全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(5): 518-531(2013)
收稿日期: 2012-02-20; 修回日期: 2013-05-15
基金项目: 国家“863”计划项目(2012AA101504); 公益性行业(农业)科研专项(201303015); 国家星火项目(S2011C410006); 福建省
公益项目(2011R1020-1)
通讯作者: 刘波,研究员,主要从事生物技术和生物农药的研究; E-mail: liubofaas@163. com
林乃铨,教授,主要从事生物防治的研究; E-mail: green48@163. com
第一作者: 郑雪芳,女,福建莆田人,副研究员,主要从事植物病害生物防治的研究; E-mail: zhengxuefangfz@163. com。
青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建
及其防效评价模型分析
郑雪芳1,2, 刘　 波2*, 林乃铨1*, 朱育菁2, 车建美2
( 1福建农林大学植物保护学院, 福州 350002; 2 福建省农业科学院农业生物资源研究所, 福州 350003)
摘要:利用青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)无致病力菌株防治番茄青枯病具有很好的应用潜力。 作者通过分离筛选
自然弱毒株、60Co辐射诱变和 EZ-Tn5 插入诱变,分别获得 3、12 和 40 株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株。 经盆栽番茄苗
致病性检测,15 d后均未发病,证实均为无致病力青枯雷尔氏菌。 进一步对番茄青枯病的防治试验表明,从番茄青枯病发
病田块分离的无致病力突变菌株 FJAT1458 的防治效果最好,防效达 100% 。 该菌株能定殖番茄植株根系土壤、根部和茎
部,定殖数量均表现为“先增后减”的趋势,并且接种浓度越大、苗龄越小,定殖数量越大。 从构建的防效模型可以看出,不
同接种浓度条件下,植株发病率随时间变化符合的回归方程不同,相关系数 R值也不同,接种浓度越大,R值越小。 本研究
获得的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株 FJAT1458 对番茄青枯病具有很好的防病效果。
关键词:番茄青枯病; 青枯雷尔氏菌; 无致病力突变菌株; 定殖; 生物防治
Construction of Ralstonia solanacearum avirulent mutants and evaluation model of
their control efficacy against tomato bacterial wilt disease　 ZHENG Xue-fang1,2, LIU Bo2,
LIN Nai-quan1, ZHU Yu-jing2, CHE Jian-mei2 　 ( 1 College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry Univer-
sity, Fuzhou 350002, China; 2 Agricultural Bio-Resources Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou
350003, China)
Abstract: Avirulent Ralstonia solanacearum has showed a good potential on control bacterial wilt disease of to-
mato. In this study, 3, 12 and 40 avirulent mutants of R. solanacearum were constructed by using spontaneous
mutagenesis, 60Co-radiated mutagenesis and EZ-Tn5 transponson mutagenesis, respectively. Pathogenicities of
these 55 mutants were detected with bioassay test using potted tomato in the greenhouse. None of these mutants
caused tomato wilting at 15th d after inoculation, which meant that they were all avirulent R. solanacearum.
Then, the 55 mutants were used to control tomato bacterial wilt and the control efficiencies were compared. The
results showed that strain FJAT1458 isolated from tomato plant was the most effective with the control effect of
100% . It was also found that strain FJAT1458 could colonize in rhizospheric soil, root and stem of tomato
plant. The colonizing density of FJAT1458 showed a tendency of ′increasing at the beginning and decreasing af-
terward’ during 1 -25 d after inoculation. Meanwhile, higher inoculated concentration and younger seedling age
resulted in more colony amount of FJAT1458 in plant. A regression model of control efficiency of the biocontrol
agent against tomato bacterial wilt was constructed. When the inoculated concentration of FJAT1458 was bigger,
the value of R was less. Therefore, the avirulent mutant FJAT1458 obtained is possessed of good control effect
on tomato bacterial wilt.
　
　 5 期 郑雪芳,等:青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析
Key words: tomato bacterial wilt; Ralstonia solanacearum; avriulent mutant; colonization; biocontrol
中图分类号: S436. 41　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2013)05-0518-14
　 　 青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)通常
引起番茄青枯病[1 ~ 3],由于该菌在土壤中存活时间
长、传播快,尚未得到有效防治[4,5]。 青枯雷尔氏
菌存在致病力分化,其弱 /无致病力菌株进入植株,
能在选择的环境或生态系统中存活、定殖,对寄主
不致病,能较长时期存于寄主组织,利用生态位竞
争和营养竞争阻止或延迟致病菌的侵入,从而防止
或延迟植株发病[6,7]。 因此,利用青枯雷尔氏菌的
弱 /无致病力菌株防治作物青枯病具有一定生防潜
力。 许多研究表明,青枯雷尔氏菌无致病力菌株能
在一定程度上控制青枯病的发展。 Yang等[8]利用
基因工程法获得的无致病力 hrp-突变体防治茄科
蔬菜青枯病,取得良好的防病效果;Chen 等[9]利用
紫外诱变法获得青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株
处理番茄,发现了番茄对青枯病原抗性,且无致病
力突变菌株可在番茄体内定殖和繁殖;此外,Liu
等[7]、Xiao 等[10]、Trigalet 等[11]及 Frey 等[12]分别
通过生防菌致弱、自然筛选、转座子 Tn5 插入诱
变、基因工程等途径获得青枯雷尔氏菌无致病力突
变菌株防治青枯病,均取得较好的防治效果。 目
前,构建青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的筛选模
型、寄主体内的定殖模型、对青枯病防效评价模型
等研究未见报道。
本研究综合采用分离筛选自然弱毒株、60 Co
辐射诱变和 EZ-Tn5 插入诱变来构建青枯雷尔氏
菌无致病力突变菌株,从中筛选出防效好、性状稳
定的菌株,研究该菌株的定殖特性,构建其对番茄
青枯病防效评价模型,为番茄青枯病的有效控制奠
定理论基础。
1　 材料与方法
1. 1　 供试材料
致病性菌株青枯雷尔氏菌 ( Ralstonia so-
lanacearum)菌株 FJAT91 分离自番茄青枯病株,由
福建省农业科学院农业生物资源研究所菌种库收
集并保存。 供试的番茄品种为金石王 1 号,购自厦
门如意集团开发有限公司。 采用培养基 TTC培养
青枯雷尔氏菌[13]。 转座子试剂盒 EZ-Tn5TM <
KAN-2 > Insertion Kit 购自美国 EPICENTR 公司;
Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自杭州博
日科技有限公司;Taq DNA 聚合酶、dNTP、限制性
内切酶 PstⅠ、T4 连接酶购自美国 Promega 公司;
卡那霉素(Km)购自美国 Sigma 公司。 青枯雷尔
氏菌特异性检测引物[14]: pehA # 3: 5′-CAG-
CAGAACCC GCGCCTGATCCAG-3′,pehA#6: 5′-
ATCGGACT TGATGCG CAGGCCGTT-3′由上海
博尚有限公司合成;3 000 bp Marker购自上海英竣
生物技术公司。
1. 2　 试验方法
1. 2. 1 　 青枯雷尔菌无致病力突变菌株的构建
(1)青枯雷尔氏菌自然弱毒株的分离 从福建建瓯
番茄青枯病发病田块采集不同发病级别的植株,进
行病原菌的分离。 分离方法参照 Liu 等[15]的方
法。 (2)青枯雷尔氏菌转座子 EZ-Tn5TM插入致弱
突变菌株的构建 以致病性青枯雷尔氏菌 FJAT91
作为出发菌株,将其活化于 TSB平板上,挑取单菌
落接种于 TSB 液体培养基中,170 rpm,30℃振荡
培养过夜;按照 1%接种比例接入 200 mL 新鲜的
10%TSB培养基中,振荡培养至对数生长中期;冰
浴 30 min,4℃,6 500 rpm 离心 15 min,去上清;无
菌水漂洗 4 次,沉淀用 1 mL无菌水悬浮。 取 1 μL
Tn5 Transposomes 与 100 μL 的感受态细胞混合;
电击条件为 2. 5 kV,25 μF和 400 Ω;电击结束后,
迅速加入 900 μL 10% TSB 培养基,100 rpm,30℃
培养后,涂布于含有 50 μg / mL Km的 10%TSB培
养基上,30℃,培养 48 h;观察菌落形态,根据菌落
形态(无流动性,中间为暗红色,白边窄,表面干
燥)挑取青枯雷尔菌无致病力突变菌株,经纯化培
养后,以终浓度为 20%的甘油于 - 80℃保存。 (3)
青枯雷尔氏菌60Co辐射致弱突变菌株的构建 青枯
雷尔氏菌 FJAT91 为出发菌株,菌株经 TTC平板活
化后,接种于 SPA 液体培养基,170 rpm,30℃培养
24 h后,8 000 rpm离心 15 min,沉淀物用生理盐水
清洗 2 ~ 3 次;调整菌悬液细胞浓度为 108 CFU / mL
915
　
植物病理学报 43 卷
将菌悬液分别分置 3 支试管中,每管 5 mL,直接进
行60Co 辐射处理,辐射剂量为 0. 5 kGy,辐射后经
系列梯度稀释后,涂布 TTC 培养基,30℃,培养 48
h;根据菌落形态挑取青枯雷尔菌无致病力突变菌
株,经纯化培养后,以终浓度为 20%的甘油于 -
80℃保存。 (4)青枯雷尔氏菌电镜样品制备 出发
菌株 FJAT91 和青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株
在 TTC培养基上培养单细胞菌落,经醋酸铀染色
和固定后,于 JEM-100CXII / S 透射电子显微镜上
观察菌体形态并拍照。 (5)青枯雷尔氏菌无致病
力突变菌株的番茄盆栽苗致病力检测 将不同途径
获得的 55 株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株在
TTC平板上活化后,接种于 SPA 培养基中,170
rpm,30℃培养 48 h,菌液稀释至 108 CFU / mL,伤
根接种于 5 ~ 6 叶龄的番茄盆栽苗上,菌株 FJAT91
做阳性对照(接种浓度 108 CFU / mL),清水作为阴
性对照,接种量为 50 mL /盆,每个处理 30 盆,每天
观察植株发病率。
1. 2. 2　 青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的防病效
果评价及其模型构建　 不同途径获得的青枯雷尔
氏菌无致病力突变菌株经 TTC 平板活化后,接种
于 SPA培养基中,170 rpm,30℃培养 48 h,菌液稀
释至 108 CFU / mL,伤根接种于 5 ~ 6 叶龄的番茄盆
栽苗上,3 d后再接种致病性青枯雷尔氏菌 FJAT91
(接种浓度 108 CFU / mL),单接种致病性青枯雷
尔氏菌 FJAT91 做对照,接种量为 50 mL /盆,每
处理 30 盆,每天观察番茄植株的发病情况,统计
不同处理番茄植株的发病率,以青枯雷尔氏菌无
致病力突变菌株为样本,番茄植株的发病率、病
情指数及防效为指标构建青枯雷尔氏菌无致病
力突变菌株的防效评价模型,从中筛选出防效好
的菌株,进一步研究其定殖特性,并构建其防效
模型。
1. 2. 3 　 青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株
FJAT1458 的定殖特性　 将菌株 FJAT1458 的培养
液(含菌量 109 CFU / mL)配制成 108 CFU / mL、106
CFU / mL和 104 CFU / mL共 3 个浓度,采用伤根接
种法,接种番茄盆栽苗,以清水为对照。 (1)不同
接种浓度处理:接种 5 ~ 6 叶龄的番茄盆栽苗,50
mL /盆,每处理 30 盆。 (2)不同苗龄接种处理:接
种 2 ~ 3 叶龄和 5 ~ 6 叶龄的番茄盆栽苗,接种浓度
106 CFU / mL,50 mL /盆,每处理 30 盆。 接种后 3、
6、9、12、15、18、21 和 24 d取样分析,每个处理随机
选取 3 株番茄植株,取其根系土壤、根及茎中部,采
用 TTC培养基分离目标菌株,根系土壤目标菌株
分离方法参照 Zhu 等[16]的方法,根及茎中部目标
菌株的分离方法参照 Liu等[15]的方法。
从番茄植株和根系土壤回收分离的目标菌株
采用水煮法[17]提取 DNA。 采用特异性引物 pehA
#6 和 pehA #3 进行青枯雷尔氏菌的分子检测。
PCR反应程序为:96℃预变性 1 min;96℃ 变性 30
s,70℃退火 30 s,72℃复性 1 min ,重复 2 个循环;
94℃变性 30 s、70℃退火 30 s、72℃复性 1 min,重
复 33 个循环;最后 72℃下延伸 5 min。 PCR 产物
置于 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳,在自动凝胶成像分
析系统上观察、拍照。
根据形态鉴定和分子鉴定结果,结合 DPS数据
统计软件,计算菌株 FJAT1458 在土壤及植株各部
位的定殖数量。 定殖数量(CFU / g) = 每个平板菌
落数 ×稀释倍数 /涂布的菌液量(mL) ×鲜重(g)。
1. 2. 4 　 青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株
FJAT1458 的温室防病试验 　 无致病力突变菌株
FJAT1458 的预接种浓度共设 5 个:104、105、106、
107 和 108 CFU / mL,处理方法同 1. 2. 2,处理后每
天观察番茄植株的发病情况,统计不同处理番茄植
株的发病率,根据植株发病程度分不同等级:0 级
为全株未出现发病症状;1 级为 1 个叶片呈现萎
蔫;2 级为 2 个或 3 个叶片呈现萎蔫;3 级为 4 个或
更多叶片呈现萎蔫;4 级为所有叶片均呈现萎蔫;5
级为茎枝死亡。
2　 结果
2. 1　 青枯雷尔氏菌突变菌株的致病力
共分离到 55 株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌
株(表 1 )。 相比出发菌株致病性青枯雷尔菌
FJAT91 在 TTC培养基上的菌落中间红斑较小,颜
色为淡红色,周围白边较大,且流动性很强 (图
1A),突变的无致病力青枯雷尔菌在 TTC 培养基
上的菌落中间红斑较大,颜色为暗红色,周围白边
很窄或无白边,无流动性(图 1B)。
025
　
　 5 期 郑雪芳,等:青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析
Table 1　 Control efficiency of Ralstonia solanacearum avirulent mutants against tomato
bacterial wilt disease with virulent strain FJAT91 used as a control treatment
Strain number Origin Infection rate (% ) Disease index Control efficiency (% )
FJAT91 (positive control) Isolated from tomato plant 100. 0 100. 0 -
FJAT1458 spontaneous mutagenesis, 0. 0 0. 0 100. 0
FJAT1453 23. 3 18. 3 76. 7
FJAT1452 26. 7 16. 7 73. 3
FJATCo1968 60Co-radiated mutagenesis 12. 5 10. 4 87. 5
FJATCo1969 25. 0 16. 7 75. 0
FJATCo1970 41. 7 36. 5 58. 3
FJATCo1971 20. 8 17. 7 79. 2
FJATCo1974 41. 7 29. 2 58. 3
FJATCo1975 45. 8 41. 7 54. 2
FJATCo1976 12. 5 11. 5 87. 5
FJATCo1981 41. 7 36. 5 58. 3
FJATCo1987 37. 5 25. 0 62. 5
FJACo1994 29. 2 22. 2 70. 8
FJAT-Co1996 41. 7 32. 3 58. 3
FJAT-Co1997 29. 2 25. 0 70. 8
T1 EZ-Tn5 transponson mutagenesis 45. 8 36. 7 54. 2
T2 41. 7 34. 2 58. 3
T6 54. 2 40. 0 45. 8
T7 8. 3 6. 3 91. 7
T8 25. 0 17. 5 75. 0
T11 66. 7 41. 7 33. 3
T50 79. 2 67. 5 20. 8
T72 50. 0 41. 7 50. 0
T140 8. 3 7. 3 91. 7
T165 75. 0 67. 5 25. 0
T334 20. 8 13. 3 79. 2
T351 41. 7 23. 3 58. 3
T446 8. 3 6. 3 91. 7
T474 33. 3 24. 2 66. 7
T492 50. 0 39. 2 50. 0
T481 79. 2 70. 8 20. 8
T493 29. 2 19. 2 70. 8
T499 45. 8 23. 3 54. 2
T520 50. 0 43. 3 50. 0
T578 62. 5 49. 2 37. 5
T689 50. 0 25. 0 50. 0
T694 41. 7 30. 8 58. 3
T710 62. 5 45. 8 37. 5
T713 83. 3 68. 3 16. 7
T726 73. 3 79. 2 26. 7
T746 50. 0 40. 8 50. 0
T761 29. 2 25. 0 70. 8
125
　
植物病理学报 43 卷
Continued
Strain number Origin Infection rate (% ) Disease index Control efficiency (% )
T764 75. 0 63. 3 25. 0
T773 41. 7 30. 8 58. 3
T774 54. 2 45. 8 45. 8
T775 87. 5 82. 5 12. 5
T777 33. 3 25. 0 66. 7
T780 91. 7 85. 8 8. 3
T831 8. 3 6. 3 91. 7
T832 33. 3 30. 0 66. 7
T838 25. 0 11. 7 75. 0
T842 75. 0 70. 8 25. 0
T870 29. 2 24. 2 70. 8
T871 87. 5 82. 5 12. 5
T966 12. 5 6. 9 87. 5
Fig. 1　 The colonies of virulent Ralstonia solanacearum FJAT91 (A)
and avirulent mutant (B) on the TTC medium
　 　 通过电镜的菌体细胞形态观察发现,出发菌株
(强致病力青枯雷尔氏菌)的细胞形态宽长比值较
小(0. 50 ~ 0. 60),即菌体形状为长椭圆状或短杆
状(图 2A);突变后菌株(青枯雷尔氏菌无致病力
突变菌株)的细胞形态宽长比值较大 (0. 70 ~
0． 80),即菌体形状为短椭圆形或近圆形(图 2B)。
　 　 对 55 株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株进行
番茄盆栽苗回接生物测定,以致病性青枯雷尔氏菌
FJAT91 为阳性对照,未接菌培养基为阴性对照,结
果表明,接种菌株 FJAT91 的阳性对照处理组在接
种后第 4 d开始发病,至第 10 d 全部发病,发病率
达到 100% ;55 株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株
接种处理及阴性对照处理 15 d 均未发病。 番茄盆
栽苗回接生测结果与 TTC平板菌落形态鉴定结果
相吻合,证实这 55 株青枯雷尔氏菌无致病力突变
菌株均为无致病力菌株。
2. 2 　 青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的防病效
果评价模型
试验结果(表1)表明:自然弱毒株FJAT1458
225
　
　 5 期 郑雪芳,等:青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析
Fig. 2　 Transmission electron microscopic photographs of virulent Ralstonia
solanacearum FJAT91 (A ×10 000) and avirulent mutant (B ×10 000)
防治效果最好,为 100% ;菌株 T7、T140、T446、
T831、T966、FJATCo1968 和 FJATCo1976 防效显
著,分别为 91. 7% 、 91. 7% 、 91. 7% 、 91. 7% 、
87． 5% 、87. 5%和 87. 5% ;菌株 T334、FJAT1971、
FJAT1453、 FJAT1969、 T8、 T838、 FJAT1452、 FJA-
Co1994、T761、 T870 防效较好,分别为 79. 2% 、
79． 2% 、76. 7% 、75. 0% 、75. 0% 、75. 0% 、73. 3% 、
70. 8% 、70. 8% 、70. 8% ;其他菌株防效不理想,均
未达 70% 。
　 　 青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株对番茄青枯
病温室防病效果评价聚类模型:以青枯雷尔氏菌无
致病力突变菌株为样本,以植株的发病率、病情指
数及防效为指标,以欧氏距离为聚类尺度,用类平
均法进行系统聚类,当欧氏距离为 38. 09 时,无致
病力突变菌株可分为 3 类群(图 3),类群Ⅰ包括
T775、T871 和 T780 等 10 株 EZ-Tn5TM插入突变菌
株及对照,其特征是对番茄青枯病的防效差,低于
30% ,植株发病率高达 75%以上,病情指数达 60%
以上;类群Ⅱ包括 FJAT1458、FJATCo1968 和 T966
等 24 株不同途径获得的无致病力突变菌株,其特
征是对番茄青枯病的防效较好,达 70%以上,植株
发病率和病情指数均低于 30% ;第Ⅲ类群包括
FJATCo1970、T2 和 T694 等 21 株60Co 辐射诱变和
EZ-Tn5TM插入突变菌株,其特征是对番茄青枯病
的防效较差,介于 30% ~ 60% ,植株发病率较高,
介于 40% ~ 60% ,病情指数较大,介于 20% ~
70% 。
综上,从番茄田间发病田块分离的自然弱毒株
FJAT1458 对番茄青枯病的防病效果最好,拟对其
定殖特性及其防效做进一步的分析。
2. 3　 青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株 FJAT1458
的定殖特性
(1 ) 青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株
FJAT1458 回收分离与分子鉴定
用青枯雷尔氏菌选择性培养基 TTC从番茄植
株和根系土壤回收分离菌株 FJAT1458,根据青枯
雷尔氏菌无致病力菌株在 TTC平板上表现为菌落
中间红斑大,颜色为暗红色,周围白边窄或无白边,
无流动性的形态特征,初步统计分离到目标菌株的
数量。 进一步利用青枯雷尔氏菌特异检测引物 pe-
hA#6 / pehA#3 PCR 扩增进行验证,结果分离的青
枯雷尔氏菌无致病力菌株同参比菌株 GMI1000 均
在大约 500 bp位置扩增出目的条带(图 4)。
(2)接种浓度对青枯雷尔氏菌无致病力突变
菌株 FJAT1458 定殖特性的影响
菌株 FJAT1458能在番茄根系土壤、根系、茎部
成功定殖,在叶片无定殖。 不同接种浓度的菌株
FJAT1458在番茄植株和根系土壤的定殖数量不同:
接种浓度越大,其在番茄植株体内和根系土壤的定
殖数量越大,接种浓度为 104 CFU / mL 时,菌株
FJAT1458只在番茄植株的根系土壤和根部定殖,在
茎部和叶片无定殖。 菌株 FJAT1458接种后,在番茄
植株和根系土壤定殖数量随时间推移呈现先升后降
的趋势,在根系土壤和根系,定殖数量最大值出现在
接种后第 6 d;在茎部,定殖数量最大值,出现在接种
后第 12 d。 菌株 FJAT1458 在番茄植株根系土壤的
定殖时间为 12 d,接种后第 15 d 分离不到目标菌
株,在番茄植株的根部和茎部的定殖时间均为 18 d,
接种后第 21 d分离不到目标菌株(图 5)。
325
　
植物病理学报 43 卷
Fig. 3　 Cluster model analysis of different Ralstonia solanacearum avirulent mutants
based on their control efficiency against tomato bacterial wilt disease
425
　
　 5 期 郑雪芳,等:青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析
Fig. 4　 Molecular identification of Ralstonia solanacearum avirulent mutants
Lane 1-42 are avirulent Ralstonia solanacearum strains; Lane “ + ” is positive control;
Lane “ - ” is negative control; Lane M is DNA size marker (3 000, 2 000, 1 500, 1 200,
1 031, 900, 800, 700, 600、500, 400, 300, 200 and 100 bp) .
　 　 (3)接种苗龄对青枯雷尔氏菌无致病力突变
菌株 FJAT1458 定殖特性的影响
菌株 FJAT1458 对不同苗龄的番茄盆栽苗接
种,其定殖特性在不同部位和不同接种时间存在一
定的差异。 由图 6 可见,相比接种 5 ~ 6 叶龄的番
茄苗,菌株 FJAT1458 接种 2-3 叶龄的番茄苗,其在
番茄根系土壤、根系和茎部定殖数量较高,特别表
现在接种 12 d(根系土)、6 ~ 12 d(根)和 6 ~ 15 d
(茎部 )。 两种不同苗龄接种处理下, 菌株
FJAT1458 在番茄根系土壤和植株的定殖动态均呈
现先上升后下降的趋势,在土壤的定殖密度最大值
均出现在接种后第 6 d,至 15 d 均无定殖;在根部
的定殖密度最大值也均出现在接种后第 6 d,至 21
d均无定殖;在茎部的定殖密度最大值出现在接种
后第 9 d,至 21 d均无定殖。
2. 4　 青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株 FJAT1458
对番茄青枯病的防效评价
比较分析不同接种浓度的菌株 FJAT1458 对
番茄青枯病的防治效果。 结果表明,对照组在接种
致病性青枯雷尔氏菌 FJAT91 后第 4 d 开始发病,
番茄植株出现萎蔫症状,并随着时间的推移日益严
重,至第 10 d发病率达 100% (图 7)。 分别先接种
104 CFU / mL、 105 CFU / mL、 106 CFU / mL、 107
CFU / mL、108 CFU / mL 的无致病力青枯雷尔氏菌
FJAT1458,再接种致病性青枯雷尔氏菌FJAT91,
525
　
植物病理学报 43 卷
Fig. 5　 Colonization of strain FJAT1458 in the root soil (A), root (B) and stem (C)
of potted tomato seedlings under different inoculation doses
Inoculation dose 1 was 104 CFU / mL; Inoculation dose 2 was 106 CFU / mL;
Inoculation dose 3 was 108 CFU / mL; CK: Potted tomato inoculated with water.
番茄植株分别至第 6、6、7、10 和 15 d 开始发病,比
对照处理分别推迟 2、2、3、6 和 11 d,至第 10 d 发
病率分别为 80% 、80% 、35% 、15%和 0% ,表明菌
株 FJAT1458 的接种浓度越大,番茄青枯病的发病
时间推迟的越长,发病率越低。
　 　 统计对照组发病率达 100% 和病情指数达
100%时各处理组的发病率、病情指数和防效。 接
种致病性青枯雷尔氏菌 FJAT91 后 10 d,对照组的
番茄发病率达 100% ,病情指数为 66,接种浓度为
108 CFU / mL 的番茄发病率为 0% ,防效最高,达
100% ;接种浓度为 107 CFU / mL的番茄发病率、病
情指数和防效分别为 15% 、3 和 85% ;接种浓度为
106 CFU / mL的番茄发病率、病情指数和防效分别
为 35% 、14 和 65% ;接种浓度为 105 CFU / mL 和
104 CFU / mL 的番茄发病率均为 80% ,防效均为
20% ,病情指数分别为 57 和 55。 接种致病性青枯
雷尔氏菌 FJAT91 后 25 d,对照组的番茄发病率、
病情指数均达 100% ,接种浓度为 108 CFU / mL 的
番茄发病率为 40% ,病情指数为 21,防效达 60% ;
接种浓度为 107 CFU / mL的番茄发病率为 85% ,病
情指数为 50,防效为 15% ;接种浓度为 106 CFU /
mL、105 CFU / mL和 104 CFU / mL的番茄发病率均
为 100% (表 2 )。 综上, 不同接种浓度菌株
FJAT1458均能有效减缓番茄青枯病病程发展,接
625
　
　 5 期 郑雪芳,等:青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析
Fig. 6　 Colonization of strain FJAT1458 in the root soil (A), root (B) and stem (C)
of potted tomato seedling under different inoculating stages
种浓度为 108 CFU / mL时,对番茄青枯病的防效最
好,为最佳接种浓度。
2. 5　 青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株 FJAT1458
对番茄青枯病的防效模型
以菌株 FJAT1458 胁迫接种后的不同时间为
“x”变量,以不同接种浓度处理的番茄植株的发病
率为“y”变量,构建菌株 FJAT1458 对番茄青枯病
防病的回归模型(图 8)。 结果表明,不同接种浓度
的菌株 FJAT1458,其对番茄青枯病的防病模型不
同,植株发病率与时间的相关系数(R)随接种浓度
增加而呈现降低的趋势,如菌株 FJAT1458 的接种
浓度为 104 CFU / mL时,番茄植株发病率随时间变
化符合方程 y = 47. 998Ln(x) - 16. 724,相关系数
R2 为 0. 921 6,接种浓度为 108 CFU / mL时,番茄植
株发病率随时间变化符合方程 y = 5. 734 3Ln(x)
-6. 389 6,相关系数 R2 下降至 0. 169 8,下降辐度
为 81. 58% ,而对照组的番茄发病模型符合方程 y
=38. 002Ln(x) +13. 049,相关系数 R2 =0. 867 3。
3　 讨论
许多研究表明[15,18,19],青枯雷尔氏菌存在明显
的致病力分化,强致病力菌株侵染寄主植物导致寄
主发病,弱 /无致病力菌株可侵染寄主植物但不引
起寄主发病。 Liu 等[20]认为致病性青枯雷尔氏菌
引起寄主发病主要是由于其在寄主维管束产生大
量胞外多糖(EPS)阻塞水分运输所致。 也有报道
指出青枯雷尔氏菌的致病过程是众多毒力因子:如
胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)、胞外蛋白等相互
作用的过程[21]。 Cheng 等[17]研究发现,转座子插
入致弱的无致病力突变菌株的胞外多糖含量显著
低于出发菌株。 本研究发现,通过不同方式构建的
青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的菌落和菌体形
态相比出发菌株有明显差异,导致这种差异的原因
725
　
植物病理学报 43 卷
Fig. 7　 Control efficiency of strain FJAT1458 against tomato
bacteria wilt under different inoculation doses
CK + : inoculate virulent Ralstonia solanacearum strain FJAT91 as positive control; a, b, c, d and
e were inoculated with avirulent Ralstonia solanacearum strain FJAT1458 at concentrations of
108CFU / mL, 107CFU / mL, 106、CFU / mL, 105CFU / mL and 104CFU / mL, respectively
是否与 EPS、LPS 等毒力因子形成有关,还有待进
一步的考证。
　 　 青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株可从多个途
径获得[7,10 ~ 12],但各种诱变方法都存在一定的局
限性,如紫外诱变易发生回复突变、化学诱变对人
体有致癌作用、生防菌致弱突变率低等。 为此,本
研究综合利用多种方法来获得青枯雷尔氏菌无致
病力突变菌株,分别通过分离筛选自然弱毒株、
60Co辐射诱变和转座子插入法来构建青枯雷尔氏
菌无致病力突变体库,确保获得突变频率高、变异
范围广的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株,为青枯
病植物疫苗的研发奠定材料基础。 此外,本研究建
立了一套青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株对番茄
青枯病防病效果评价体系,并利用该体系筛选出一
株防 病 效 果 最 好 的 突 变 菌 株 (菌 株 编 号:
FJAT1458)。 相关研究未见报道。
825
　
　 5 期 郑雪芳,等:青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析
Table 2　 Control efficiency of strain FJAT1458 against tomato bacteria
wilt disease under different inoculation doses
Day after inoculation
(d)
Inoculation dose
(CFU / mL)
Infection rate
(% )
Disease
index
Control efficiency
(% )
10 104 80 55 20
105 80 57 20
106 35 14 65
107 15 3 85
108 0 0 100
CK 100 66 -
25 104 100 97 0
105 100 97 0
106 100 76 0
107 85 50 15
108 40 21 60
CK 100 100 -
Fig. 8　 Control model of strain FJAT1458 against tomato bacterial
wilt disease under different inoculation doses
925
　
植物病理学报 43 卷
　 　 病原弱株系对作物病害的免疫抗病机制,主要
是营养和生态位点的竞争效应[22,23]。 因此,利用
病原菌的弱株系来预防作物病害,要求弱株系的生
活力强,能在植株根系土壤和体内定殖。 本文研究
了接种浓度和接种苗龄对青枯雷尔氏菌无致病力
突变菌株在番茄植株体内定殖能力的影响,结果发
现,不同接种浓度、不同苗龄接种的青枯雷尔氏菌
无致病力突变菌株 FJAT1458 均能在番茄根系土
壤、根系、茎部定殖,但在叶片无定殖,此结果与 Li
等[24]研究内生枯草芽孢杆菌 B4 菌株入侵番茄的
途径及其定殖部位取得的结果相一致,他们研究发
现植物茎部不能很好地将生防菌传输到叶,在茎部
的定殖力不强,在叶片无定殖。 Wu 等[25]研究发
现,生防菌在植株体内定殖呈现“先升后降”趋势,
本研究同样发现菌株 FJAT1458 在番茄根系土壤
和植株体内消长动态均为“先升后降”趋势,且定
殖时间最长不超过 20 d,这一方面说明菌株
FJAT1458 在番茄植株体内侵染、扩散、蔓延需要一
个时间过程,另一方面可能是由于菌株 FJAT1458
在植株体内与植株内生菌群竞争营养和空间所致,
这有待今后进一步试验证明。
不同于化学农药和生防菌对番茄青枯病的防
治作用,青枯雷尔氏菌无致病力菌株对番茄青枯病
主要在于预防作用,错过接种适期,就不能起到很
好的预防效果,因此,掌握好最适接种时期和最佳
接种量很关键[26]。 Ren 等[27]在研究生防菌铜绿
假单胞菌 ZJ1999 在水稻上的定殖时,发现随着生
防菌接种浓度增加,其在水稻植株上的定殖时间延
长,抑制病原菌侵染的活力增强。 本研究同样发现
菌株 FJAT1458 预接种浓度越大,其在番茄植株定
殖能力越强,番茄植株发病率越低。 此外,接种苗
龄对菌株 FJAT1458 在番茄根系土壤和体内的定
殖能力产生一定的影响,其在番茄种苗 2 ~ 3 叶期
接种比在 5 ~ 6 叶期接种,定殖能力更强,这可能是
因为随着植株生长,植株的抗性增强,抵御外源微
生物侵染的能力增强,从而阻碍外源微生物在其体
内定殖。
病原弱株系在番茄植株上的定殖能力是其与
植株、环境相互作用的结果。 就菌株而言,涉及菌
株的使用浓度及菌株本身的定殖能力。 就寄主而
言,涉及菌株在番茄植株的定殖部位及番茄品种。
环境对菌株定殖能力会产生巨大影响,温度、湿度、
光照强度等环境因子差异影响菌株的生长繁殖,进
而影响菌株的定殖能力。 这些影响因素,在实际应
用中应加以考虑。 病原弱株系应在植物生长发育
的关键时期或当植物处于敏感的阶段施用,以期有
效激发植物防御病害的能力,充分发挥其免疫抗病
作用。
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责任编辑:张宗英
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