全 文 ：广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ　Ｓｅｐｔ．２０１３，３３ （５）：６６３－６６８　　　　　　 ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌ．ｇｘｚｗ．ｇｘｉｂ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１３．０５．０１４
韩立敏，化文平，王喆之．菘蓝铁型超氧化物歧化酶基因ＩｉＦｅＳＯＤ 的克隆与胁迫表达 ［Ｊ］．广西植物，２０１３，３３ （５）：６６３－６６８
Ｈａｎ　ＬＭ，Ｈｕａ　ＷＰ，Ｗａｎｇ　ＺＺ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｏｎｅ　ａｎｄ　ｓｔｒｅｓｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｉｒｏｎ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ　ｆｒｏｍＩｓａｔｉｓ　ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ ［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ，２０１３，３３
（５）：６６３－６６８
菘蓝铁型超氧化物歧化酶基因
ＩｉＦｅＳＯＤ 的克隆与胁迫表达分析
韩立敏１，２，化文平１，２，王喆之１＊
（１．陕西师范大学 生命科学学院，药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，西北濒危药材资源
开发国家工程实验室，西安７１００６２；２．陕西学前师范学院，西安７１００６２）
摘　要：超氧化物歧化酶 （ＳＯＤ）是生物体内超氧阴离子自由基的清除剂，可有效地防止它们对生物体的
损害。从菘蓝中经ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到ＳＯＤ基因，命名为ＩｉＦｅＳＯＤ，其全长８８２ｂｐ，包含一个８３４ｂｐ
的ＯＲＦ，编码２７７个氨基酸，分析其编码的蛋白质序列显示其属于铁型超氧化物歧化酶，具有线粒体导
肽，定位于线粒体中。实时荧光定量ＰＣＲ技术分析结果表明，ＩｉＦｅＳＯＤ 在菘蓝各个组织中均有表达，但表
达量高低不同，在叶中表达最高、茎次之、根中最低；该基因受盐胁迫的诱导，随着盐胁迫强度的加强基
因表达量迅速升高而后下降。同时ＳＯＤ酶活性在盐胁迫处理下表现出类似的变化规律。说明ＳＯＤ的大量
积累与植物的耐逆性密切相关。
关键词：菘蓝；ＳＯＤ；盐胁迫；表达分析；酶活性分析
中图分类号：Ｑ９４５　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１０００－３１４２（２０１３）０５－０６６３－０６
Ｃｌｏｎｅ　ａｎｄ　ｓｔｒｅｓｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｉｒｏｎ
ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ　ｆｒｏｍＩｓａｔｉｓ　ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ
ＨＡＮ　Ｌｉ－Ｍｉｎ１，２，ＨＵＡ　Ｗｅｎ－Ｐｉｎｇ１，２，ＷＡＮＧ　Ｚｈｅ－Ｚｈｉ　１＊
（１．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａ，
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｏｆ　Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｒｕｄｅ　Ｄｒｕｇｓ　ｉｎ
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａａｎｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１００６２，
Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｈａａｎｘｉ　Ｘｕｅｑｉａｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１００６２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ　ｉｓ　ａ　ｓｃａｖｅｎｇｅｒ　ｏｆ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ａｎｉｏｎ　ｆｒｅｅ　ｒａｄｉｃａｌ　ｉｎ　ｖｉｖｏ．Ｔｈｅｙ　ｃａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｐｒｅｖｅｎｔ
ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｄａｍａｇｅ　ｔｏ　ｏｒｇａｎｉｓｍ．Ａｎ　ｉｒｏｎ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍＩｓａｔｉｓ　ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ，
ａｎｄ　ｗａｓ　ｎａｍｅｄ　ａｓ　ＩｉＦｅＳＯＤ．Ｔｈｅ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ＩｉＦｅＳＯＤｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ａ　８３４ｂｐ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ａｎｄ
ｅｎｃｏｄｅｄ　２７７ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ，ｗｈｉｃｈ　ｍｉｇｈｔ　ｌｏｃａｔｅ　ｉｎ　ｍｉｔｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＩｉＦｅＳＯＤｈａｄ　ｔｈｅ
ｈｉｇｈｅｓｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｌｅａｖｅｓ，ｔｈｅｎ　ｉｎ　ｓｔｅｍｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｅａｓｔ　ｉｎ　ｒｏｏｔｓ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＩｉＦｅＳＯＤｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＮａＣｌ．Ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＩｉＦｅＳＯＤｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ａｔ　ｔｈｒｅｅ　ｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓ－
ｓｉｏｎ　ｏｆ　ＩｉＦｅＳＯＤｆｉｒｓｔ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｔ　１００ｍｍｏｌ／Ｌ．Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＳＯＤ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＮａＣｌ　ａｎｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ａｎａｌｏｇｏｕｓ　ｃｈａｎｇｅ　ｒｕｌｅ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｍａｓｓｉｖｅ　ａｃｃｕｍｕｌａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＯＤ　ｗａｓ　ｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ．
收稿日期：２０１３－０２－２８　　修回日期：２０１３－０５－１７
基金项目：国家自然科学基金 （３１２００２２１）；陕西学前师范学院自然科基金 （２０１２ＫＪ０２０）
作者简介：韩立敏 （１９８１－），女，河北邯郸人，在读博士，讲师，主要从事植物生物技术方面的研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｈｄｄ＿１９８１＿＠１６３．ｃｏｍ。
＊通讯作者：王喆之，博士，教授，主要从事植物分子生物学、天然产物研究与开发利用研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｚｚｗａｎｇ＠ｓｎｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｉｓａｔｉｓ　ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ；ｉｒｏｎ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ；ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ
　　菘蓝 （Ｉｓａｔｉｓ　ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ）常用的十字花科药
用植物，在我国南北各地广为栽培，其根和叶均可
入药，干燥根入药称板蓝根，干燥叶入药称为大青
叶。具有清热、解毒、凉血、利咽等功效，被广泛
应用于流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性乙型肝
炎症等症的治疗。菘蓝对环境的适应能力很强，这
与其对各种逆境胁迫的耐受能力密切相关。
植物在生长的过程中，会受到如干旱、盐碱、
冷害等各种环境的胁迫，这些逆境将导致植物体内
产生 大 量 的 活 性 氧 （ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ，
ＲＯＳ），ＲＯＳ通过破坏核酸，氧化蛋白来影响细胞
的功能，从而影响植物的正常生长 （窦俊辉等，
２０１０）。超氧化物歧化酶 （ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，
ＳＯＤ）是体内氧自由基清除反应系统中的关键酶
类，催化超氧负离子转变为 Ｏ２ 和 Ｈ２Ｏ２，植物细
胞主要含有３种类型的ＳＯＤ：ＣｕＺｎＳＯＤ，ＭｎＳＯＤ
和ＦｅＳＯＤ （Ｍａｌｉｋ　ｅｔ　ａｌ．，２０１１）。
ＦｅＳＯＤ是抗氧化代谢途径中关键酶之一，在
植物抗逆反应中起着重要作用，ＦｅＳＯＤ转基因的
烟草或紫花苜蓿植株都较对照植株表现出更强的抗
逆 性 （Ｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６； Ｍｃｋｅｒｓｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，
２０００）。ＦｅＳＯＤ基因现已从马铃薯 （武新娟等，
２００９）、烟草 （Ｋｕｒｅｐａｅｔ　ａｌ．，１９９７）、水稻 （Ｋａ－
ｍｉｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）和 萝 卜 （Ｓｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，
２００６）等植物中克隆得到。对菘蓝 ＦｅＳＯＤ 基因
（ＩｉＦｅＳＯＤ）的克隆和胁迫表达分析研究有助于从
分子水平揭示菘蓝对环境的适应机理，以及抗氧化
抗逆的生理机制，并为利用基因工程技术改良菘蓝
提供理论依据和基因资源。
１　材料与方法
１．１材料
将购自于济南绿禾种业有限公司的菘蓝种子播
种于花盆中，定期浇水，温室中进行培养。当幼苗
长至２～３ｃｍ时移栽至新的花盆中，每个花盆６棵
幼苗。待生长至２个月时，进行 ＮａＣｌ胁迫处理，
每１８株菘蓝为一组样品，分别以０、５０、１００、
２００ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ溶液进行处理７２ｈ，取样后，
迅速液氮速冻并于－８０℃保存。
大肠杆菌 ＤＨ５α为本实验室保存，ｐＭＤ１８－Ｔ
载体购自ＴＡＫＡＲＡ。
１．２菘蓝超氧化物歧化酶基因的基因克隆
分离提取菘蓝样品总 ＲＮＡ ［提取方法参照
ＢＩＯＺＯＬ总 ＲＮＡ 提取试剂盒 （Ｃａｔ＃ ＢＳＣ５１Ｓ１）
说明书］，反转录成ｃＤＮＡ （参考购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
公司的ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ试
剂盒说明书），ＰＣＲ扩增，依据实验室已构建的菘
蓝 ｃＤＮＡ 文 库 中 ＥＳＴ 拼 接 序 列， 用
ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ　５．０设计引物，ＩｉＦｅＳＯＤ－Ｓ （５′－
ＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＡＣＡＧＧＧＣＣ－３′） 和 ＩｉＦｅＳＯＤ－Ｒ
（５′－ＡＧＧＧＣＴＣＡＡＧＡＴＧＣＴＡＡＴ－３′）由上海生工
合成。采用２０μＬ的ＰＣＲ反应体系，其中：３μＬ
ｃＤＮＡ；１μＬ　Ｐｒｉｍｅｒ３′（１０μｍｏｌ／Ｌ）；１μＬ　Ｐｒｉｍ－
ｅｒ５′ （１０μｍｏｌ／Ｌ）；１０μＬ　２×Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ，加
ｄｄＨ２Ｏ补至２０μＬ。ＰＣＲ扩增条件为９４℃１０ｍｉｎ；
（９４℃３０ｓ；４８℃４０ｓ；７２℃７０ｓ）×３０个循环；
７２℃１０ｍｉｎ；４℃保温。１１０Ｖ电泳检测，回收目
的片段 （参照购自于安徽优晶生物工程有限公司的
Ｕ－ｇｅｎｅ　Ｈ．Ｑ．Ｑ．Ｑ．凝胶回收试剂盒ＩＩ说明书），
连接至ｐＭＤ１８－Ｔ载体，转入大肠杆菌ＤＨ５α中，筛
选阳性菌落，菌落ＰＣＲ检测，测序。
１．３生物信息学分析
用ＤＮＡＳｔａｒ软件和ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．
ｄｋ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｈｔ－
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／、ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｅｘｐａｓｙ．
ｏｒｇ／等网站提供的各类生物信息学软件进行分析。
查找开放读码框 （ＯＲＦ）、翻译核苷酸序列、分析
氨基酸序列的组成与理化性质分析利用 ＤＮＡＳｔａｒ
软件；用Ｂｌａｓｔ工具完成核苷酸和氨基酸序列的同
源性比对分析；蛋白跨膜结构域和亚细胞定位的分
析用在线工具 ＴＭＨＭＭ、ＴａｒｇｅｔＰ　１．１Ｓｅｒｖｅｒ；
用Ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ服务器进行蛋白质的三维结构
预测。
１．４菘蓝超氧化物歧化酶基因的定量分析
分别提取自然生长状态下的幼苗的根、茎、叶
总ＲＮＡ，逆转录获得ｃＤＮＡ，用于ＩｉＦｅＳＯＤ 不同
组织表达分析。提取同胁迫处理条件下的菘蓝全株
总ＲＮＡ逆转录得ｃＤＮＡ，以未处理的做对照，用
于菘蓝超氧化物歧化酶基因 （ＩｉＦｅＳＯＤ）在盐胁
迫条件下表达情况的分析。采用荧光实时定量
ＰＣＲ技术对转录产物进行扩增，以菘蓝肌动蛋白
基因 （Ｉｉａｃｔｉｎ）作为内参。
定量分析时扩增ＩｉＦｅＳＯＤ 片段的上游引物：５′－
４６６ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
ＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣＧＧＧ－３′，下游引物：
５′－ＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＡＴＴＴＧＣＴＴＧＴＴＣＡＧ －３′；扩增内
参Ｉｉａｃｔｉｎ的上游引物：５′－ＡＴＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＴＣＴＧ－
ＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴ－３′，下游引物：５′－ＣＧＧＣＴＧＴＧＧＴ－
ＧＧＴＧＡＡＴＧＡＧＴＡＡ－３′。反应体系为２０μＬ，反应条
件为９４℃４ｍｉｎ，（９４℃３０ｓ；６０℃３０ｓ；７２℃４０
ｓ）×４０个循环。
１．５菘蓝超氧化物歧化酶的提取及其酶活性测定
称取新鲜材料１ｇ，于研钵中研磨，使组织破
碎，加入３倍体积的０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ为７．８的
磷酸缓冲溶液，５　０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，弃沉淀，
得提取液。提取液加入０．２５倍体积的氯仿－乙醇
混合溶剂搅拌１５ｍｉｎ，５　０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，
去杂蛋白，得粗酶液。粗酶液加入等体积的冷丙
酮，搅拌１５ｍｉｎ，５　０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。得沉
淀ＳＯＤ。将沉淀溶于１ｍＬ　０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ 为
７．８的磷酸缓冲溶液中，于５５℃热处理１５ｍｉｎ，
离心，弃沉淀，得到ＳＯＤ酶液。测定酶活 （按照
南京建成生物ＳＯＤ检测试剂盒说明书操作）。
２　研究结果
２．１　ＩｉＦｅＳＯＤ 的克隆及其序列特征分析
利用反转录的ｃＤＮＡ 作为模板进行 ＰＣＲ扩
增，得到一条长度为８８２个核苷酸的扩增产物 （图
１），核苷酸序列及其推导的氨基酸序列如图２所
示，ＯＲＦ包含８３４个核苷酸编码２７７个氨基酸，
氨基酸组成中含量最多的是 Ｇｌｕ（９．７％）、Ｌｅｕ
（９．４％），分子量为３１　６４７．３，理论等电点为４．
７６，菘蓝ＦｅＳＯＤ稳定性相对较高。通过同源性比
对分析，其氨基酸序列与拟南芥、番茄、小盐芥等
的ＦｅＳＯＤ蛋白相似度达９５％以上，存在保守区域
ＨＷＧＫＨＨ、 ＦＮＮＡ、 ＷＮＨＥＦＦ、 ＦＧＳＧＷ、
ＷＥＨＡＹＹ。用 Ｂｌａｓｔ－ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎｓ　Ｓｅａｒｃｈ
（Ｍａｒｃｈｌｅｒ－Ｂａｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，２０１３）分析菘蓝ＳＯＤ氨
基酸序列功能结构域的结果 （图３）表明：菘蓝超
氧化物歧化酶 （ＩｉＳＯＤ）包含ＦｅＳＯＤ结构域，属
于Ｆｅ超氧化物歧化酶蛋白家族。利用ＴａｒｇｅｔＰ　１．
１Ｓｅｒｖｅｒ在线工具分析菘蓝ＳＯＤ的亚细胞定位，
推测菘蓝ＩｉＦｅＳＯＤ 可能定位于线粒体中 （分值为
０．８，可靠等级为２），跨膜结构预测菘蓝铁型
ＳＯＤ （ＩｉＦｅＳＯＤ）没有跨膜区域。利用 ＭｉｔｏＰｒｏｔ
ＩＩ－ｖ１．１０１在线工具 （ｈｔｔｐ：／／ｉｈｇ．ｇｓｆ．ｄｅ／ｉｈｇ／
ｍｉｔｏｐｒｏｔ．ｈｔｍｌ）预测 Ｎ 端的 １９ 个氨基酸即
ＭＱＷＫＲＮＶＫＲＲＦＳＲＫＶＡＶＳ是线粒体导肽，引
导肽链进入线粒体中 （Ｍａｎｕｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。
图１　ＩｉＦｅＳＯＤ 全长ｃＤＮＡ序列扩增
Ｆｉｇ．１　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ＩｉＦｅＳＯＤ
ｗｈｏｌｅ　ｃＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
　　 用 Ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ进行同源建模预测，构建
ＩｉＦｅＳＯＤ蛋白的高级结构模型 （图４），结果表明
ＩｉＦｅＳＯＤ蛋白质主要包含α螺旋和β折叠片，另外
还有无规则卷曲及转角结构。
２．２　ＩｉＦｅＳＯＤ 基因的器官表达分析与诱导表达分析
ＩｉＦｅＳＯＤ 在菘蓝的根、茎、叶中均有表达，但
表达量有差异，叶片中表达量最高，茎次之，根中
最低 （图５），仅有少量表达，这与银杏铁型ＳＯＤ
（ＧｂＦｅＳＯＤ）在不同组织中的表达情况相似 （李琳
玲等，２００９）；用 不 同 浓 度 （０、５０、１００、２００
ｍｍｏｌ／Ｌ）的ＮａＣｌ处理菘蓝，定量分析结果 （图６）
表明，ＩｉＦｅＳＯＤ 的表达受 ＮａＣｌ诱导，ＩｉＦｅＳＯＤ 随
着ＮａＣｌ浓度的提高在整个植株体内的表达量先升高
后下降，浓度为５０ｍｍｏｌ／Ｌ时，表达量最高，是对
照的３．５倍，ＮａＣｌ溶液浓度为１００ｍｍｏｌ／Ｌ时，基
因表达量稍有下降，ＮａＣｌ溶液浓度为２００ｍｍｏｌ／Ｌ
时，基因表达量下降显著但仍比对照菘蓝植株体内
的表达量要高２倍。
２．３盐胁迫处理下菘蓝体内超氧化物歧化酶活性
的变化
ＳＯＤ活性测定结果表明，盐胁迫条件下菘蓝超
氧化物歧化酶活性大大提高，是对照的３～５倍，且
随着盐浓度的提高，菘蓝体内ＳＯＤ活性增强，而后
具下降趋势，但仍比对照高 （图７），研究结果表明
菘蓝铁型超氧化物歧化酶是诱导酶 （Ｓｔｅｐｉｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，
２００５）。在盐胁迫条件下，植物机体内会产生大量的
活性氧和自由基，植物通过调整体内基因的表达提
高ＳＯＤ酶活性，有利于活性氧的清除，保护菘蓝免
５６６５期　　　　　　韩立敏等：菘蓝铁型超氧化物歧化酶基因ＩｉＦｅＳＯＤ 的克隆与胁迫表达
图２　ＩｉＦｅＳＯＤ 核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Ｆｉｇ．２　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＩｉＦｅＳＯＤ
图３　菘蓝ＦｅＳＯＤ氨基酸序列功能结构域分析
Ｆｉｇ．３　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＩｉＦｅＳＯＤ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｆｒｏｍＩｓａｔｉｓ　ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ
受氧化损伤，增强菘蓝对不良环境的抵抗能力。
３　结论与讨论
植物ＦｅＳＯＤ多为环境诱导表达型，表达量高
低受到光、激素、温度等环境因子的影响 （Ａａｒｏｎ
ｅｔ　ａｌ．，２０１２），本研究获得了一条菘蓝铁型超氧化
物歧化酶基因的全长，编码２７７个氨基酸。该基因
是环境诱导表达型，受盐胁迫诱导，盐胁迫引起了
ＩｉＦｅＳＯＤ 表达量的迅速升高，菘蓝体内积累了大
量的铁型ＳＯＤ来清除盐胁迫条件下所产生的活性
氧，从而减少氧化胁迫伤害，提高菘蓝对环境的适
应能力 （Ｍｍａｌｉｋ　ｅｔ　ａｌ．，２０１１）。
不同植物ＦｅＳＯＤ蛋白的亚细胞定位不同，且
编码基因的组织表达特性有差异。Ｋｗｏｎ　ｅｔ　ａｌ．
（２００３）研究萝卜ＳＯＤ的表达发现，ＦｅＳＯＤ 在萝
卜肉质根中基本不表达。但是 Ｋａｍｉｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．
（１９９９）研究发现，在水稻中ＦｅＳＯＤ 在所有组织
都有大量表达。该研究中，ＩｉＦｅＳＯＤ 在菘蓝的根、
茎、叶中均有表达，叶中表达量最高，根中表达量
最低。ＧｂＦｅＳＯＤ 可能主要定位于叶绿体中，所以
６６６ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
图４　菘蓝ＦｅＳＯＤ蛋白的Ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ同源建模分析
Ｆｉｇ．４　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＩｉＦｅＳＯＤ
ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ
图５　菘蓝ＩｉＦｅＳＯＤ 的组织表达分析
Ｆｉｇ．５　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＩｉＦｅＳＯＤｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ
在银杏含有叶绿体等器官组织中会有较高表达量
（李琳玲，等２００９），ＩｉＦｅＳＯＤ 虽然在叶中表达量最
高，但通过生物信息软件预测其却定位在线粒体中，
并具备线粒体导肽，不具跨膜结构，说明其可能定位
于线粒体基质中发挥作用，对其是否定位于线粒体，
在线粒体中发挥活性氧清除作用还有待进一步研究。
正常情况下，植物体内产生的活性氧处于较低
水平，不会对植物产生伤害。而在胁迫状态下，活
性氧代谢平衡被打破，ＲＯＳ增多，会使蛋白质、
叶绿体等发生降解，活性氧中的羟自由基能直接启
动膜脂过氧化的自由基链式反应。盐胁迫下植物体
内ＲＯＳ的积累是导致盐害的主要原因之一，植物
图６　菘蓝ＩｉＦｅＳＯＤ 在盐胁迫条件下的表达分析
Ｆｉｇ．６　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＩｉＦｅＳＯＤ
ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
图７　盐胁迫处理条件下的菘蓝体内ＳＯＤ酶活性
Ｆｉｇ．７　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＳＯＤ　ｆｒｏｍＩｓａｔｉｓ　ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ
ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ
对胁迫的响应之一就是保护酶活性的变化 （Ａｌｓｃｈｅ
ｅｔ　ａｌ．，２００２）。本研究也表明，ＮａＣｌ可引起菘蓝
中ＳＯＤ活性的提高，但不同浓度的 ＮａＣｌ溶液对
菘蓝ＳＯＤ活性有着不同的影响。在轻度盐胁迫下，
ＩｉＦｅＳＯＤ 基因表达量升高，ＳＯＤ活性上升，这可
能是菘蓝在抗盐机理方面对盐胁迫的一种适应性表
现，但在高浓度胁迫下，超过了其自身的忍耐程
度，导致ＳＯＤ活性下降，不能有效地清除氧，从
而启动膜脂质过氧化作用，可能是盐胁迫对菘蓝造
成伤害的重要原因之一。
参考文献：
Ａａｒｏｎ　ＣＡ，Ｍｉｒｉａｍ　ＧＭ，Ｌａｕｒａ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．２０１２．Ｔｗｏ　Ｆｅ－ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ
ｄｉｓｍｕｔａｓｅ　ｆａｍｉｌｉｅｓ　ｒｅｓｐｏｎｄ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｌｙ　ｔｏ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ
ｌｅｇｕｍｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，１６９（１３）：１　２５３－１　２６０
Ａｌｓｃｈｅ　Ｒ　Ｇ，Ｅｒｔｕｒｋ　Ｎ，Ｈｅａｔｈ　ＬＳ．２００２．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓ－
ｍｕｔａｓｅｓ（ＳＯＤｓ）ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌｉｎｇ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ
７６６５期　　　　　　韩立敏等：菘蓝铁型超氧化物歧化酶基因ＩｉＦｅＳＯＤ 的克隆与胁迫表达
Ｅｘｐ　Ｂｏｔ，５３ （３７２）：１　３３１－１　３４１
Ｄｏｕ　ＪＨ （窦俊辉），Ｙｕ　ＳＸ （喻树迅），Ｆａｎ　ＳＬ （范术丽），ｅｔ　ａｌ．
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（上接第７１６页Ｃｏｎｔｉｎｕｅ　ｆｒｏｍ　ｐａｇｅ　７１６）
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Ｙｕ　ＤＳ，Ｚｈａｎｇ　ＺＱ，Ｙａｎｇ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．２０１１．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｏｉｌ　ｓａｍｐｌｉｎｇ
ｄｅｎｓｉｔｙ　ｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｓｐａｔｉａｌ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｓｏｉｌ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｃａｒｂｏｎ　ｉｎ　ａ
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ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｏｆ　ｓｏｉｌ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｃａｒｂｏｎ　ｉｎ　ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｑｉｎｇｈａｉ－Ｔｉ－
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ｇｒａｓｓｌａｎｄ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ （草地生态系统碳蓄积的研究进展）［Ｊ］．
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ｓｔａｂｌｅ－ｉｓｏｔｏｐｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃ－
ｔｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ－ｗｉｄｅ　ｐａｌｅｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｓｅｄ　Ｒｅｓ，８０：１３７
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碳的主导影响因子及其研究进展）［Ｊ］．Ａｄｖ　Ｅａｒｔｈ　Ｓｃｉ （地
球科学进展），２０：９９－１０５
Ｚｈｕａｎｇ　Ｑ，Ｈｅ　Ｊ，Ｌｕ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．２０１０．Ｃａｒｂｏｎ　ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｏｆ　ｔｅｒｒｅｓ－
ｔｒｉａｌ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｔｉｂｅｔａｎ　Ｐｌａｔｅａｕ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　２０ｔｈ　ｃｅｎｔｕｒｙ：
ａｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｐｒｏｃｅｓｓ－ｂａｓｅｄ　ｂｉｏｇｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．
Ｇｌｏｂ　Ｅｃｏｌ　Ｂｉｏｇｅｏｇｒ，１９：６４９－６６２
８６６ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷