全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Jul．２０１４,３４(４):５３０－５３４　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０４．０２０
马健尧,李焕秀,李立佼,等．番茄青枯雷尔氏菌强致病力菌株变异的研究[J]．广西植物,２０１４,３４(４):５３０－５３４
MaJY,LiHX,LiLJ,etal．VariationofvirulentstrainsofRalstoniasolanacearumisolatedfromtomato[J]．Guihaia,２０１４,３４(４):５３０－５３４
番茄青枯雷尔氏菌强致病力菌株变异的研究
马健尧,李焕秀∗,李立佼,谭华强,张　莉,铁曼曼
(四川农业大学 园艺学院,四川 雅安６２５０１４)
摘　要:为研究番茄青枯雷尔氏菌强致病力菌株的变异,探索了继代培养、在NB培养基上不同时间培养、不
同pH处理７d和１５d、不同温度处理１h后对强致病力菌株变异的影响.结果表明:随着继代培养的培养代
数增加,平均弱化指数成增大趋势,在第１０代出现了无致病力菌株;在NB培养基上培养１５d时,强致病力菌
株已完全转化为不确定菌株和无致病力菌株,在培养３０d时,强致病力菌株几乎完全转化为无致病菌株;
pH７．０时,处理７d和１５d后,强致病力菌株比例均为最大,分别为９３．３３％和９２．２２％,pH５．８时,强致病力菌
株比例最低,分别为４６．６７％和３１．１１％;用不同温度处理强致病力菌株发现,温度５０℃时,菌株死亡,温度４０
℃时,活菌数显著低于其他(４~３０℃)处理,强致病力菌株比例为４~４０℃所有处理中最低.
关键词:青枯雷尔氏菌;强致病力菌株;无致病力菌株;弱化指数
中图分类号:S４３６　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０４Ｇ０５３０Ｇ０５
VariationofvirulentstrainsofRalstonia
solanacearumisolatedfromtomato
MAJianＧYao,LIHuanＧXiu∗,LILiＧJiao,TAN HuaＧQiang,
ZHANGLi,TIEManＧMan
(CollegeofHorticulture,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an６２５０１４,China)
Abstract:InordertostudythevariationofRalstoniasolanacearumvirulentstrainsisolatedfromtomato,theinfluenceof
subculturetimes,diferentculturetimeonNBmedium,diferentpHin７dand１５dtreatments,１htreatmentatdiferent
temperaturesonthevariationofvirulentstrainswereinvestigated．Theresultsshowedthattheaverageatenuationindex
raisedwiththeincreasingofsubculturegeneration,andavirulentstrainappearedinthetenthgeneration．Virulentstrains
hadbeencompletelytransformedtouncertainvirulentstrainsandavirulentstrainsafter１５donNBmedium,andthenalＧ
mostbecameavirulentstrainsafter３０d．Virulentstrainsaccountedforthelargestproportionafter７dand１５dcultivaＧ
tionunderpH７．０,therateswere９３．３３％,９２．２２％respectively．Onthecontrary,virulentstrainsoccupiedtheleastproＧ
portionunderpH５．８withthepercentageof４６．６７％,３１．１％respectively．WhenvirulentstrainsweretreatedbythedifＧ
ferenttemperatures,thestrainsdeadat５０℃．Andwhenthetemperaturewas４０℃,thenumberoflivestrainswassigＧ
nificantlylowerandthevirulentstrainswereatlowerratiothananyothertemperature(４－３０℃)．
Keywords:Ralstoniasolanacearum;virulentstrains;avirulentstrains;attenuationindex
　　番茄青枯病是一种细菌性病害,由番茄青枯病
菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种土传性维
管束病害,会造成毁灭性灾害,严重影响番茄生产
(肖烨等,２００７).青枯菌的致病性存在差异,通过
Co６０辐射、紫外光诱变、转座子 Tn５诱变及自发突
变体等途径将致病菌株转化为无致病菌株,并用无
收稿日期:２０１３Ｇ１１Ｇ０４　　修回日期:２０１４Ｇ０１Ｇ０８
基金项目:四川省科技厅科技支撑项目(２０１０Ｇ２０１３,２０１１NZ００１４);四川农业大学双支计划项目(２０１２Ｇ２０１４,０３５７０２２３).
作者简介:马健尧(１９８７Ｇ),男,四川德阳人,硕士,研究方向为蔬菜病害及生物防治,(EＧmail)６０２１０７４８４＠qq．com.
∗通讯作者:李焕秀,博士,教授,博士生导师,主要从事蔬菜栽培生理和生物技术研究,(EＧmail)４７９９４２０１４＠qq．com.
致病菌株处理番茄苗能在一定程度上起到防治青枯
病的作用(Trigaletetal,１９９０;康耀卫等,１９９５;程
本亮,２０１０;董春等,１９９９).青枯雷尔氏菌在人工培
养的条件下易发生突变,产生致病性的丧失.张长
龄等(１９９３)将芝麻和花生青枯雷尔氏菌强致病力菌
株Ss１和P９分别在斜面每隔２d移植一次,连续５
次后,在TTC培养基上菌落已１００％呈红色,变成
无致病力菌株或弱致病力菌株.弱化指数的构建,
确定弱化指数作为致病性指标的范围,简化了青枯
雷尔氏菌致病性变化的测定,为致病性研究提供了
量化指标(刘波等,２００４).青枯雷尔氏菌在不同寄
主、不同发病状态、不同生育期植株体内的分布及致
病力呈现明显的生态位分化的特征(刘波等,２００７).
在感青枯病的辣椒和马铃薯中分离的青枯雷尔氏菌
具有相同的基因,且这种基因决定其侵染能力
(Yeonhwaetal．,２０１１).本文在前人研究基础上,
通过继代培养、在NB培养基上不同时间培养、不同
pH处理、不同温度处理,研究了强致病力菌株的存
活和变异的情况及弱化指数,为进一步研究青枯菌
的致病性变化提供参考.
１　材料与方法
１．１材料
供试强致病力菌株在四川农业大学雅安校区农
场园艺系试验田从番茄青枯病发病植株上分离获
得,编号CN１２０６１２Ｇ０３.平板培养基为 TTC培养
基,液体培养基为 NB培养基.摇床采用恒温立式
振荡器 HQL１５０C(武汉中科科仪技术发展有限责
任公司生产).恒温培养箱采用隔水式恒温培养箱
GNPＧ９０８０型(上海三发科学仪器有限公司生产).
紫外分光光度计为 UVＧ１６００型紫外可见分光光度
计(上海美谱达仪器有限公司生产).冷冻离心机为
Centrifuge５８０４R(eppendorf公司生产).
１．２方法
１．２．１青枯雷尔氏菌弱化指数　弱化指数＝雷尔氏
菌单菌落的红斑直径/雷尔氏菌单菌落的总直径.
其中＜０．６０的菌株为强致病力菌株,＞０．８０菌株为
无致病力菌株,介于０．６０~０．８０之间的菌株致病性
为不确定性(刘波,２００７).
１．２．２继代培养对强致病力菌株转化的影响　将强
致病力菌株用TTC培养基活化后,用接种环挑取
一环放入NB培养基,装液量为５０mL,置３０℃,恒
温摇床１８０r􀅰minＧ１培养,１代培养２４h,２０℃,
３０００r􀅰minＧ１离心,弃上清,加入无菌水,用稀释平
板法,TTC培养基上２８℃培养４８h,随机挑取３０
个单菌落,观察菌落形态,分别测定弱化指数.每
２４h转代一次,以此类推,直到第１０代,比较各代弱
化指数和不同致病性菌株在菌落中的比例变化.
１．２．３NB培养基不同时间培养对强致病力菌株转
化的影响　将强致病力菌株用 TTC培养基活化
后,每处理用接种环挑取一环放入NB培养基中,装
液量为５０mL,置３０℃,恒温摇床１８０r􀅰minＧ１分
别培养２、３、５、７、１０、１５、２０、３０d后取出,２０ ℃,
３０００r􀅰minＧ１离心,弃上清,加入无菌水,用稀释平
板法,TTC培养基２８℃培养４８h,每处理随机挑取
３０个单菌落,观察菌落形态,分别测定弱化指数.
１．２．４不同pH处理对强致病力菌株转化的影响　
将供试强致病力菌株用TTC培养基活化后,用接
种环挑取一环放入NB培养基,装液量为５０mL,置
３０℃,恒温摇床１８０r􀅰minＧ１培养２４h后,２０℃,
３０００r􀅰minＧ１离心,弃上清,用不同pH的Na２HPO４Ｇ
NaH２PO４磷酸缓冲液(pH为５．８、６．２、６．６、７．０、７．４、
７．８)分别将菌株调浓度至６×１０８cfu􀅰mLＧ１,置于室
温下(２０~２５℃)保存７、１５d后,采用稀释平板法,
TTC培养基上２８℃培养４８h,统计各处理的青枯
雷尔氏菌的活菌数,同时每个处理随机挑取３０个单
菌落,观察菌落形态,分别测定弱化指数.
１．２．５不同温度处理对强致病力菌株转化的影响　
将供试强致病力菌株用TTC培养基活化后,用接
种环挑取一环放入NB培养基中,装液量为５０mL,
置３０℃,恒温摇床１８０r􀅰minＧ１培养２４h后,２０
℃,３０００r􀅰minＧ１离心,弃上清,用无菌水分别将菌
株调浓度至６×１０８cfu􀅰mLＧ１,进行不同温度(４、１０、
２０、３０、４０、５０ ℃)处理１h后,采用稀释平板法,
TTC培养基上２８℃培养４８h,统计各处理的青枯
雷尔氏菌的活菌数,同时每个处理随机挑取３０个单
菌落,观察菌落形态,分别测定弱化指数.
１．３数据统计分析
采用SPSS１９．０和Excel２０１０进行数据统计分
析.实验结果进行相关分析以及邓肯检验.
２　结果与分析
２．１继代培养对强致病力菌株转化的影响
表１结果表明,随着继代培养次数的增加,青枯
１３５４期　　　　　　　　　马健尧等:番茄青枯雷尔氏菌强致病力菌株变异的研究
雷尔氏菌菌落中强致病力菌株比例逐渐下降,不确
定菌株比例逐渐上升,继代培养第６代时,强致病力
菌株比例从８２．２２％降到６３．３３％,继代培养第７代
时,强致病力菌株比例从６３．３３％降到３５．５６％,不确
定菌株比例从３６．６７％升高到６４．４４％,第１０代时出
现了无致病力菌株,此时强致病力菌株比例为
５．５６％.从总体上看,随着继代培养代数增加,平均
弱化指数成增大趋势,两者成正相关(r＝０．９１８).
继代培养１~３代时,强致病力菌株比例与不确定菌
株比例均无显著性差异(P＞０．０５),继代培养４~１０
代时强致病力菌株比例与不确定菌株比例均存在显
著性差异(P＜０．０５),无致病力菌株比例在第１０代
时显著高于其他代次(P＜０．０５).
表１　继代培养对青枯雷尔氏菌CN１２０６１２Ｇ０３转化的影响
Table１　Effectofsubcultureontransformationof
RalstoniasolanacearumstrainCN１２０６１２Ｇ０３
培养代次
Generation
强致病力
菌株比例
Percentage
ofvirulent
strain(％)
不确定菌株
比例
Percentageof
uncertain
virulence
strain(％)
无致病力
菌株比例
Percentage
ofavirulent
strain(％)
平均弱化指数
Averageof
attenuation
index
１ １００．００a ０．００h ０．００b ０．５２５４c
２ １００．００a ０．００h ０．００b ０．５２０７c
３ ９８．８９a １．１１h ０．００b ０．５１７０c
４ ９１．１１b ８．８９g ０．００b ０．５４３１bcd
５ ８２．２２c １７．７８f ０．００b ０．５２３３cd
６ ６３．３３d ３６．６７e ０．００b ０．５８０２abcd
７ ３５．５６e ６４．４４d ０．００b ０．６２０７abc
８ ２１．１１f ７８．８９c ０．００b ０．６１６４abc
９ １０．００g ９０．００a ０．００b ０．６５９７ab
１０ ５．５６h ８３．３３b １１．１１a ０．７０７９a
　注:小写字母不同表示差异达显著水平(P＜０．０５).下同.
　Note:Differentsmallettersshowsignificantly(P＜０．０５)differencesin
abovetable．Thesamebelow．
２．２不同时间培养对强致病力菌株转化的影响
由表２可知,随着培养天数增加,强致病力菌株
比例逐渐下降,不确定菌株比例先升高后降低,培养
５d 时,强致病力菌株比例从 ８６．６７％ 下降到
２５．５６％,不 确 定 菌 株 比 例 从 １３．３３％ 增 加 到
７４．４４％,培养７d时,出现了无致病力菌株,培养到
１５d时,强致病力菌株比例降至０％,培养３０d时,
几乎所有菌株都转化为无致病力菌株.随着培养时
间的增加,平均弱化指数成增大趋势,在NB培养基
上连续培养天数与平均弱化指数成正相关(r＝
０．８８０),平均弱化指数差异显著(P＜０．０５).培养
２、３、５、７、１０d均在强致病力菌株比例和不确定菌
株比例上差异显著(P＜０．０５),培养７、１０、１５、２０、３０
d无致病力菌株比例差异显著(P＜０．０５).
表２　在NB培养基上不同时间培养对青枯
雷尔氏菌CN１２０６１２Ｇ０３转化的影响
Table２　Efectofculturetimeontransformationof
RalstoniasolanacearumstrainCN１２０６１２Ｇ０３inNBmedium
培养天数
Cultureday
(d)
强致病力
菌株比例
Percentage
ofvirulent
strain(％)
不确定菌
株比例
Percentage
ofuncertain
virulence
strain(％)
无致病力
菌株比例
Percentage
ofavirulent
strain
(％)
平均弱化
指数
Averageof
attenuation
index
２ １００．００a ０．００f ０．００f ０．５２３６h
３ ８６．６７b １３．３３e ０．００f ０．５３８３g
５ ２５．５６c ７４．４４a ０．００f ０．６２６８f
７ １６．６７d ６１．１１b ２２．２２e ０．６６５５e
１０ ４．４４e ５１．１１c ４４．４４d ０．７４６２d
１５ ０．００f ３０．００d ７０．００c ０．７７７３c
２０ ０．００f １６．６７e ８３．３３b ０．７９８９b
３０ ０．００f １．１１f ９８．８９a ０．８１９４a
２．３不同pH处理对强致病力菌株转化的影响
由图３可知,随着处理pH的增高,强致病力菌
株比例呈先增高后降低的趋势,pH７．０时,强致病力
菌株比例最高.分别对不同pH处理７d和１５d后
不同致病力菌株比例进行相关性分析,处理７d时,
各不同pH处理与强致病力菌株比例和不确定菌株
比例无相关性,但与无致病力菌株比例成正相关
(r＝０．７９３).表明在不同pH处理７d情况下,随着
pH的增大,无致病力菌株比例也随之增大.处理
１５d时,各pH与不同致病力菌株均无相关性.
在处理７d条件下,pH７．０和其他各pH 处理
后强致病力菌株比例呈显著性差异(P＜０．０５),比
例值最大,为９３．３３％;pH５．８处理后,强致病力菌株
比例最小,为４６．６７％;各pH 处理与不确定菌株比
例均无显著性差异(P＞０．０５);pH７．４、pH７．８与其
他各pH处理下无致病力菌株比例呈显著性差异
(P＜０．０５),比例值最大,分别为７．７８％和１０．００％.
在处理１５d条件下,各pH处理强致病力菌株
比例差异显著(P＜０．０５).pH５．８和pH７．８处理对
无致病力菌株比例影响显著(P＜０．０５),无致病力
菌株比例分别为１６．６７％和１４．４４％.
处理７d和１５d,不同pH处理与平均弱化指
数均无相关性.不同pH处理与平均弱化指数变化
显著性分析表明,培养７d,pH５．８与pH７．８处理下
平均弱化指数显著高于其他各pH处理(P＜０．０５);
而pH６．２、pH６．６、pH７．４处理下的平均弱化指数间
无差异(P＞０．０５);pH７．０处理下的平均弱化指数
显著低于其他所有pH处理(P＜０．０５);培养１５d,
pH５．８与pH７．８处理下平均弱化指数显著高于其
２３５ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
表３　不同pH处理对青枯雷尔氏菌CN１２０６１２Ｇ０３转化的影响
Table３　EffectofdifferentpHontransformationofRalstoniasolanacearumstrainCN１２０６１２Ｇ０３
不同pH
DifferentpH
处理天数
Treatment
day
(d)
活菌数
No．ofbacterium
(１０８cfu􀅰mLＧ１)
强致病力
菌株比例
Percentageof
virulentstrain(％)
不确定
菌株比例
Percentageof
uncertainvirulence
strain(％)
无致病力
菌株比例
Percentageof
avirulentstrain(％)
平均弱化指数
Averageof
attenuationindex
５．８ ７ ５．７９±０．４９a ４６．６７e ５２．２２a １．１１c ０．６０６３a
６．２ ７ ５．８２±０．５６a ７０．００c ２８．８９a １．１１c ０．５７５７b
６．６ ７ ５．８２±０．４５a ８４．４４b １０．００a ５．５６b ０．５６５３b
７．０ ７ ５．８４±０．５５a ９３．３３a ６．６７a ０．００c ０．５３１９c
７．４ ７ ５．８５±０．４３a ８２．２２b １０．００a ７．７８ab ０．５６３８b
７．８ ７ ５．８２±０．３３a ５４．４４d ３５．５６a １０．００a ０．６１５０a
５．８ １５ ５．７５±０．２７a ３１．１１f ５２．２２a １６．６７a ０．６３８５a
６．２ １５ ５．８０±０．３５a ５３．３３d ４３．３３ab ３．３４b ０．６０８８b
６．６ １５ ５．８２±０．４６a ８２．２２b １５．５６cd ２．２２b ０．５６３９c
７．０ １５ ５．８３±０．５８a ９２．２２a ７．７８d ０．００b ０．５３８３d
７．４ １５ ５．８５±０．６３a ７２．２２c ２４．４５bcd ３．３３b ０．５７３４c
７．８ １５ ５．８２±０．２７a ４６．６７e ３８．８９abc １４．４４a ０．６４５４a
表４　不同温度处理１h对青枯雷尔氏菌CN１２０６１２Ｇ０３转化的影响
Table４　EffectofdifferenttemperaturesontransformationofRalstoniasolanacearumstrainCN１２０６１２Ｇ０３
温度
Temperature
(℃)
活菌数
No．ofbacterium
(１０８cfu􀅰mLＧ１)
强致病力菌株比例
Percentageof
virulentstrain(％)
不确定菌株比例
Percentageofuncertain
virulencestrain(％)
无致病力菌株比例
Percentageof
avirulentstrain(％)
平均弱化指数
Averageof
attenuationindex
４ ５．８５±０．４６a ９０．００bc ６．６７b ３．３３ab ０．５５２２bc
１０ ５．８４±０．４９a ８４．４４c １０．００b ５．５６a ０．５５７２b
２０ ５．８８±０．３５a ９８．８９a １．１１c ０．００b ０．５３４７c
３０ ５．８６±０．４８a ９４．４４ab ５．５６b ０．００b ０．５４６６bc
４０ ４．８９±０．５７b ４２．２２d ５６．６７a １．１１b ０．６１８５a
５０ ０．００ － － － －
他各pH处理(P＜０．０５);pH６．２处理下的平均弱化
指数显著高于pH６．６、pH７．０、pH７．４的处理(P＜
０．０５);pH７．０处理下平均弱化指数显著低于其他所
有pH处理(P＜０．０５).
２．４不同温度处理对强致病力菌株转化的影响
由表４可知,温度５０℃时,未观察到活菌.去
除５０℃进行单因素方差分析,４０℃处理下的活菌
数显著低于其他温度的活菌数,表明在４０℃下,已
有菌株死亡.各温度处理与强致病力菌株比例以及
不确定菌株比例均无相关性,而与弱致病力菌株比
例成负相关(r＝Ｇ０．５２２).不同温度处理与平均弱
化指数成正相关(r＝０．５８１).４０℃处理下强致病
力菌株比例显著低于其他温度(０~３０℃)处理(P
＜０．０５);４０℃处理下不确定菌株比例显著高于其
他温度处理(P＜０．０５),而２０℃处理下不确定菌株
比例显著低于其他温度处理(P＜０．０５),温度为４、
１０、３０℃处理下的不确定菌株比例无显著差异(P
＞０．０５);１０℃处理下无致病力菌株比例显著高于
２０、３０、４０℃处理(P＜０．０５),但与４℃处理无显著
性差异(P＞０．０５).
３　讨论与结论
刘波等(２００４)研究发现,继代培养第１５代时,
所有强致病力菌株几乎都转化为无致病力菌株;
TTC液体培养１~５d对强致病菌株无致弱作用;
农用链霉素和超声波处理均无致弱作用.本研究发
现,随着继代培养代数的增加强致病菌株比例逐渐
降低,不确定菌株比例逐渐增大,直到第１０代,出现
了无致病力菌株;在NB培养基上培养７d时,出现
了无致病力菌株,培养１５d时,已无强致病力菌株,
培养３０d时,无致病力菌株比例达９８．８９％.
葛芸英等(２００１)研究发现,保存６a后,在pH
为４．０、５．８、６．５的保存液中未检测到活菌,在pH
６．８、７．０、８．５、９．０的保存液中检测到活菌,但其实验
未进行定量测定.程本亮(２０１０)的研究表明无致病
力突变株的最适pH均是６~７之间,在pH为５的
条件下所有菌株都不能生长,在pH 为９的条件下
仅有少量原始菌株Rs９１生长;无致病力突变株的
最适生长温度与Rs９１无差异,为３０℃;４５℃时,除
３３５４期　　　　　　　　　马健尧等:番茄青枯雷尔氏菌强致病力菌株变异的研究
三株突变株能生长外,其他菌株均不能生长或仅有
极少量的生长.本实验发现在４０℃处理强致病菌
株１h后,活菌数显著低于其他处理,表明在４０℃
时已有部分菌株死亡,在５０℃处理中未发现活菌存
在.另外２０℃处理下,不确定菌株比例显著低于其
他处理,强致病力菌株比例最高,表明２０℃可能为
青枯雷尔氏菌强致病力菌株最适存活温度.４０℃
处理下不确定菌株比例显著高于其他温度处理,表
明此温度下,强致病力菌株存在较大程度的变异.
刘波等(２００４)研究发现,野生型青枯雷尔氏菌
存在强致病力菌株和无致病力菌株的混杂,生防菌
的致弱过程伴随着强致病力菌株和无致病力菌株比
例的变化,当强致病力菌株占优势时,菌株表现出致
病性,当无致病力菌株占优势时,菌株不表现出致病
性.表明在青枯雷尔氏菌强致病菌株的侵染过程
中,抢占侵染位点是导致青枯病的一个原因.
野生型强致病力青枯雷尔氏菌基因组中的phc
基因(表型转换系统基因)发生突变后,形成无致病
力菌株,菌落形态也随之改变 (程本亮,２０１０;
Kelman,１９５４).通过Co６０辐射、紫外光诱变、转座
子Tn５诱变及自发突变体等途径获得无致病力青
枯菌,并用于防治青枯病取得效果(Trigaletetal．,
１９９０;康耀卫等,１９９５;董春等,１９９９).青枯雷尔氏
菌具有寄主专化性,杨玉秀等(２０１３)的研究结果表
明,菌株HX１５及HX１７对广藿香的致病性明显高
于番茄和花生,菌株HX６对３种寄主均有较强的致
病性.番茄青枯菌GIM１．７０对广藿香仅有弱致病
性.Yeonhwaetal．(２０１１)在导致辣椒发病的菌株
SL３４１中和导致马铃薯发病的菌株SL２０２９中分离
出一个共同的基因rsa１,它控制SL２０２９对辣椒不
致病,同时控制SL３４１对辣椒致病.
本研究通过继代培养、在 NB培养基上不同时
间培养、不同pH处理、不同温度处理,找出青枯雷
尔氏菌强致病力菌株变异的情况,对研究人工处理
青枯雷尔氏菌强致病力菌株转化为无致病力菌株进
而用无致病力菌株防治青枯病有一定意义.青枯雷
尔氏菌强致病力菌株在培养过程中也容易发生自然
突变,在分离无致病力菌株过程中要加以区别,但目
前还未找到很好的区分方法.关于青枯雷尔氏菌强
致病菌株变异以及致弱机理还有待进一步研究.
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