全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Apr． 2015，35(2):156 － 160 http:/ / journal． gxzw． gxib． cn
DOI:10． 11931 /guihaia． gxzw201403040
聂传朋，李尚擘，刘瑞姣，等． 十字花科多肽激素类基因 ＲALF的同源基因克隆及进化分析［J］． 广西植物，2015，35(2):156 －160
Nie CP，Li SB，Liu ＲJ，et al． Cloning and evolutionary analysis of homologous sequences of ＲALF in Cruciferae［J］． Guihaia，2015，35(2):156 －160
十字花科多肽激素类基因 ＲALF的
同源基因克隆及进化分析
聂传朋1，李尚擘1，2，刘瑞姣1，2，李焰焰1*
(1． 阜阳师范学院 生物与食品工程学院，阜阳 236041;2． 安徽大学 生命科学学院，合肥 230601 )
摘 要:多肽激素类基因是对植物生长发育起重要作用的一类基因，ＲALF是其中的重要一员，而十字花科在
中国蔬菜作物中是重要的一大类群。为了摸清十字花科多种蔬菜作物的 ＲALF 同源基因信息，该文根据前期
研究从油菜中扩增到的多肽激素类基因 ＲALFbn的序列设计引物，从提取的十字花科芸薹属、萝卜属、蔊菜属、
山芥属的 7 份重要蔬菜作物的基因组 DNA 中分别克隆到了 ＲALF 的同源序列。结果表明:7 种蔬菜作物的
ＲALF同源基因编码区均在 300 bp左右，且无内含子，编码的蛋白质由 79个氨基酸组成，说明 ＲALF在十字花
科 4 个属内的保守性较强;对 ＲALF同源基因在十字花科 4个属中的表达分析表明，该类基因在根、茎、叶、花
序轴等营养器官中不表达或弱表达，但主要在生殖器官中表达，其中在总花蕾和开放花中的表达量普遍高于
嫩角果中的表达量，表明该类基因在十字花科中的生理活跃期是花发育时期。同时，构建了十字花科 4 个属
中 ＲALF同源基因的系统树，芸薹属的油菜、甘蓝和芥蓝形成一个分支，而茎瘤芥和分蘖芥形成另外一个分
支，且与萝卜属、山芥属、蔊菜属的材料聚在一支，该基因的进化途径在一定程度上也反映出这几种作物的遗
传背景关系。该研究结果丰富了 ＲALF家族信息，增添了十字花科植物的分子进化数据。
关键词:十字花科;多肽激素类基因;ＲALF;同源基因;进化分析
中图分类号:Q941;Q943． 2 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2015)02-0156-05
Cloning and evolutionary analysis of homologous
sequences of ＲALF in Cruciferae
NIE Chuan-Peng1，LI Shang-Bo1，2，LIU Ｒui-Jiao1，2，LI Yan-Yan1*
(1． School of Biological and Food Engineering，Fuyang Teachers College，Fuyang 236041，China;
2． College of Life Sciences，Anhui University，Hefei 230601，China )
Abstract:Peptide hormones genes are important in plant growth and development and ＲALF (rapid alkalinization fac-
tor)is one of them． Cruciferae is a big family in Chinese vegetable crops． Polypeptide hormone gene ＲALFbn was cloned
from Brassica campestris (rape)in the authors’previous work． In order to find out the information of ＲALF homologous
genes in Cruciferae vegetable crops，this experiment was done． At this time，the primers were designed according to the
sequence of ＲALFbn gene． The genomic DNAs of 7 important vegetable crops were extracted in advance． The vegetable
materials were selected from Brassica，Ｒaphanus，Ｒorippa and Barbarea and they all belonged to the same family of Cru-
ciferae． Seven sequences homologous to ＲALF were cloned from the 7 materials from important vegetable crops with the
primers designed from ＲALFbn． Then the 7 DNA sequences together with the ＲALFbn gene were analyzed． The results
showed that all the DNA sequences’open reading frames were about 300 bp long． There was no intron in the 7 genes．
收稿日期:2014-06-24 修回日期:2014-09-10
基金项目:国家自然科学基金(31000132);国家大学生创新创业训练计划项目(201310371015)。
作者简介:聂传朋(1974-)，男，安徽长丰人，博士，副教授，研究方向为生态学及分子系统学，(E-mail)fuyangshy@ 126． com。
* 通讯作者:李焰焰，博士，教授，研究方向为植物分子生物学，(E-mail)li_yanyan126@ 126． com。
The 7 proteins encoded by them were all made by 73 amino acids． All these indicated that the ＲALF homologous genes
were very conservative in the 4 genera of cruciferous species． At the same time，the 7 ＲALF homologous genes expression
analyses were done in four genera in Cruciferae． The result indicated that these genes were not or weakly expressed in
root，stem，leaf，inflorescence axis and other vegetative organs，while mainly expressed in reproductive organs，in which，
the total amounts of the expression in flower buds and open flowers were generally higher than those in tender siliques．
All the expression indicated that the physiological active period of these genes in Cruciferae was in the flower growth pe-
riod． The system tree was constructed with the 7 ＲALF homologous genes in the 4 genera of Cruciferae． The NJ tree of
ＲALF homologous genes reflected that ＲALFbn，BoＲALFjx and BoＲALFzh formed a branch while BjＲALFdn4 and
BjＲALFxlh formed another branch with the rest ＲALF homologous genes from Ｒaphanus，Ｒorippa，Barbarea clustered in
the same branch． The evolutionary pathway of these ＲALF homologous genes in a certain extent also reflected the genetic
background relationships between these crops． In all，this study enriched the information of the rapid alkalinization factor
(ＲALF)family and expanded the knowledge of the molecular evolution data of Cruciferae．
Key words:Cruciferae;polypeptide hormone gene;ＲALF;homologous gene;evolutionary analysis
植物多肽激素是一类非常重要的植物激素，与
其它小分子激素一样，调控植物的生长发育过程
(Lucrezia et al．，2012;Ｒicchiuto et al．，2011)。肽类
激素在动物、细菌和真菌中发现较早，而植物肽类激
素发现的较晚。1991 年系统素的首次报道后，又陆
续发现了多种植物肽类生长调节因子(Loivamki et
al．，2010;Kouchi et al．，1999)，快速碱化因子(rapid
alkalinization factor，ＲALF)是其中的一种(Pearce et
al．，2001;Germain et al．，2005)。它在植物中广泛
存在，使植物组织生长的培养基碱化、抑制胚根生
长、调控植物花器官发育等(Haruta et al．，2003;Ols-
en et al．，2002;李焰焰等，2009)。
李焰焰等(2008，2010)的研究小组发现，在十
字花科芸薹属中 ＲALF 与小孢子发育相关。因此，
本文研究了从十字花科 4 个属中克隆到的 ＲALF 同
源基因，并分析了基因的核苷酸、氨基酸以及进化特
征，推测其参与植物花器官发育的调控，为深入发掘
此类 ＲALF的基因功能提供研究基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
7 种材料均由浙江大学蔬菜研究所提供，包括
芸薹属的 4 种植物和萝卜属、蔊菜属、山芥属各 1 种
植物(表 1)。材料播于培养室内并进行常规管理，
苗龄 45 d时，随机选取 5 株植株的嫩叶，用 75%的
酒精擦净叶片表面的灰尘，用锡箔纸包好，立即放进
取样液氮瓶中带回实验室进行 DNA提取。
1． 2 DNA提取及同源基因克隆
DNA提取用 CTAB法。根据我们先前在油菜中
表 1 所用的植物材料
Table 1 Materials in the experiment
属
Genus 种 Species
品种
Cultivar
基因名称
Gene
name
芸薹属
Brassica L．
茎瘤芥 B． juncea
var． tumida
分蘖芥 B． juncea
var． multiceps
甘蓝 B． oleracea
var． capitata
芥蓝 B． oleracea
var． alboglabra
桐农 4号
Tongnong 4
雪里蕻
Xuelihong
鸡心
Jixin
中花
Zhonghua
BjＲALFdn4
BjＲALFxlh
BoＲALFjx
BoＲALFzh
萝卜属
Ｒaphanus 萝卜 Ｒ． sativus
圆白
Yuanbai ＲsＲALF
蔊菜属
Ｒorippa Scop． 高蔊菜 Ｒ． indica － ＲiＲALF
山芥属
Barbarea
Ｒ． Br．
欧洲山芥 B． vulgaris － BvＲALF
扩增到的多肽激素类基因 ＲALFbn(GenBank 登陆
号:KC149515)的 DNA 序列，设计上下游引物 P1:
5-CGTATGGGGGATGTCTGAAAGT-3、P2:5-GTA-
AAATTAACCAAGGGTGGTG-3，两者所含区域包括
起始密码子和终止密码子。以 P1 和 P2 为引物，在
以上 7 种实验材料中扩增 ＲALF 的同源基因。PCＲ
反应加入 DNA 模板(20 ng·μL-1)1 μL，dNTP(10
μmol·L-1)0． 5 μL，10 × PCＲ反应缓冲液 2． 5 μL，上
下游引物(10 μmol·L-1)各 0． 5 μL，Taq 酶(5 U·
μL-1)0． 5 μL。PCＲ反应条件设定为在 94 ℃条件下
预变性 2 min后;开始循环:94 ℃变性 30 s，退火温
度 56 ℃保持 30 s，72 ℃延伸 2 min，72 ℃延伸 2
min，循环 30 次，72 ℃延伸 10 min。电泳检测采用
1． 0%的琼脂糖凝胶，用北京道普生物技术有限公司
的 DNA凝胶回收试剂盒回收，在 4 ℃低温下用 T4
连接酶连接过夜，然后把连接产物转入 DH5α 大肠
杆菌菌株中。并对菌落质粒进行 EcoＲI单酶切鉴定
7512 期 聂传朋等:十字花科多肽激素类基因 ＲALF的同源基因克隆及进化分析
和 PCＲ鉴定，符合条件的菌样送到上海生工生物工
程公司测序。
1． 3 ＲALF同源基因的序列分析
对 8 种物种中得到的 ＲALF 同源基因的最大开
放阅读框(OＲF)用 DNAStar 软件分析，并用 DNAs-
sist 2． 2 软件推测其氨基酸序列，用 MegAlign 软件
分析其在基因水平以及蛋白质水平上的差异程度，
用 ClustalX软件对 8 种同源基因预测蛋白的氨基酸
序列进行比对(Nie et al．，2013)。
1． 4 ＲALF同源基因的进化分析
据 Kimura双参数模型用 MEGA 4． 1 软件进行
遗传距离分析，用 MEGA 4． 1 分别绘制 NJ、ME 和
MP系统进化树，树中节点的置信水平用自举值
(Bootstrap)估算，共 1 000次循环(Nie et al．，2012)。
1． 5 ＲALF同源基因的表达分析
考察 ＲALF同源基因在十字花科四个属中的表
达情况。选取芸薹属的“中花”芥蓝(BoＲALFzh)、萝
卜属的“圆白”萝卜(ＲsＲALF)、蔊菜属的“高蔊菜”
(ＲiＲALF)、山芥属的“欧洲山芥”(BvＲALF)等四种
植物，分别取其根、茎、叶、花序轴、总花蕾、开放的
花、嫩角果等 7 种组织，分别提取 ＲNA(按 Life Tech-
nologies公司 TＲIzoL的说明书进行操作)，并反转
录成 cDNA，(cDNA 第一链和第二链的合成参照
SMAＲTer PCＲ cDNA Synthesis Kit 说明书方法进
行)。以 ＲT-PCＲ用之前得到的双链 cDNA为模板，
引物 P1、P2 进行 PCＲ，体系为(10 ng·μL-1)cDNA
模板 1 μL，引物 P1、P2(20 μmol·L-1)各 2 μL，Taq
酶 Buffer(10 ×)5 μL，Mg2 +(25 mmol·L-1)4 μL，
dNTPs(10 mmol·L-1)1 μL，Taq 酶(5 U·μL-1)0． 5
μL，加 ddH2O 至 50 μL。PCＲ 反应条件:预变性 94
℃，2 min;变性 94 ℃，30 s;56 ℃退火 30 s;72 ℃延
伸 1 min，循环 30 次;72 ℃延伸 10 min。内参对照
选用 β-actin，其引物为 pActin1 和 pActin2，序列分别
为 5-TCGGAATGGGCCAGAAGGAC-3 和 5-TC-
CACGTC-GCACTTCATGATG-3。
2 结果与分析
2． 1 克隆 ＲALF同源基因
分别提取十字花科芸薹属的 4 种植物和萝卜
属、蔊菜属、山芥属各 1 种植物的基因组 DNA，用引
物 P1、P2 对 7 份 DNA 分别进行 PCＲ 扩增，克隆
ＲALF 的同源基因。在 7 个物种中的扩增条带均在
300 bp左右(图 1)。回收扩增产物，连接到 T-easy
载体，然后转化到大肠杆菌 DH5a 中，蓝白斑筛选
后，随机挑出白斑，再分别进行菌液 PCＲ 和 EcoＲI
酶切鉴定，确定无误后测序，各条序列的测序结果经
分析表明 DNA 编码区的序列长度在 300 bp 左右，
均包含起始和终止密码子。
图 1 ＲALF同源基因片段的扩增结果 1-7． 分别为桐
农 4 号茎瘤芥、雪里蕻分蘖芥、鸡心甘蓝、中花芥蓝、圆白萝卜、
蔊菜属的高蔊菜和山芥属的欧洲山芥;8． 3 kb DNA 标准分子
质量。
Fig． 1 Amplification of the homologous ＲALF gene
1-7． Ｒepresent B． juncea cv． Dongnong 4，B． juncea cv． Xueli-
hong，B． oleracea cv． Jixin，B． oleracea cv． Zhonghua，Ｒ． sativus
cv． Yuanbai，Ｒ． indica Hiern and Barbarea vulgaris，respectively;
8． 3 kb DNA ladder．
2． 2 ＲALF同源基因的序列特征分析
对十字花科 4 个属 7 个物种的 ＲALF 同源基因
编码氨基酸的分析发现，氨基酸序列变化不大，氨基
酸组成频率相似。疏水性氨基酸含量最高，约占总
蛋白质含量的 30%;酸性氨基酸含量为 10%，碱性
氨基酸含量略高，达 11． 4%;芳香族氨基酸含量 5%
左右。通过网上软件分析，分别得到 7 个物种的
ＲALF 预测蛋白，加上油菜中的 ＲALF 同源基因
ＲALFbn(图 2)，一共有 8 个 ＲALF 同源蛋白，分析
结果发现 8 个蛋白都具有快速碱化因子蛋白的 5 大
特征:1 个保守的“YIXY”区和 4 个保守的半胱氨酸
残基。同时，在网上用 blast分别对 7 个蛋白序列进
行比对，结果证明均属于 ＲALF 家族蛋白(图 3)。
通常认为，当不同物种中的两个同源蛋白在 80 个氨
基酸的区域中相似性达到 25%，则它们很有可能具
有相同的功能(李焰焰等，2011)。我们发现 ＲALF
与小孢子发育过程密切相关(李焰焰等，2008)。据
此可推定十字花科的这 8 种 ＲALF 同源基因在花粉
发育过程中的功能。
用 8 个物种 ＲALF同源基因的核苷酸序列做了
进化分析。分别用 NJ、ME 和 MP 法分别构建了
851 广 西 植 物 35 卷
图 2 对 8 种十字花科植物 ＲALF同源基因编码蛋白的氨基酸序列比对 框内是保守的“YINY”区和四个半胱氨酸。
Fig． 2 Alignment of the amino acid from ＲALF homologous gene Conserved“YINY”motifs and 4 cysteines are showed in frames．
图 3 对 ＲALF编码蛋白 Blast的结果 8 个氨基酸序列的结果均显示是“ＲALF superfamily”，图中仅展示其中的 1 个。
Fig． 3 Blast result of ＲALF protein Blast results of 8 ＲALF proteins are the same“ＲALF superfamily”，only one is showed．
ＲALF同源基因的系统树，3 种系统树一致性较高，
由于在对亲缘关系相近群体的研究中，NJ 法(无根
网状树，并能给出分支长度)的应用更为普遍。并
且研究中的 8 个材料来自同一科内的四个属，属于
亲缘关系相近群体，因此，以 NJ树进行分析(图 4)。
从图 4 看出，在十字花科的 4 个属中，ＲALF 同
源基因的分子进化可初步分为三大类群。萝卜属、
蔊菜属、山芥属的材料形成一个分支;芸薹属的桐农
4 号茎瘤芥和雪里蕻分蘖芥聚成一个分支;油菜
ＲALFbn和鸡心甘蓝以及中花芥蓝聚在一起，这与氨
基酸的分析结果一致，说明油菜的 ＲALFbn 很可能
来源于甘蓝型油菜的种子资源。
2． 3 ＲALF同源基因的表达分析
以芸薹属“中花”芥蓝、萝卜属的“圆白”萝卜、
蔊菜属的“高蔊菜”、山芥属的“欧洲山芥”四种植物
的根、茎、叶、花序轴、总花蕾、开放的花、嫩角果等组
织的双链 cDNA为模板，内参对照选用 β-actin，用引
物 P1、P2 进行 ＲT-PCＲ表达分析(图 5)。对十字花
科 4 个属中 ＲALF 同源基因的表达分析发现，ＲALF
类基因在十字花科 4 个属的根、茎、叶、花序轴等营
养器官中不表达或有弱的表达，比如在高蔊菜
(ＲiＲALF)的根中和欧洲山芥(BvＲALF)的花序轴中
出现微弱的表达条带;在生殖器官中检测到不同程
图 4 8种十字花科植物 ＲALF 同源基因的 NJ 树 用
MEGA4． 1做出，数字为自举检验置信值(1 000个复制序列)。
Fig． 4 NJ tree of 8 homologous ＲALF sequences Made by
MEGA4． 1，numbers on the tree represent confidence values from boot-
strap test (1 000 replicates)．
度的表达，其中，在总花蕾和开放的花中的表达量普
遍高于嫩角果中的表达量。
3 讨论与结论
在对十字花科植物花粉发育相关基因的研究
中，本实验室报道了多肽激素类基因 ＲALF，我们先
前的研究表明该类基因与小孢子发育密切相关，在
植物花粉发育过程中的具有重要的调控功能(李焰
焰等，2008;2010)。本文根据油菜 ＲALFbn 的 DNA
编码区序列特征，进行同源基因扩增引物设计，并从
9512 期 聂传朋等:十字花科多肽激素类基因 ＲALF的同源基因克隆及进化分析
图 5 ＲALF 同源基因在十字花科四属中的表达 Ｒ、
S、L、Ｒa、B、F、Si分别指根、茎、叶、花序轴、总花蕾、开放的花、嫩
角果;Actin为内参对照。
Fig． 5 Expression patterns of homologous ＲALF in four
genera of Cruciferae Ｒ，S，L，Ｒa，B，F，Si indicated roots，stems，
leaves，rachis，the total buds，open flowers and siliques respectively;
β-actin was internal control．
十字花科四个属的 7 个物种中成功克隆到其同源序
列，说明 ＲALF 在十字花科中广泛存在。对其氨基
酸和核苷酸序列进行的分析表明 ＲALF 同源基因的
保守性很高，根据对同源基因的普遍认识，当同源蛋
白的氨基酸序列相似性极高时，则它们极有可能在
不同物种中执行相同功能，据此可以推测 ＲALF 同
源基因具有类似的功能。
ＲALF同源基因在十字花科 4 个属中的表达分
析表明该类基因主要在生殖器官中表达，而在营养
器官中不表达或弱表达。这些同源基因的获得，丰
富了 ＲALF家族信息，为明晰该类基因在十字花科
植物花粉发育中作用机制提供研究基础。同时，对
ＲALF同源基因的进化分析丰富了十字花科植物的
分子进化数据。
参考文献:
Germain H，Chevalier E，Caron S，et al． 2005． Characterization of
five ＲALF-like genes from Solanum chacoense provides support
for a developmental role in plants［J］． Planta，220(3):447
－454
Haruta M，Constabel CP． 2003． Ｒapid alkalinization factors in Pop-
lar cell cultures，peptide isolation，cDNA cloning and differential
expression in leaves and methyl Jasmonate-treated cells［J］．
Plant Physiol，131(2):814 －823
Kouchi H，Takane K，So ＲB，et al． 1999． Ｒice ENOD40:isolation
and expression analysis in rice and transgenic soybean root nod-
ules［J］． Plant J，18(2):121 －129
Li YY(李焰焰)，Cao JS(曹家树)． 2010． Isolation and Molecular
Characterization of ＲALF-Like Gene BcＲALF from Brassica
campestris ssp． chinensis var． parachinensis(快速碱化因子基因
BcＲALF在菜心中的克隆及序列分析)［J］． Acta Bot Yunnan
(云南植物研究)，32(2):147 －150
Li YY(李焰焰)，Cao JS(曹家树)． 2008． Molecular Characteriza-
tion and expression pattern of ＲALF-Like Gene BcMF14p from
Brassica campestris var． purpurea(紫菜薹快速碱化因子基因
BcMF14p的克隆、表达及序列分析)［J］． J Nucl Agric Sci(核
农学报)，22(1):41 －44
Li YY(李焰焰)，Nie CP(聂传朋)． 2009． The process of the re-
search on plant rapid alkalization factor in Solanaceae(快速碱化
因子类基因在茄科植物中的研究进展)［J］． Acta Bot Yunnan
(云南植物研究)，31(2):157 －162
Li YY(李焰焰)，Nie CP(聂传朋)，Cao JS(曹家树)． 2011． Clo-
ning and evolutionary analysis of homologous sequences of Bc-
MF13 gene in Cruciferous vegetables(十字花科蔬菜 BcMF13同
源基因的克隆及进化分析)［J］． Chin J Appl Environ Biol (应
用与环境生物学报)，17(2):207 －210
Loivamki M，Stührwohldt N，Deeken Ｒ，et al． 2010． A role for PSK
signaling in wounding and microbial interactions in Arabidopsis
［J］． Physiol Plant，139(4):348 －357
Lucrezia DD，Slanzi D，Poli I，et al． 2012． Do natural proteins differ
from random sequences polypeptides?Natural vs． random pro-
teins classification using an evolutionary neural network［J］．
PloS One，7(5):1 －10
Nie CP，Li YY，Zhao J，et al． 2012． Extremely high major histo-
compatibility complex class IIb gene intron 2 variation and popu-
lation structure in Chinese alligator［J］． J Genetics，91:e86 － e91
Nie CP，Zhao J，Li YY，et al． 2013． Diversity and selection of MHC
class IIb gene exon3 in Chinese alligator［J］． Mol Biol Ｒep，40:
295 －301
Olsen AN，Mundy J，Skriver K． 2002． Peptomics，identification of
novel cationic Arabidopsis peptides with conserved sequence mo-
tifs［J］． In Silico Biol，2(4):177 －180
Pearce G，Moura DS，Stratmann J，et al． 2001． ＲALF，a 5-kDa u-
biquitous polypeptide in plants，arrests root growth and develop-
ment［J］． Proc Natl Acad Sci USA，98(22):12 843 －12 847
Ｒicchiuto P，Brukhno AV，Paci E，et al． 2011． Conformation state
diagram of polypeptides:A chain length induced α-β transition
［J］． J Chem Phys，135(6):135 －139
061 广 西 植 物 35 卷