全 文 ：植物保护科学
ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.24No.82008August
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农作物青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia
solanacearum）引起的一种世界性的土传细菌性病害[1]。
其中，以茄科作物受害最为严重，且以烟草、番茄、辣椒
和茄子的受害尤甚，在严重发生年份甚至造成失收[2]。
作物青枯病的防治策略是根据其病原性质、传播
途径、发生流行规律、品种抗性，以及发生流行与环境
因素的关系制订的，具体包括避免或阻止病原菌传入、
扑灭传入病原菌，以及开展治理防治以减轻甚至完全
控制病害发生等三大措施。中国南方大部分地区青枯
病发生为害严重，所采取的防治策略主要是治理防治。
治理防治是指对病害发生地区内的作物青枯病进行防
治管理，通常采取杀死病原菌、抑制病原菌生长、提高
植株抗病性，或创造有利于植株生长而不利于病害发
生的环境条件的方法和措施，减少病原菌的种群数量，
降低发病率，减少危害，甚至完全控制发病，因此青枯
病的早期检测技术就成为治理防治的关键[3]。目前可
基金项目：福建省发改委项目“控制茄科病害拮抗菌剂生产关键技术的研究与应用”(闽农产(2006)10号)；福建省农科院科技创新团队建设基金“微
生物基础生物学与农业生物药物创新团队”(STIF-Y03)；福建省科技平台建设项目“福建省农业生物药物研究与应用平台”(2007N2010)。
第一作者简介：朱育菁，女，1972年出生，福建福州人，副研究员，博士，从事植物病害微生物及其生物防治。通信地址：350003福州市五四路247号，
福建省农科院农业生物资源研究所。Tel:0591-87848933，E-mail:zyjingfz@163.com。
通讯作者：刘波，男，1957年出生，福建惠安人，研究员，博士，主要从事生物技术和生物防治研究。通信地址：350003福州市五四路247号，福建省农
业科学院。Tel:0591-87848933，E-mail:laeptb@163.com。
收稿日期：2008-05-16，修回日期：2008-06-23。
茄科作物青枯病原菌的脂肪酸鉴定
朱育菁,肖荣凤,王秋红,陈 璐,刘 波
（福建省农科院农业生物资源研究所，福州350003）
摘 要:【研究目的】采用脂肪酸鉴定技术对茄科作物青枯病原菌进行鉴定,以期为青枯病的预防与防治
提供技术支持。【方法】采用选择性培养技术对茄子、番茄和辣椒病株进行青枯病原菌的分离和纯化,而
后对青枯病原菌进行脂肪酸鉴定。【结果】经选择性培养分离得到的36株青枯病原菌中,有33株鉴定为
典型的青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum),占91.67%;茄子、番茄和辣椒上的青枯病原菌被鉴定为青
枯雷尔氏菌的比例分别为100%、90%和89.47%。【结论】脂肪酸鉴定技术具有快速性、准确性,并可通过
计算机的运用使分类达到数据化、自动化,可在茄科作物青枯病的检测中得到广泛的应用。
关键词:茄科作物;青枯雷尔氏菌;脂肪酸鉴定
中图分类号:S432.4 文献标识码:A
Faty-acidIdentificationofRalstoniasolanacearumonSolanacaeCrops
ZhuYujing,XiaoRongfeng,WangQiuhong,ChenLu,LiuBo
(AgriculturalBioresourceResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350003)
Abstract:【OBJECTIVE】Faty-acididentificationtechnologywasusedtoidentifytheRalstoniasolanacearum
onsolanacaecrops,inordertosupplyatechnologyforpreventionandcontrolofbacterialwiltdisease.
【METHOD】Thepathogeniesofbacterialwiltdiseaseoneggplant,tomatoandpepperplantswereisolatedand
purifiedbyusingselectiveculturetechnology,andthenidentifiedbyfaty-acididentificationtechnology.
【RESULTS】Amongthe36isolatedpathogeniesofbacterialwiltdiseasesofsolanacaecrops,33strainswere
identifiedastypicalstrainsofR.solanacearum (91.67%).TheratiosofthepathogeniesidentifiedasR.
solanacearumwere100.0%,90.0%and89.5%oneggplant,tomatoandpepper,respectively.【CONCLUSION】
Thefaty-acididentifiedtechnologywasrapidandaccurate,andtheclassificationcouldbedatalizationand
automatization.Itmighthaveabroadapplicationonthedetectionofsolanacaecropbacterialwilt.
Keywords:Solanacaecrops,Ralstoniasolanacearum,faty-acididentification
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以利用的病原菌特异性分离和检测技术有：选择性培
养基分离培养技术、荧光免疫检测技术、酶联免疫吸附
法检测技术和多聚酶链式反应DNA扩增技术等[4~6]。
脂肪酸是构成生物膜的重要物质，细菌的细胞结
构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌的DNA具有高度
的同源性，各种细菌具有其特征性的细胞脂肪酸指纹
图谱[7]。国内外已有把脂肪酸用于细菌鉴定的报道[8,9]。
该研究采用脂肪酸鉴定技术对茄科作物青枯病原菌进
行鉴定，以期为青枯病的预防与防治提供技术支持。
1材料与方法
1.1试验时间、地点
供试样本于2006年7月采集于宁德市屏南县双溪
村，从经济茄科作物番茄、茄子和辣椒青枯病严重发生
的田块采集萎蔫症状明显且发病早的植株样本。室内试
验于2006年在福建省农科院生物技术研究所进行。
1.2培养基、试剂与分析仪器
青枯病病原菌分离纯化采用为2,3,5-氯化三苯基
四氮唑培养基（简称TTC）培养。脂肪酸细菌培养基为
TSBA培养基：30g胰蛋白胨大豆肉汤（Trypticsoy
broth，TSB）+15g琼脂 +1L水（TSB购于 Fisher公
司）。脂肪酸提取试剂：皂化试剂，氢氧化钠45g+甲醇
150ml+水150ml；甲基化试剂，6N盐酸325ml+甲
醇275ml；萃取试剂，正已烷200ml+甲基叔丁基乙醚
200ml；洗涤试剂，氢氧化钠10.8g+水900ml。配制方
法由 Midi公司提供）。气相色谱系统采用的是美国
Agilent6890N型，包括全自动进样装置、石英毛细管
柱及氢火焰离子化检测器。
1.3青枯病原菌的分离与纯化
青枯病原菌的分离与纯化采用选择性培养技术，
参照方中达的方法[10]用 TTC培养基分离纯化。取番
茄、茄子和辣椒萎蔫植株上的新鲜病组织（一般是根茎
部），用75%酒精处理2s后，再用10%的NaClO处理
2~3min，取出用无菌水清洗3遍，剪碎后于无菌水浸
泡20~30min，于TTC平板培养基上划线培养，3次重
复置于30±1℃培养箱中培养48h。挑取一定量上述
分离到的菌体于含9ml无菌水的试管中（内含玻璃
珠），在振荡器上震荡，以打碎菌体，做梯度稀释，涂板，
置于30±1℃，培养48h，以获得单菌落；根据菌落形
态和培养性状观察，挑取具有典型的青枯病原菌菌落
特征的单菌落保存于20~25℃的无菌水中，备用。在
TTC培养基上形成中央为粉红至红色，外围白色具流
质状的为典型青枯病原菌菌落。
1.4青枯病原菌的脂肪酸鉴定
1.4.1脂肪酸的提取 细菌培养条件：TSBA平板培养
基，四线划线法，培养温度28±1℃，培养时间24±2h。
获菌：用接种环挑取3~5环（约40mg湿重）的菌落置
入一个干净、干燥的有螺旋盖的试管中（最佳的获菌区
域为第3区）。皂化：加入1.0±0.1ml皂化试剂，拧紧盖
子，振荡5~10s，放入 95~100℃的沸水中 5min，室温
冷却，振荡5~10s，再水浴25min，室温冷却。甲基化：
开盖加入 2.0±0.1ml甲基化试剂，拧紧盖子，振荡
5~10s，80±1℃水浴10min，移开且快速用流动自来水
冷却至室温。萃取：加入1.25±0.1ml的萃取试剂，拧紧
盖子，温和混合旋转10min，打开管盖，利用干净的移
液管取出每个样本的下层水相部份。基本洗涤：加入
3.0±0.2ml洗涤试剂，拧紧盖子，温和混合旋转5min，
打开管盖，利用干净的移液管移出约2/3体积的上层
有机相到干净的气相色谱检体小瓶，用于气相检测。
1.4.2脂肪酸的检测 在下述色谱条件下平行分析脂肪
酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱温，
170℃起始，5℃/min升至260℃，而后40℃/min升温
至 310℃，维持 90s；汽化室温度 250℃、检测器温度
300℃；载气为氢气 (2ml/min)、尾吹气为氮气(30
ml/min)；柱前压l0.00psi(1psi=6.895kPa)；进样量lμl，
进样分流比100:l。
1.4.3脂肪酸的鉴定 分析软件应用美国MIDI公司开
发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的软件Sher-
lockMIS4.5（MicrobialIdentificationSystem）和LGS4.5
（LibraryGenerationSoftware）。系统根据各组分保留时
间计算等链长（ECL）值确定目标组分的存在、采用峰
面积归一化法计算各组分的相对含量，再将二者与系
统谱库中的标准菌株数值匹配计算相似度（Similarity
Index，SI），从而给出一种或几种可能的菌种鉴定结
果。一般以最高SI的菌种名称作为鉴定结果，但当其
报告的几个菌种的SI比较接近时，则根据色谱图特征
及菌落生长特性进行综合判断。以脂肪酸混合标样校
正保留时间。
2结果与分析
2.1茄科作物青枯病原菌的分离与纯化
采集到的萎蔫的3株番茄、2株茄子和6株辣椒
病株用TTC培养基进行分离纯化，于30±1℃下培养
48h后，都观察到有形状不规则、带粘性、外缘白色、中
央淡粉红色的菌落生长，判定为青枯病原菌；其中，致
病力强的菌株外缘白色带较宽，反之，致病力弱的菌株
外缘白色带较窄（图1）。镜检可见菌体短杆状单细胞，
两端圆，单生或双生，(0.9~2.0)μm×(0.5~0.8)μm，极生
鞭毛1~2根。从番茄、茄子和辣椒处理中分别随机挑取
10、7和19株青枯病原菌进行脂肪酸测定。
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2.2茄科作物青枯病原菌的脂肪酸鉴定
将分离到的36株茄科作物青枯病原菌进行脂肪
酸鉴定的结果见表1。33株被鉴定为典型的青枯雷尔
氏菌（Ralstoniasolanacearum），匹配系数大于 0.500，
表明均为典型菌株，占91.67%。其中，茄子上分离的7
株均被鉴定为典型的青枯雷尔氏菌，鉴定比例为
100.0%；番茄上分离的10株中有9被鉴定典型青枯
雷尔氏菌，鉴定比例为 90.0%，剩余 1株被鉴定为相
接近菌株。辣椒中分离的19株菌，只有17株被鉴定
为典型青枯雷尔菌，鉴定比例为 89.5%；其余 1株鉴
定为典型的放射型根瘤菌 (Rhizobiumradiobacter)，匹
配系数为0.873（大于0.500），1株被鉴定为河流孤菌
（Vibrioholisae），但其的匹配系数小于0.300，表明结
果不确定。
图1茄科作物青枯病原菌在TTC平板培养基上的菌落形态
番茄青枯病原菌 茄子青枯病原菌 辣椒青枯病原菌
来源
番茄I
番茄II
番茄III
茄子I
茄子II
辣椒I
辣椒II
辣椒III
菌株序号
5#1-1
5#1-2
5#2-1
5#2-2
6#1-1
6#1-2
6#2-1
6#2-2
7#1
7#2
8#1
8#2-1
8#2-2
9#1-1
9#1-2
9#2-1
9#2-2
14#1-1
14#1-2
14#2-1
14#2-2
15#1
15#2
16#1-1
16#1-2
16#2-1
16#2-2
采集地点
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
SimilarityIndex
0.832
0.576
0.827
0.851
0.850
0.879
0.861
0.744
0.156
0.552
0.743
0.813
0.815
0.777
0.879
0.852
0.790
0.871
0.869
0.891
0.868
0.747
0.742
0.864
0.867
0.845
0.802
EntryName
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
表1脂肪酸鉴定结果
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注：*细菌鉴定仪对于SimilarityIndex的诠释：大于0.500：说明匹配性很高，为典型的菌种；大于0.300小于0.500：说明匹配性较低，为非典
型菌种；小于0.300：说明数据库没有此菌种的数据，给出的是最接近的相关的菌种。
来源
辣椒IV
辣椒V
辣椒VI
菌株序号
17#1-1
17#1-2
17#2-1
17#2-2
18#1
18#2-1
18#2-2
20#1
20#2
采集地点
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
宁德屏南
SimilarityIndex
0.264
0.909
0.871
0.854
0.811
0.838
0.855
0.758
0.873
EntryName
Vibrioholisae
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Ralstoniasolanacearum(Burkholderia,Pseudomonas)
Rhizobiumradiobacter(Agrobacteriumtumefaciens)
3结论
青枯雷尔氏菌是一个比较复杂的细菌，适应性强，
寄主范围很广，可侵害44个科的300多种植物[11]，在
寄主范围、地理分布、致病特征、流行特征、种下分化等
方面存在较大的差异，具有明显的多态性[12]。
气相色谱技术是一种分离效能高、分析速度快、灵
敏性及特异性高的分离分析方法，应用气相色谱技术
和SherlockMIS数据分析系统分析青枯雷尔氏菌脂肪
酸可通过单次试验将青枯雷尔氏菌鉴定到种。该方法
采用的是高精密的分析仪器，分析对象是可随生长环
境发生变化的细胞脂肪酸成分，因此分析过程的条件
选择和质量控制则显得非常重要，必须对培养基成
分、细菌培养条件、细菌纯化、菌龄、色谱条件等试验
条件进行标准化，否则会严重影响方法的准确度和重
复性[7,9]。该技术已广泛应用于细菌鉴定和微生物多样
性研究中[13,14]。
在该研究中经选择性培养技术分离得到的36株
青枯病原菌中，有33株鉴定为典型的青枯雷尔氏菌
（R.solanacearum），占91.6%；茄子、番茄和辣椒上的青
枯病原菌被鉴定为青枯雷尔氏菌的比例分别为
100.0%、90.0%和89.5%，表明脂肪酸鉴定技术具有快
速性、准确性，并可通过计算机的运用使分类达到数据
化、自动化，可在茄科作物青枯病的检测中得到广泛的
应用。
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