全 文 ：基因组学与应用生物学，2013年，第 32卷，第 4期，第 440-448页
Genomics and Applied Biology, 2013, Vol.32, No.4, 440-448
研究报告
Research Report
大肠杆菌全局调控蛋白 CsrA中抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性
所必需的氨基酸残基的鉴定
唐东阶 1,2 钟婉莹 2 秦春铃 2 唐纪良 1,2 晁耐霞 3*
1亚热带农业生物资源保护利用国家重点实验室,南宁, 530005; 2广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530005; 3广西医科大学基础医学院,
南宁, 530021
*通讯作者, hurry211625@163.com
摘 要 CsrA/RsmA蛋白家族是细菌中一类重要的转录后全局调控因子，它们调控细菌的碳代谢、次生代谢、
运动、生物被膜形成以及致病等过程。CsrA/RsmA蛋白家族通常由 60~72个氨基酸基组成，其中第 1至第 52位
氨基酸高度保守，而第 53位以后的氨基酸则高度可变。目前人们认为其氨基酸高度保守性是不同种属细菌
CsrA/RsmA功能和作用机理相似的基础，但是其高度可变区与不同种属 CsrA/RsmA蛋白功能差异的关系尚
不清楚。我们之前的研究显示，大肠杆菌(Escherichia coli)的 CsrA (CsrAE. coli)蛋白的高度可变区(第 53至第 61位
氨基酸残基)具有强烈的抑制十字花科黒腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,简称 Xcc)胞外蛋
白酶活性的能力。本研究中，我们采用丙氨酸置换方法，确定了 CsrAE. coli可变区中抑制 Xcc胞外蛋白酶活性必
需的氨基酸残基。结果显示，CsrAE. coli蛋白的第 54位赖氨酸(K54)、第 60位丝氨酸(S60)和第 61位酪氨酸(Y61)
置换成丙氨酸后，CsrAE. coli蛋白丧失了抑制 Xcc胞外蛋白酶活性的能力；而其它位点的丙氨酸置换不影响其抑
制 Xcc胞外蛋白酶活性的能力。这个结果证明 K54、S60和 Y61是 CsrAE. coli抑制 Xcc胞外蛋白酶活性所必需
的，为揭示大肠杆菌的 CsrA E. coli蛋白抑制 Xcc胞外蛋白酶活性的分子机理奠定基础。
关键词 十字花科黒腐病菌,胞外蛋白酶,大肠杆菌, CsrA,丙氨酸置换
Identification of the Amino Acid Residue Essential for Inhibition of the Extra-
cellular Protease Activity of Xanthomonas campestris pathovar campestris in
the Global Regulator CsrA of Escherichia coli
Tang Dongjie 1,2 Zhong Wanying 2 Qin Chunling2 Tang Jiliang1,2 Chao Naixia 3*
1 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Nanning, 530005; 2 College of Life Science and Technol-
ogy, Guangxi University, Nanning, 530005; 3 School of Preclinical Medicine, Guangxi Medical University, Nanning, 530021
* Corresponding author, hurry211625@163.com
DOI: 10.3969/gab.032.000440
Abstract Members of CsrA/RsmA family of proteins are important global regulators in bacteria, and they control
carbon metabolism, secondary metabolism, motility, biofilm formation and pathogenesis at post-transcriptional lev-
el. CsrA/RsmA proteins are usually composed of 60~72 amino acids. The amino acids from 1st to 52nd are highly
conserved while those after 52nd are highly variable. It has been known that the highly conservation in amino acid se-
quences of CsrAs/RsmAs are the basis for their similarity in biological functions and regulatory mechanisms. How-
ever, the function of the variable region remains unclear. In our previous study, we found that the variable region
(from 53rd to 61st amino acids) of Escherichia coli CsrAE. coli has the ability to inhibit the extracellular protease activity
of Xanthomonas campestris pathovar campestris (Xcc). In this study, the amino acid residue essential for inhibition
of the extracellular protease activity of Xanthomonas campestris pathovar campestris was determined by using ala-
nine substitution analysis. Our results show that K54→A, S60→A and Y61→A substitutions abrogated of the abili-
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31071141)资助
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
ty of CsrAE. coli inhibiting the extracellular protease activity of Xcc, indicating that K54, S60 and Y61 are essential for
CsrAE. coli to inhibit the extracellular protease activity of Xcc. Our study provide useful information for understanding
the molecular mechanism of CsrAE. coli inhibiting the extracellular protease activity of Xcc.
Keywords Xanthomonas campestris pathovar campestris, Extracellular protease activity, Escherichia coli, CsrA,
Alanine scanning
CsrA/RsmA蛋白家族是细菌中一类重要的全局
调控因子，它们在转录后水平调控细菌的碳代谢、次
生代谢、运动、生物被膜形成以及致病等过程(Tim-
mermans and van Melderen, 2010)。1993年，CsrA首
先在大肠杆菌(Escherichia coli)中发现，由于该基因
的突变导致大肠杆菌碳代谢途径发生显著变化(如糖
元积累增加而糖异生减弱等)，因此被命名为碳存储
调控子(carbon storage regulator)，简称 CsrA (Romeo et
al., 1993)。1995年，Chatterjee等(1995)在胡萝卜软腐
欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp. carotovora)中发现
一个基因突变后导致该菌不再产生一个可以感受细
胞密度的信号分子——高丝氨酸内酯，此外还导致
该菌的次生代谢发生显著变化(如胞外酶的过量产
生)，因此该基因编码的产物被命名为次生代谢抑制子
(repressor of secondarymetabolism)，简称 RsmA。此后，
人们在越来越多的细菌中发现了 CsrA/RsmA 的同
源蛋白，统称为 CsrA/RsmA家族蛋白(Timmermans
and van Melderen, 2010)。
基因组测序和基因注释结果显示，csrA/rsmA的
同源基因广泛存在于革兰氏阴性细菌和部分革兰氏
阳性细菌中。csrA/rsmA编码的产物，CsrA/RsmA蛋
白，一般由 60~72个氨基酸基组成，而且序列非常保守
(Immermans and vanMelderen, 2010; Chao et al., 2008)。
序列对比结果显示，亲缘关系较近的细菌种属之间
的 CsrA/RsmA蛋白的氨基酸序列差异很小；而亲缘
关系较远的细菌种属之间的 CsrA/RsmA 蛋白通常
是第 1至第 52位氨基酸高度保守(大于 90%的一致
性)，第 52 位以后的氨基酸则高度可变(Chao et al.,
2008; Timmermans and van Melderen, 2010; Heroven
et al., 2012)。
和氨基酸序列的高度保守性相一致的是，
CsrA/RsmA蛋白家族成员的生物学功能和作用机理
也非常相似。在功能方面，各种细菌的 CsrA/RsmA
通常都参与了细胞碳代谢、次生代谢、运动性和生物被
膜形成的调控(Timmermans and van Melderen, 2010)。
此外，几乎所有的动植物病原菌的 CsrA/RsmA都在致
病过程中发挥了非常重要的调控作用(Timmermans
and vanMelderen, 2010; Heroven et al., 2012)。在调控
机理方面，各种细菌的 CsrA/RsmA均通过和 CsrB、
CsrC (或 RsmB, RsmC)等非编码 RNA组成一个Csr/
Rsm的转录后调控系统来实现对相关的生理过程的调
控(Timmermans and vanMelderen, 2010; Heroven et al.,
2012)。研究表明，不同细菌的 Csr/Rsm转录后调控系
统的调控机理非常相似：CsrA/RsmA蛋白通过和目的
mRNA的结合而抑制目的 mRNA的翻译或 /和稳定
性，从而影响目的基因的表达；Csr/Rsm调控系统中的
小 RNA则通过与 CsrA/RsmA蛋白的结合抑制其与
mRNA结合活性(Timmermans and vanMelderen, 2010;
Herovenet al., 2012)。研究发现，铜绿假单胞菌(Pseu-
domona aeruginosa)的 RsmA和空肠弯曲菌(Campylo-
bacter jejuni) 的 CsrA均能互补大肠杆菌的 csrA突变
体(Pessi et al., 2001; Fields and Thompson, 2012)；而
大肠杆菌的CsrA又能够互补十字花科黑腐病菌(Xan－
thomonas campestris pathovar campestris,简称 Xcc) rs-
mA突变体(黄明慧等, 2012)。这些结果证明，即便是
来自亲缘关系很远的 CsrA/RsmA蛋白，例如大肠杆
菌的 CsrA和 Xcc的 RsmA，也都具有相似的功能和
调控机理。
然而，目前人们只关注 CsrA/RsmA蛋白在序列
上的高度保守性以及在功能和作用机理上的相似
性，而忽略了来自亲缘关系较远的细菌的 CsrA/Rs-
mA的 C末端(通常是第 52位以后的氨基酸)并不保
守，是一个高度可变区的事实。其实，高度可变区的
存在可能意味着来自亲缘关系较远的细菌的 CsrA/
RsmA存在功能和作用机理上的差异。确实，在之前
的研究中，我们发现大肠杆菌 CsrA的 C末端的可变
区(第 53~61位氨基酸残基)具有抑制 Xcc胞外蛋白
酶活性的功能(黄明慧等, 2012)。本研究中，我们通过
丙氨酸置换，确定了这 9个氨基酸残基中抑制 Xcc
胞外蛋白酶活性必需的残基。我们的结果为深入研
究大肠杆菌的 CsrA (CsrAE. coli)蛋白抑制 Xcc 胞外蛋
白酶活性的分子机理提供了有价值的数据。
1结果与分析
1.1 CsrAE. coli 中具有抑制 Xcc 胞外蛋白酶活性功能
的区段是一个柔性区
我们之前的研究发现，rsmAXcc的缺失导致 Xcc
在寄主上的致病力以及在非寄主上引发 HR反应的
441
大肠杆菌全局调控蛋白 CsrA中抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性所必需的氨基酸残基的鉴定
Identification of the Amino Acid Residue Essential for Inhibition of the Extracellular Protease Activity
能力的丧失，游动能力丧失，以及胞外多糖产量和胞
外纤维素酶和淀粉酶的活性的下降；而当在 rsmAXcc
的缺失突变体中导入一个表达 Xcc自身的 RsmA蛋
白(RsmAXcc)的质粒后，这些变化的表型能够得到恢复
(Chao et al., 2008)。有意思的是，在 rsmAXcc的缺失突
变体中导入一个表达大肠杆菌 CsrA蛋白(CsrAE. coli)的
质粒后，rsmAXcc的表型也能够得到恢复野生型的水
平，说明 RsmAXcc和 CsrAE. coli具有相似的功能和作用
机理(黄明慧等, 2012)。更有意思的是，在 rsmAXcc的缺
失突变体中导入一个表达大肠杆菌的 CsrA蛋白的质
粒后，除了突变体的表型得到恢复外，rsmAXcc缺失突变
体的胞外蛋白酶活性受到强烈抑制(黄明慧等, 2012)。
此外，我们还发现，CsrAE.coli也能强烈抑制 Xcc的野生
型菌株 Xcc8004的胞外蛋白酶活性，说明 CsrAE. coli除
了具有 RsmAXcc的功能外，至少还具有一项 RsmAXcc
不具备的功能，就是抑制 Xcc胞外蛋白酶活性的能力
(黄明慧等, 2012)。进一步的实验证实，具有抑制 Xcc
胞外蛋白酶活性的功能的区域位于 CsrAE. coli的 C末
端的非保守区(第 53位至第 61位氨基酸残基) (黄明
慧等, 2012)。众所周知，蛋白质的结构决定其功能。我
们推测，RsmAXcc和 CsrAE. coli的非保守区在功能上的
不同可能是由于结构的差异。为了证明这个推测，我
们使用 APSSP (advanced protein seconda ry structure
prediction server (http://im tech.res.in/ raghava/apssp/))在
线软件对 RsmAXcc和 CsrAE. coli的二级结构进行了预测
和比较。结果显示，RsmAXcc和CsrAE.coli具有相同的二级
结构单元，都是由 5个 β-折叠、1个 α-螺旋以及一
个位于 C端的没有特定结构的柔性区域(unstructured
flexible region)构成(图 1A)。CsrAE. coli的二级结构预测
结果和已经通过实验测定的晶体结构非常一致 (图
1B; Gutierrez et al., 2005)，说明二级结构预测结果是
可靠的。从图 1可以清楚地看到，CsrAE. coli中具有抑制
Xcc胞外蛋白酶活性功能的区域正好就是那段位于 C
末端的一段没有特定结构的柔性区域 (图 1A; Gutier-
rez et al., 2005)。令人不解的是，尽管 CsrAE. coli的 C端
非保守区具有强烈的抑制 Xcc胞外蛋白酶活性的功
能，而 RsmAXcc的 C端非保守区并没有这样的功能，
但二级结构预测结果显示，CsrAE. coli和 RsmAXcc的 C
端非保守区均是一个没有特定空间结构的柔性区域
(图 1A)。显然，这两个区域在功能上的差异无法从结
图 1 RsmAXcc和 CsrAE. coli的氨基酸序列比较,二级结构预测以及实验测定的 CsrAE. coli的晶体结构模型
注: A: RsmAXcc (GenBank编号 AAY49556)与 CsrAE. coli (GenBank编号 NP_417176)的氨基酸序列比较以及二级结构预测; B: Gutier-
rez等通过实验测定的 CsrAE. coli的晶体结构模型(Gutierrez et al., 2005);二级结构预测使用 APSSP (advanced protein secondary st-
ucture prediction server (http://im tech.res.in/raghava/apssp/))在线软件进行, CsrAE. coli二聚体的晶体结构模型来自 Gutierrez等(2005)
发表的数据;黑框内的是相同的氨基酸残基;带有下划线的氨基酸残基是具有抑制 Xcc胞外蛋白酶活性的区域
Figure 1 Amino acid sequence comparison and secondary structure prediction of RsmAXcc and CsrAE. coli, and the solution structure of
CsrAE. coli
Note: A: Amino acid sequence comparison and secondary structure prediction of RsmAXcc (GenBank accession number AAY49556) and
CsrAE.coli(GenBank accession numberNP_417176); B: The solution structure ofCsrAE.coli (Gutierrez et al., 2005); The secondary structure el-
ements are based on the prediction results using the APSSP (advanced protein secondary structure prediction) server (http://im tech.res.
in/raghava/apssp/) and the solution structure of CsrAE. coli dimmer is come from data published by Gutierrez et al (2005); Black boxes de-
note identical amino acid residues; Amino acids with underline indicate the region with the function of inhibiting the extracellular protease
activity ofXcc
442
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
构分析中获得有价值的线索。
1.2 表达特定位点丙氨酸置换突变体 CsrAE. coli 的质
粒的构建
丙氨酸置换是确定蛋白质中单个氨基酸残基功
能的最常用的方法。上面的结构分析结果显示，
CsrAE. coli C末端的非保守区(第 53至第 61位氨基酸
残基)组成的一个没有折叠成固定空间结构的柔性单
元具有抑制 Xcc胞外蛋白酶活性的功能。为了弄清
在这个由 9个氨基酸残基组成的柔性单元中究竟哪
个(些)氨基酸残基是抑制 Xcc胞外蛋白酶产生所必
需的，我们首先将这 9个氨基酸一一置换成丙氨酸，
然后对这些丙氨酸置换突变体 CsrAE. coli蛋白对 Xcc
胞外蛋白酶活性的抑制能力和野生型 CsrAE. coli的抑
制能力进行比较分析。具体的实验过程是：(1)通过引
物介导和 PCR获得包含有 csrAE. coli启动子序列以及
相关位点的丙氨酸置换的突变体 CsrAE. coli的编码序
列的 DNA片段；(2)将这些 DNA片段分别克隆到载
体质粒 pLAFR6上，获得表达带有特定位点的丙氨
酸置换突变体 CsrAE.coli蛋白的重组质粒；(3)将这些重组
质粒一一导入Xcc8004中，获得表达带有特定位点丙氨
酸置换的突变体CsrAE.coli蛋白的重组Xcc8004菌株；(4)
检测这些重组菌株的胞外蛋白酶活性，并和表达野生型
CsrAE. coli蛋白的重组 Xcc8004菌株的胞外蛋白酶活
性进行比较。
因为 CsrAE. coli的第 53位氨基酸本身是丙氨酸，所
以突变区域只包括第 54位至第 61位(E54, K55, S56,
Q57, Q58, S59, S60和Y61)共 8个氨基酸。
为了获得包含有 csrAE. coli启动子序列以及带有
E54 A (E54A)、K55 A (K55A)、S56 A (S56A)、Q57 A
(Q57A)、Q58 A (Q58A)、S59 A (S59A)、S60 A (S60A)
和 Y61 A (Y61A)的丙氨酸置换的突变体 CsrAE. coli蛋
白的编码序列的 DNA片段，我们在设计引物时将这
些位点的密码子替换为丙氨酸密码子 GCG (表 2)，然
后通过 PCR扩增获得相关的 DNA片段(图 2A)。PCR
产物经测序证明序列的正确性后，一一克隆到载体质
粒 pLAFR6的多克隆位点上，分别获得表达A54、A55、
A56、A57、A58、A59、A60和 A61的突变体 CsrAE. coli蛋
白的重组质粒，并分别命名为：pcsrAEc (E54A)、pc-
srAEc (K55A)、pcsrAEc (S56A)、pcsrAEc (Q 57A)、pc-
srAEc (Q58A)、pcsrAEc (S59A)、pcsrAEc (S60 A)和 pc-
srAEc (Y61A) (图 2B;表 1)。
1.3 K54、S60 和 Y61 是 CsrAE. coli抑制 Xcc 胞外蛋白
酶活性所必需的
我们之前的研究证明，在野生型菌株 Xcc8004
中导入表达野生型 CsrAE. coli蛋白的重组质粒后，会
导致其胞外蛋白酶活性显著下降(黄明慧等, 2012)。为
了检测 CsrAE. coli蛋白的 54至 61位氨基酸残基分别
被丙氨酸取代后对抑制 Xcc8004胞外蛋白酶活性的
能力的影响，我们将表达带有这些位点的丙氨酸置
换的突变体 CsrAE. coli蛋白的质粒，pcsrAEc (E54A)、
pcsrAEc (K55A)、pcsrAEc (S56A)、pcsrAEc (Q57A)、
pc-srAEc (Q58A)、pcsrAEc (S59A)、pcsrAEc (S60A)和
pcs- rAEc (Y61A)，通过三亲本接合分别导入 Xcc8004
中，获得重组菌株WT/pcsrAEc (E54A)、WT/pcsrAEc
图 2表达带有丙氨酸置换的突变体 CsrAE. coli蛋白的质粒的构建
注: A:包含 csrAE. coli启动子序列以及带有 E54A (泳道 1), K5-
5A (泳道 2), S56A (泳道 3), Q57A (泳道 4), Q58A (泳道 5),
S59A (泳道 6), S60A (泳道 7)和 Y61A (泳道 8)突变的 csrAE. coli
基因的编码序列的 PCR扩增; B:重组质粒重组质粒 pcsrAEc
(E54A) (泳道 1), pcsrAEc(K55A) (泳道 2), pcsrAEc (S56A) (泳
道 3), pcsrAEc (Q57A) (泳道 4), pcsrAEc (Q58A) (泳道 5), pc-
srAEc(S59A) (泳道 6), pcsrAEc (S60A) (泳道 7)和 pcsrAEc (Y-
61A) (泳道 8)的酶切验证(EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切)
Figure 2 Construction of Xcc8004 strains expressing CsrAE. coli
with a specific alanine replacement mutation
Note: A: PCR amplification of DNA fragments containing the
promoter of csrAE. coli and the coding sequences of csrAE. coli with
E54A (lane 1), K55A (lane 2), S56A (lane 3), Q57A (lane 4),
Q58A (lane 5), S59A (lane 6), S60A (lane 7) and Y61A (lane 8)
mutations; B: confirmation of recombinant plasmids pcsrAEc
(E54A) (lane 1), pcsrAEc(K55A) (lane 2), pcsrAEc (S56A) (lane
3), pcsrAEc (Q57A) (lane 4), pcsrAEc (Q58A) (lane 5), pcsrAEc
(S59A) (lane 6), pcsrAEc (S60A) (lane 7) and pcsrAEc (Y61A)
(lane 8), by using EcoRⅠ/HindⅢ digestion
443
(Q57A)、WT/pcsrAEc (Q58A)、WT/pcsrAEc (S59A)、W
T/pcsrAEc (S60A)和 WT/pcsrAEc (Y61A) (表 1)。接
着，我们对这些重组菌株的胞外蛋白酶活性进行检
测，并和野生型菌株 Xcc8004以及带有表达野生型
CsrAE. coli蛋白的重组质粒的 Xcc8004 (WT/pcsrAEc)的
胞外蛋白酶活性进行比较。结果显示，野生型菌株
Xcc8004 (WT)菌落周围产生较大的透明圈，而带有表
达菌 CsrAE. coli蛋白的重组质的 Xcc8004菌株(WT/pc-
srAEc)菌落周围几乎没有透明圈(图 3)，证明 CsrAE. coli
确实具有强烈的抑制 Xcc胞外蛋白酶活性的能力。
从图 3可以看到，和菌株 WT/pcsrAEc一样，菌株
WT/pcsrAEc (K55A)、WT/pcsrAEc (S56A)、WT/pcsrA
Ec (A)、WT/pcsrAEc (Q58A)和 WT/pcsrAEc (S59A)
菌落周围也只有非常小的透明圈(图 3)，说明K55、S56、
Q57、Q58和 S59置换为丙氨酸后对 CsrAE. coli抑制 Xcc
蛋白酶活性的能力没有影响，证明这 5个氨基酸残基
不是 CsrAE. coli抑制 Xcc胞外蛋白酶的活性必需的氨
基酸残基。而菌株WT/pcsrAEc (E54A)、WT/pcsrAEc
(S60A)和 WT/pcsrAEc (Y61A)菌落周围的透明圈的
大小和野生型菌株 Xcc8004菌落周围产生大的透明
圈的大小没有差别(图 3)，说明 E54、S60和 Y61这三
个氨基酸变为丙氨酸后就丧失了抑制 Xcc蛋白酶活性
的能力。这一结果证明，第 54位赖氨酸(K54)、第 60位
丝氨酸(S60)和第 61位酪氨酸(Y61)是 CsrAE. coli抑制
Xcc蛋白酶产生所必需的。
2讨论
CsrA/RsmA是细菌中一类分布非常广泛、序列
高度保守，生物学功能和调控机理相似的转录后全
局调控因子。来自不同细菌的 CsrA/RsmA在生物学
功能和调控机理上的相似性，已经通过异源互补实
验得到充分证明(Pessi et al., 2001; Fields and Thomp-
son, 2012;黄明慧等, 2012)。但人们对来自不同细菌
的 CsrA/RsmA在生物学功能和调控机理上的差异却
知之甚少。我们之前的研究表明，大肠杆菌的 CsrA除
了具有 XccRsmA的功能外，至少还具有一项 XccRs-
mA没有的功能，就是抑制 Xcc的胞外蛋白酶活性的
能力(黄明慧等，2012)。我们之前的实验还证实，抑制
Xcc蛋白酶活性的能力的区域位于 CsrAE. coli的 C-末
端的第 53~61位氨基酸残基(黄明慧等, 2012)。本研究
大肠杆菌全局调控蛋白 CsrA中抑制十字花科黒腐病菌胞外蛋白酶活性所必需的氨基酸残基的鉴定
Identification of the Amino Acid Residue Essential for Inhibition of the Extracellular Protease Activity
表 1本工作所使用的引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称
Primer name
csrAEc-F/csrAEc (Y61A)-R
csrAEc-F/csrAEc (S60A)-R
csrAEc-F/csrAEc (S59A)-R
csrAEc-F/csrAEc (Q58A)-R
csrAEc-F/csrAEc (Q57A)-R
csrAEc-F/csrAEc (S56A)-R
csrAEc-F/csrAEc (K55A)-R
csrAEc-F/csrAEc (E54A)-R
序列(5-3)a
Sequences (5-3)a
cccgaattccttacctgcagcgttagccagt/cccaagcttttacgcactggactgctgggatttttcagc
cccgaattccttacctgcagcgttagccagt/cccaagcttttagtacgcggactgctgggatttttcagc
cccgaattccttacctgcagcgttagccagt/cccaagcttttagtaactcgcctgctgggatttttcagc
cccgaattccttacctgcagcgttagccagt/cccaagcttttagtaactggacgcctgggatttttcagc
cccgaattccttacctgcagcgttagccagt/cccaagcttttagtaactggactgcgcggatttttcagc
cccgaattccttacctgcagcgttagccagt/cccaagcttttagtaactggactgctgcgctttttcagc
cccgaattccttacctgcagcgttagccagt/cccaagcttttagtaactggactgctgggacgcttcac
cccgaattccttacctgcagcgttagccagt/cccaagcttttagtaactggactgctgggatttcgcagc
产物长度(bp)
Product length (bp)
475
475
475
475
475
475
475
475
注: a:所有引物根据大肠杆菌 K12基因组(Blattner et al., 1997) (GenBank编号 NC_000913)的 csrA基因(基因编号: b2696,基因
组位置: 2816983-2817168)序列设计;斜体加下划线字母为人为加入的限制性内切酶 EcoRⅠ (gaattc)和 HindⅢ (aagctt)序列;方
框内的黑体字母 cgc为设计的丙氨酸编码序列的互补链
Note: a: All primers are designed according to the csrA gene (locus_tag: b2696; Genome position: 2816983-2817168) of E. coli K12
genome (Blattner et al., 1997) (genome GenBank accession number NC_000913); Italic letters with underline are added restrict enzymes;
The boxed cgc is the codon for alanine
图 3 Xcc菌株的胞外蛋白酶活性检测
注:胞外蛋白酶活性检测方法按“材料与方法”中描述的方法
进行;图中出示的结果是三次重复实验中,其中一次实验的结
果,其余两次重复实验的结果和本图出示的结果相似
Figure 3 Detection of the extracellular protease activity of Xcc
strains
Note: Extracellular protease activity detection was performed as
described in“Materials and Methods”; Data presented were from
a representative experiment and similar results were obtained in
all other two independent experiments
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基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
菌株
Strain
E. coli JM109
Xcc8004
WT/pcsrAEc
WT/pcsrAEc (E54A)
WT/pcsrAEc (K55A)
WT/pcsrAEc(S56A)
WT/pcsrAEc (Q57A)
WT/pcsrAEc (Q58A)
WT/pcsrAEc (S59A)
WT/pcsrAEc (S60A)
WT/pcsrAEc (Y61A)
质粒
Plasmid
pLAFR6
pRK2073
pcsrAEc
pcsrAEc (E54A)
pcsrAEc (K55A)
特征
Relevant characteristics
大肠杆菌,基因型为: RecA1, endA1, gyrA96, thi, supE44, relA1△ (lac-proAB)/F
(traD36, lacIq, lacZ△M15)
E. coli, the gene types: RecA1, endA1, gyrA96, thi, supE44, relA1△ (lac-proAB)/F
(traD36, lacIq, lacZ△M15)
Xcc野生型菌株;抗利福平(Rifr)
Xcc wild type strain; Rifampicin resistance (Rifr)
8004中含有质粒 pcrsAEc,抗卡那霉素(Rifr)和四环素(Tcr)
8004 containing the plasmid pcrsAEc, kanamycin and tetracycline resistance (Rifr,
Tcr)
8004中含有质粒 pcsrAEc (E54A),抗卡那霉素(Rifr)和四环素(Tcr)
8004 containing the plasmid pcsrAEc (E54A), kanamycin and tetracycline resistance
(Rifr, Tcr)
8004中含有质粒 pcsrAEc (K55A),抗卡那霉素(Rifr)和四环素(Tcr)
8004 containing the plasmid pcsrAEc (K55A), kanamycin and tetracycline resistance
(Rifr, Tcr)
8004中含有质粒 pcsrAEc (S56A),抗卡那霉素(Rifr)和四环素(Tcr)
8004 containing the plasmid pcsrAEc (S56A), kanamycin and tetracycline resistance
(Rifr, Tcr)
8004中含有质粒 pcsrAEc (Q57A),抗卡那霉素(Rifr)和四环素(Tcr)
8004 containing the plasmid pcsrAEc (Q57A), kanamycin and tetracycline resistance
(Rifr, Tcr)
8004中含有质粒 pcsrAEc (Q58A),抗卡那霉素(Rifr)和四环素(Tcr)
8004 containing the plasmid pcsrAEc (Q58A), kanamycin and tetracycline resistance
(Rifr, Tcr)
8004中含有质粒 pcsrAEc (S59A),抗卡那霉素(Rifr)和四环素(Tcr)
8004 containing the plasmid pcsrAEc (S59A), kanamycin and tetracycline resistance
(Rifr, Tcr)
8004中含有质粒 pcsrAEc (S60A),抗卡那霉素(Rifr)和四环素(Tcr)
8004 containing the plasmid pcsrAEc (S60A), kanamycin and tetracycline resistance
(Rifr, Tcr)
8004中含有质粒 pcsrAEc (Y61A),抗卡那霉素(Rifr)和四环素(Tcr)
8004 containing the plasmid pcsrAEc (Y61A), kanamycin and tetracycline resistance
(Rifr, Tcr)
PK2 replicon; Mob+, Tra-; cos+,抗四环素(Tcr)
PK2 replicon; Mob+, Tra-；cos+, tetracycline resistance (Tcr)
帮助质粒, Tra+, Mob+, ColE1,链霉素抗性 Spcr
Helper plasmid, Tra+, Mob+, ColE1, Spcr
pLAFR6中带有一个 E.coli的完整的野生型 csrA基因全序列,抗四环素(Tcr)
pLAFR6 containing an entail E. coli csrA gene, tetracycline resistance (Tcr)
pLAFR6中带有一个编码带有 E54A点突变的 CsrAE. coli的 csrA基因 DNA片
段,抗四环素(Tcr)
pLAFR6 containing a mutated csrA encoding a E54A point mutation CsrAE. coli pro-
tein, tetracycline resistance (Tcr)
pLAFR6中带有一个编码带有 K55A点突变的 CsrAE. coli的 csrA基因 DNA片
段,抗四环素(Tcr)
pLAFR6 containing a mutated csrA encoding a K55A point mutation CsrAE. coli
protein, tetracycline resistance (Tcr)
来源或参考文献
Source or reference
Yanisch-Perron et al., 1985
Daniels et al., 1984
黄明慧等, 2012
Huang et al., 2012
本研究
This work
本研究
This work
本研究
This work
本研究
This work
本研究
This work
本研究
This work
本研究
This work
本研究
This work
Huynh et al., 1989
Leong et al., 1982
黄明慧等, 2012
Huang et al., 2012
本研究
This work
本研究
This work
表 2本研究使用的细菌菌株和质粒
Table 2 Bacterial strains and plasmids used in this study
445
菌株
Strain
pcsrAEc (S56A)
pcsrAEc (Q57A)
pcsrAEc (Q58A)
pcsrAEc (S59A)
pcsrAEc (S60A)
pcsrAEc(Y61A)
特征
Relevant characteristics
pLAFR6中带有一个编码带有 S56A点突变的CsrAE.coli的 csrA基因DNA片段,抗四环素(Tcr)
pLAFR6 containing a mutated csrA encoding a S56A point mutation CsrAE. coli protein, tetracy-
cline resistance (Tcr)
pLAFR6中带有一个编码带有 Q57A点突变的 CsrAE. coli的 csrA基因 DNA片段,抗四环素
(Tcr)
pLAFR6 containing a mutated csrA encoding a Q57A point mutation CsrAE. coli protein, tetracy-
cline resistance (Tcr)
pLAFR6中带有一个编码带有 Q58A点突变的 CsrAE. coli的 csrA基因 DNA片段,抗四环素
(Tcr)
pLAFR6 containing a mutated csrA encoding a Q58A point mutation CsrAE. coli protein, tetracy-
cline resistance (Tcr)
pLAFR6中带有一个编码带有 S59A点突变的CsrAE.coli的 csrA基因DNA片段,抗四环素(Tcr)
pLAFR6 containing a mutated csrA encoding a S59A point mutation CsrAE. coli protein, tetracy-
cline resistance (Tcr)
pLAFR6中带有一个编码带有 S60A点突变的CsrAE.coli的 csrA基因DNA片段,抗四环素(Tcr)
pLAFR6 containing a mutated csrA encoding a S60A point mutation CsrAE. coli protein, tetracy-
cline resistance (Tcr)
pLAFR6中带有一个编码带有 Y61A点突变的 CsrAE. coli的 csrA基因 DNA片段,抗四环素
(Tcr)
pLAFR6 containing a mutated csrA encoding a Y61A point mutation CsrAE. coli protein, tetracy-
cline resistance (Tcr)
来源或参考文献
Source or reference
本研究
This work
本研究
This work
本研究
This work
本研究
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本研究
This work
本研究
This work
续表 2
Continuing table 2
中，我们通过丙氨酸置换和功能分析，证明 CsrAE. coli蛋
白 C-末端的第54位赖氨酸、第 60位丝氨酸和第 61
位酪氨酸是抑制 Xcc胞外蛋白酶活性的必需氨基酸。
在试图解释为什么 CsrAE. coli的 C-末端具有而
RsmAXcc没有抑制 Xcc胞外蛋白酶活性的功能时，我
们首先想到可能它们的的 C-末端的空间结构存在
差异。但出乎意料的是，二级结构预测结果显示，尽
管 CsrAE. coli 的 C 端和 RsmAXcc 的 C 端序列差异很
大，它们的结构几乎是一样的，都是一个没有特定空间
结构的柔性区域(图 1A)。蛋白质中的柔性区域(flexible
region)是指蛋白结构中没有折叠成固定空间结构的部
分(Gutierrez et al., 2005; Santambrogio et al., 2012)。尽管
这些柔性区域在蛋白折叠时没有形成固定的结构，但
组成它们的氨基酸可以与细胞中的其它分子(如蛋白
或一些小分子) 特异结合从而发挥特定的作用(Law-
son et al., 2004; Yanaka et al., 2010; Santambrogio et
al., 2012)。我们推测，CsrAE. coli的 C端的某个(些)氨基
酸残基的基团是 CsrAE. coli与 Xcc细胞中的某个(些)因
子互作的必需基团，该氨基酸残基的改变导致 CsrAE. coli
的 C端空间构象改变，继而影响与 Xcc因子的互作，
最终从蛋白水平影响与具有抑制 Xcc胞外蛋白酶相关
基因的表达。另一种可能是，CsrAE.coli的 C端可以直接
和 Xcc胞外蛋白酶相关基因的 mRNA直接结合从
而抑制这些基因的表达。由于丙氨酸置换和功能分
析结果证明 CsrAE. coli蛋白的第 54位赖氨酸、第 60
位丝氨酸和第 61位酪氨酸是抑制 Xcc胞外蛋白酶
活性的必需氨基酸。我们推测，这 3个氨基酸可能就
是和 Xcc细胞中的某个(些)因子特异结合或者是与
Xcc胞外蛋白酶相关基因的 mRNA结合所必需的氨
基酸。这些推测是否正确有待实验的验证。
3材料与方法
3.1 本研究使用的细菌菌株和质粒，以及细菌的培养
条件
本研究使用的质粒和菌株如表 2所示。
大肠杆菌和 Xcc的培养：大肠杆菌在 LB培养基
(Miller, 1972)，37℃培养。Xcc 在丰富培养基 NYG
(Daniels et al., 1984)，28℃培养。必要时加抗菌素利福
平(终浓度: 50 g/mL)或 /和四环素(终浓度: 5 g/mL)。
3.2 质粒和菌株的构建
质粒构建：以大肠杆菌K12菌株的总DNA为模板，
分别以 csrAEc-F/csrAEc (E54A)-R、csrAEc-F/cs rA-Ec
(K55A)-R、csrAEc-F/csrAEc (S56A)-R、csrAEc-F/csrA
大肠杆菌全局调控蛋白 CsrA中抑制十字花科黒腐病菌胞外蛋白酶活性所必需的氨基酸残基的鉴定
Identification of the Amino Acid Residue Essential for Inhibition of the Extracellular Protease Activity 446
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
Ec (Q57A)-R、csrAEc-F/csrAEc(Q58A)-R、csrAEc-F/cs
rAEc (S59A)-R、csrAEc-F/csrAEc (S60A)-R 和 csrAE
c-F/csrAEc (Y61A)-R (表 1)为引物进行 PCR反应，扩
增得到编码相应的丙氨酸置换突变的 csrAE. coli基因(包
括 csrAE. coli启动子) 的 DNA片段 (长度为 475 bp)。
PCR产物测序确证后，用 EcoRⅠ/HindⅢ双酶切，然
后和经 EcoRⅠ/HindⅢ双酶切的 pLAFR6载体连接，
连接产物转化大肠杆菌 JM109并筛选转化子，接着，
从阳性转化子中提取重组质粒进行酶切验证。将经酶
切验证的带有目的外源DNA片段的重组质粒分别命名
为 pcsrAEc (E54A)、pcsrAEc (K55A)、pcsrAEc (S56A)、
pcsrAEc (Q57A)、pcsrAEc (Q58A)、pcsrAEc (S59A)、p-
csrAEc (S60A)和 pcsrAEc (Y61A) (表 1)。
菌株构建：在帮助质粒 pRK2073帮助下，通过三
亲本接合将质粒 pcsrAEc (E54A)、pcsrAEc (K55A)、p-
csrAEc (S56A)、pcsrAEc (Q57A)、pcsrAEc (Q58A)、p-
csr AEc (S59A)、pcsrAEc (S60A)和 pcsrAEc (Y61A)
从大肠杆菌 JM109 分别转入 Xcc 的野生型菌株
Xcc8004中，获得重组菌株，经提取质粒进行酶切验
证后分别命名为 WT/pcsrAEc (E54A)、WT/pcsrAEc
(K55A)、WT/pcsrAEc (S56A)、WT/pcsrAEc (Q57A)、W-
T/pcsrAEc (Q58A)、WT/pcsrAEc (S59A)、WT/pcs AEc
(S60A)和WT/pcsrAEc (Y61A) (表 1)。
3.3 Xcc胞外蛋白酶检测
Xcc菌株在NYGB液体培养基中，28℃、200 r/min
培养过夜。然后将菌液浓度调为 OD600=0.2，再用移液
器吸取 2 μL菌液接种在含终浓度为 1%的脱脂乳的
NYGA平板上，置于 28℃培养箱中培养，48 h后观察
和拍照。实验设 3个重复，同样的实验至少进行 3次。
作者贡献
晁耐霞和唐东阶是本研究的实验设计者及负责
人，实验研究的主要执行人；钟婉莹和秦春铃参与部
分实验；唐纪良参与实验设计和实验结果分析；唐东
阶和晁耐霞完成数据分析、论文写作及修改。全体作
者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究所需经费由国家自然科学基金项目(3
1071141)资助。
参考文献
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大肠杆菌全局调控蛋白 CsrA中抑制十字花科黒腐病菌胞外蛋白酶活性所必需的氨基酸残基的鉴定
Identification of the Amino Acid Residue Essential for Inhibition of the Extracellular Protease Activity 448