋白
XC_0028 (GI Accession number: 66766380)的二级质
谱,其中某一特征肽段为 GFLGEFGTANNAVCN-
DALK,表 1中列出了一些分泌蛋白的质谱鉴定数据。
图 1 Xcc 8004胞外蛋白的 LC-MS/MS质谱鉴定
注: A:总离子流图; B:为 LC-MS/MS鉴定的二级质谱图,肽段
鉴定为 GFLGEFGTANNAVCNDALK, 是胞外纤维素酶
XC_0028的一个特异肽段
Figure 1 LC-MS/MS spectrum identification of secreted proteins
in Xcc 8004
Note: A: Total ion chromatograms; B: A single MS2 spectrum
analyzed by LC-MS/MS, the peptide identified to be GFLGE
FGTANNAVCNDALK, one of the unique peptide of extra-
cellular cellulase XC_0028
387
十字花科黑腐病菌分泌蛋白表达谱分析
Expression Profile Analysis of Secreted Proteins in Xanthomonas campestris pv. campestris
1.3分泌蛋白的筛选
从 NCBI下载的 Xcc 8004蛋白数据库氨基酸序
列,将序列经 SignalP在线分析,筛选得到了总蛋白
中 533个含有信号肽不含跨膜区的理论蛋白。再从
鉴定得到的 1 532个蛋白中筛选包含于这 533个含
信号肽蛋白不含跨膜区的鉴定蛋白,得到 286个推
测的分泌蛋白,鉴定效率将近 54% (图 2)。
1.4 GO分子功能注释
对筛选的 286个分泌蛋白运用 DAVID数据库
进行 GO富集分子功能分析,其中 165个蛋白能够
找到对应的分类号。分析结果表明,Orbitrap鉴定的
Xcc 8004能得到功能注释的分泌蛋白中,主要包括
水解酶类(GO: 0016787)、传输蛋白(GO: 0005215)、信
号传导(GO: 0004871)、分子传导(GO: 0060089)、受体
蛋白(GO: 0004872)以及离子结合蛋白(GO: 0043167)
六个类别(图 3)。
1.5 GO生物进程注释
对筛选的 286个分泌蛋白运用 DAVID数据库
进行 GO富集生物进程分析,其中 177个蛋白能够
找到对应的分类号。分析结果表明,Orbitrap鉴定的
Xcc 8004的能得到生物进程注释的分泌蛋白中,主
要包括参与细胞定位(GO: 0051179)、蛋白水解(GO:
0006508)、蛋白代谢途径(GO: 0019538)以及碳水化
合物代谢(GO: 0005975)四个类别。
1.6 分泌蛋白的结构域组成
为了进一步了解分泌组分中各类蛋白的生物学
功能,我们对分泌蛋白的功能域使用 InterPro以及
图 2 Xcc 8004分泌蛋白分子功能聚类
注:通过基因本体注释对分泌蛋白参与的分子功能聚类;表中
并非所有蛋白得到聚类,如果蛋白参与多种功能类别,在每一
类别都被统计
Figure 2 Classification of Xcc 8004 secreted proteins by molecu-
lar function
Note: Molecular functions were assigned according to the gene
ontology annotations; Not all the proteins was classified into the
chart, if one protein was known to be functioned in more than
one class, all of the function classes were counted
表 1部分分泌蛋白质谱结果列表
Table 1 Several proteins secreted from MS result
登录号
Accession No.
66770592
66769006
66766974
66767581
66766503
66766475
66766749
66769561
77761100
66766977
描述
Description
甲苯耐受蛋白
Toluene tolerance protein
肽酰-脯氨酰-顺反异构酶
Peptidyl-prolylcis-trans isomerase
锌蛋白酶
Zinc protease
水解酶
Hydrolase
木糖苷酶 /阿拉伯糖苷酶
Xylosidase/arabinosidase
果胶酸裂解酶 E
Pectate lyase E
超氧化物歧化酶
Superoxidase dismutase
胞壁质水解酶 D
Murein hydrolase D
海藻糖酶
Trehalase
纤维素酶
Cellulase
分值
Score
257.83
863.47
284.26
15.17
9.81
18.02
19.69
11.76
126.33
397.17
覆盖率(%)
Coverage (%)
99.10
96.98
92.08
81.27
78.14
76.95
71.79
68.56
60.32
58.47
唯一肽段数
Unique Peptides
11
17
26
4
2
1
2
2
10
14
肽段数
Peptides
35
51
125
40
59
55
23
33
34
37
氨基酸长度
AAs
221
232
959
331
526
347
234
388
557
484
分子量
MW (kD)
23.53
24.94
103.2
36.62
58.27
38.38
25.57
41.04
61.56
52.21
等电点
Calc. pI
9.52
9.39
6.76
8.54
8.38
9.28
7.30
8.06
5.99
7.18
388
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 3 Xcc 8004分泌蛋白生物进程聚类
注:通过基因本体注释对分泌蛋白参与的生物进程聚类;表中
并非所有蛋白得到聚类,如果蛋白参与多种功能类别,在每一
类别都被统计
Figure 3 Classification of Xcc 8004 secreted proteins by biologi-
cal process
Note: Biological processes were assigned according to the gene
ontology annotations; Not all the proteins was classified into the
chart, if one protein was known to be classified in more than one
class, all of the process classes were counted
Pfam数据库进行分析,其中,101个蛋白能够得到功
能域的鉴定,其它 185个蛋白未能预测到相应的结
构域。在功能域的分类信息中,很大一部分是具有
TonB依赖的受体蛋白、糖苷水解酶、糖基水解酶、果
胶裂解酶、脂肪酶、肽酶等参与植物细胞壁降解的水
解酶类含量也很丰富,硫氧还折叠、外膜蛋白 OmpW、
外膜脂蛋白等得到很好地聚类,另外,参与信号传
导,表面识别的蛋白受体也有分布(图 4)。
2讨论
本研究在之前建立的分泌蛋白提取方法基础
图 4 Xcc 8004分泌蛋白特征结构域聚类
注:根据 InterPro和 Pfam数据库注释对分泌蛋白结构域聚类;
未得到分类的蛋白没有在图中列出
Figure 4 Classification of Xcc 8004 secreted proteins by feature
domain
Note: Domain classification was assigned according to the anno-
tations based on the InterPro and Pfam database; Unclassified
proteins were not show in the chart
上,利用液相色谱-质谱联用,很好的鉴定了Xcc分
泌蛋白的种类,并通过信息学对鉴定的分泌蛋白进
行了基因本体注释,分析表明在分泌蛋白中,存在着
多类参与微生物植物相互作用的功能蛋白,包括水
解酶类、运输载体、信号及分子传导、受体蛋白和离
子结合蛋白。参与了细胞定位、蛋白水解、蛋白代谢
和碳水化合物代谢等生物过程。
革兰氏阴性菌中的 TBDR(TonB-dependent recep-
tor, TBDR)是一类铁载体复合物,Xcc (ATCC33913)中
预测有 72个 TBDRs (Blanvillain et al., 2007),这些过量
存在于黄单胞菌属中的载体蛋白,对碳水化合物的利
用至关重要。本研究对分泌蛋白的聚类中也发现,
很大一部分参与了碳水化合物代谢,结构域预测的
101 个蛋白中具有 TBDR结构域的蛋白占 33个,提
示在微生物侵染植物过程中,此类蛋白的存在能够帮
助细菌高效地利用植物营养物质。
分子功能分析表明,分泌蛋白中存在很大一部分
蛋白酶类及细胞壁降解酶(cell wall-degrading enzymes,
CWDEs)等降解活性的蛋白,结构域分析显示它们具
有肽酶特征结构域,糖基水解结构域,果胶裂解酶折
叠,脂肪酶结构域等。在植物侵染寄主的过程中,这类
蛋白能够有效地降解植物细胞壁及质膜、植物蛋白获
取营养成分,并有利于病原菌更好地侵染与增殖。
在筛选的蛋白中,发现存在着调节胞外环境免
受植物自由基氧化的超氧化物歧化酶(SOD)及多种
抗氧化活性蛋白,几种通过改变磷酸化蛋白构象从
而调节多种信号通路的肽酰脯氨酰顺反异构酶,参
与细菌粘附以及抗环境压力的菌毛蛋白,以及参与
细菌致病因子分泌的装置外膜蛋白等等。
另外,本研究鉴定的蛋白中,分析存在 6个Ⅲ型分
泌效应物蛋白,但是由于 Xcc中效应物蛋白的分子特
征研究不够深入,加上非 TAL效应物的多变特性,分
泌量低等特点,未能对这类蛋白进行很好的聚类。
本研究很好地对 Xcc 8004分泌蛋白进行了系统
的功能、定位以及结构域分析,为研究重要功能的分
泌蛋白提供了方法与理论指导,深入研究有利于我
们进一步认识微生物植物互作,致病过程,防御反应
等重要的事件。
3材料与方法
3.1仪器及试剂
LTQOrbitrap高分辨率质谱仪(美国 Thermo公司),
液相色谱仪(美国Waters公司),紫外分光光度计(美
389
国 PE公司),冷冻高速离心机(美国 Beckman公司),
台式高速冷冻离心机(德国 Eppendorf公司),超纯水
仪(美国 Millipore公司),数控超声波清洗器(昆山市
超声仪器有限公司),PolyLC SCX 阳离子交换柱,
Thermo Scientific EASY-nLC 1000纳升级液相色谱,
Scientific Orbitrap Elite组合式质谱,北京六一仪器厂
电泳设备,Millipore 10 kD超滤管。
CHAPS、PMSF、丙烯酰胺等购自 Amresco公司,
二硫苏糖醇(DTT)、碳酸氢铵、氯化钠、三氟乙酸(TFA)、
吲哚-3-乙酸(IAA)、磷酸二氢钾、胰蛋白酶均购自
美国 Sigma公司,乙腈购自 Thermo公司,10 kD超
滤管购自 Millipore公司,所有使用水均使用 Milli-
pore过滤的超纯水。
3.2菌株培养
菌株:本研究使用菌株为 Xcc 8004 野生型
(Daniels et al., 1984)。
NYGB培养基:蛋白胨 5 g,酵母提取物 3 g,甘
油 20 g,定容至 1 L,调节 pH=7.0,用于扩大培养。
XCM2培养基:磷酸氢二钾 10.5 g,磷酸二氢钾
4.5 g,琥珀酸 2.36 g,水解酪蛋白 0.15 g,定容至 1 L,
调节 pH=6.6~7.0,使用前加入终浓度为 0.01 mmol/L
硫酸镁,用于诱导培养。
培养条件:接一环Xcc8004于 10mLNYGB培养
基中,28℃,200 r/min摇床培养 16h至OD600=0.6左右;
按 5%转接量转接于NYGB培养基中,28℃,200 r/min摇
床扩大培养 4~6 h,至 OD600=0.4~0.6;用 50 mL离心管
分装后,4 000 r/min,10 min离心收集菌体,用 NYGB
培养基洗涤菌体 2~3次,再用 XCM2培养基洗涤菌体
1次,适当调节 OD600;按 5%转接量转接于 XCM2培
养基中,28℃,200 r/min摇床培养 12 h。
3.3分泌蛋白样品制备
将诱导培养好的菌液转移至 500 mL离心管中,
8 000 r/min,20min离心,收集上清,加入蛋白酶抑制剂
PMSF后,用 22μm的细菌过滤器过滤除菌;无细胞上
清通过Milliproe的 10 kD超滤管浓缩至 5 mL左右;
浓缩后的蛋白粗体液用 4: 1 的氯仿 / 正丁醇抽提
(Wang et al., 2011),收集两相之间的沉淀块即为分泌蛋
白;将得到蛋白沉淀块用适量的水化液复溶,再加入 3倍
体积预冷的丙酮-20℃沉淀 3 h或过夜;12 000 r/min,
10 min离心沉淀蛋白,将得到的沉淀块晾干去除残
留的丙酮后,用适量的 100 mmol/L三乙胺-碳酸缓
冲液(TEAB)溶解,BCA法测定蛋白浓度后-20℃保
存备用。
3.4蛋白样品的预处理
变性:取 100μg蛋白样品,加入 5μL2% SDS,5μL
200 mmol/L 磷酸三 (2- 氯乙基)酯 (TCEP),补水至
100 μL后,55℃孵育 1 h;烷化:加入 5 μL 375 mmol/L
IAA,室温避光孵育 30 min;加入 3~6倍体积的预冷
丙酮,-20℃沉淀 3 h或过夜;酶解:12 000 r/min,10min
离心沉淀蛋白,将得到的沉淀块晾干去除残留的丙
酮,用 100 μL 100 mmol/L TEAB 溶解沉淀,加入
2.5 μL胰蛋白酶(1 μg/μL),37℃酶解过夜。
3.5 HPLC阳离子交换分离多肽
蛋白样品经液体酶解,真空抽干,复溶于流动相
A (10 mmol/L磷酸二氢钾,20% ACN),使用 SCX强
阳离子交换柱作为第一维分离,收取 6个分离馏分。液
相条件:色谱柱:SCX阳离子交换柱(5 μm, 100 mm×
2.1 mm);流动相 A:10 mmol/L磷酸二氢钾,20%乙
腈;流动相 B:10 mmol/L磷酸二氢钾,500 mmol/L氯
化钾,20%乙腈;流速:0.3 mL/min;梯度:0~15 min,
0% B;15~50 min,0%~40% B;50~55 min,40%~100%
B;55~63 min,100% B;63~65 min,100%~0% B;检测
波长为 214 nm。
3.6 EASY-nLC结合 Orbitrap质谱分析
第一维分离得到的 6个馏分的肽段,经过脱盐
处理,真空抽干,重溶于流动相 A (10% ACN)采用
LC-MS/MS分析,液相条件:色谱柱:C18 反相毛细
管柱;流动相:A:2%乙腈+0.1%甲酸;B:98%乙腈+
0.1%甲酸;流速:300 nL/min;梯度:0~5 min,5% B;
5~50 min,5% ~35% B;50~52 min,35% ~100% B;
52~55 min,100% B。
质谱条件:电喷雾电压 1.5 kV,采用正离子模式
Orbitrap检测一级全谱,扫描分辨率为 60 000;质量
扫描范围是 m/z=350~2 000;10个 LTQ二级质谱用
CID碰撞模式完成,二级扫描分辨率为 15 000;串联
质谱 CID碰撞能量是 35%归一化能量,数据依赖的
自动化模式采集信号。
3.7质谱结果分析
3.7.1质谱数据搜索
所有的串联质谱数据通过搜索引擎 SEQUEST
(Protein Discovery软件)进行搜索,使用 Uniprot数据
库、IPI数据库和 NCBI下载的黄单胞菌数据库,为减
少假阳性结果出现,用以上数据库的反库验证。数据
十字花科黑腐病菌分泌蛋白表达谱分析
Expression Profile Analysis of Secreted Proteins in Xanthomonas campestris pv. campestris 390
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
库搜索参数设置如下:Trypsin酶切或部分 Arg-C酶
切;最大 4个漏切位点;一级质谱质量范围 0.1 Da;
二级质谱质量偏差 0.3 Da,可变修饰为:甲基化(+
57.021 Da)、甲硫氨酸氧化(+15.995 Da)、人工确认匹
配二级图谱减少错配率。
3.7.2分泌蛋白的筛选
由于菌体诱导培养时的菌体裂解以及提取过程
中的渗透,提取的分泌蛋白中存在着大量的非目标
蛋白,将 Xcc 8004菌株的基因组氨基酸序列导入
SignalP进行信号肽预测,筛选含信号肽不含跨膜区
的蛋白视为富含分泌蛋白成分,再从中筛选鉴定得
到的分泌组分。
3.7.3分泌蛋白 GO分类
使用 DAVID软件在线提交分泌组分的 ID号,
分别对鉴定的分泌组分进行分子功能 (molecular
function),生物进程(biological process)以及结构域聚
类分析(InterPro数据库和 PFAM数据库)。
作者贡献
姜伯乐是项目的构思者及负责人;岑卫健、于凯
和甘永亮完成实验设计、实验研究、数据分析和论文
初稿写作;付强、黄德伦参与数据分析及论文修改。
全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究是依托亚热带农业生物资源保护与利用
国家重点实验室的大型仪器共享平台完成的,特别
感谢重点实验室技术支撑组的工作人员对本实验的
大力支持。
参考文献
Andrade A.E., Silva L.P., Pereira J.L., Noronha E.F., Reis F.B.
Jr., Bloch C. Jr., dos Santos M.F., Domont G.B., Franco O.
L., and Mehta A., 2008, In vivo proteome analysis of
Xanthomonas campestris pv. campestris in the interaction
with the host plant Brassica oleracea, FEMS Microbiol. Let.,
281(2): 167-174
Blanvillain S., Meyer D., Boulanger A., Lautier M., Guynet C.,
Denance N., Vasse J., Lauber E., and Arlat M., 2007, Plant
carbohydrate scavenging through TonB-dependent recep-
tors: A feature shared by phytopathogenic and aquatic bacte-
ria, PLoS One, 2(2): e224
ChenW.J., Jiang B.L., Yang C., Wang J.Z., Yang L.C., He Y.Q., and
Tang J.L., 2010, Establishment of a method for preparation of
the secretome samples from Xanthomonas campestris pv.
campestris for two dimensional electrophoresis, Jiyinzuxue
Yu Yingyong Shengwuxue (Genomic and Apply Biology),
29(3): 588-592 (岑卫健,姜伯乐,杨超,王金子,杨丽超,何
勇强,唐纪良, 2010,野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样
品制备方法的建立 , 基因组学与应用生物学 , 29 (3):
588-592)
Daniels M.J., Barber C.E., Turner P.C., Cleary W.G., and
Sawczyc M.K., 1984, Isolation of mutants of Xanthomonas
campestris pathovar campestris showing altered pathogenicity,
J. Gen. Microbiol., 130(9): 2447-2455
Link A.J., Eng J., Schieltz D.M., Carmack E., Mize G.J., Morris
D.R., Garvik B.M., and Yates J.R., 1999, Direct analysis of
protein complexes using mass spectrometry, Nat. Biotechnol.,
17(7): 676-682
Martin G.B., Bogdanove A.J., and Sessa G., 2003, Understanding
the functions of plant disease resistance proteins, Annu.
Rev. Plant Biol., 54: 23-61
Mehta A., and Rosato Y.B., 2001, Differentially expressedpro-
teins in the interaction of Xanthomonas axonopodis pv. citri
with leaf extract of the host plant, Proteomics, 1(9): 1111-1118
Schirmer E.C., Florens L., Guan T., Yates J.R. 3rd., and Gerace
L., 2003, Nuclear membrane proteins with potential disease
links found by subtractive proteomics, Science, 301(5638):
1380-1382
Smolka M.B., Martins D., Winck F.V., Santoro C.E., Castellari
R.R., Ferrari F., Brum I.J., Galembeck E., Filho D.C.,
Machado M.A., Marangoni S., and Novello J.C., 2003,
Proteome analysis of the plant pathogen Xylella fastidiosa
revealsmajor cellular and extracellular proteins and a peculiar
codon bias distribution, Proteomics, 3(2): 224-237
Watt S.A., Wilke A., Patschkowski T., and Niehaus K., 2005,
Comprehensive analysis of the extracellular proteins from
Xanthomonas campestris pv. campestris B100, Proteomics, 5
(1): 153-167
Wang J.Z., Wang F.Z., Shang J.J., and Chen B., 2011, An
efficient method for extraction of secreted proteins of a
filamentous fungus, Cryphonectria parasitica, J. Proteomics
Bioinform., 4(6): 125-128
Yates J.R., 3rd., 1998, Mass spectrometry and the age of the pro-
teome, J. Mass Spectrom., 33(1): 1-19
391