全 文 ：基因组学与应用生物学，2012年，第 31卷，第 4期，第 341-348页
Genomics and Applied Biology, 2012, Vol.31, No.4, 341-348
研究论文
Research Article
大肠杆菌转录后调控蛋白 CsrA的 C末端具有抑制十字花科黑腐病菌
胞外蛋白酶活性的功能
黄明慧 1 陈承晓 1 覃振萍 1 唐纪良 1,2 唐东阶 2 晁耐霞 3*
1广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530005; 2亚热带农业生物资源保护利用国家重点实验室,南宁, 530005; 3广西医科大学基础医学院,
南宁, 530021
*通讯作者, hurry211625@163.com
摘 要 CsrA (在有些细菌例如十字花科黒腐病菌中也称为 RsmA,统称 CsrA/RsmA)是一类在细菌中广泛
分布而且氨基酸序列非常保守的 RNA结合蛋白。研究表明，CsrA/RsmA作为转录后全局调控因子参与了包
括细胞碳代谢、次生代谢、运动性、生物被膜形成以及动植物病原菌的致病过程等许多细胞过程的调控。
CsrA/RsmA在不同的细菌中的生物学功能各有异同。在大肠杆菌中，CsrA的主要功能是控制细胞的碳代谢、
运动性和生物被膜形成；而在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris, Xcc)中，CsrA
的同源蛋白 RsmA的主要功能除了控制碳代谢、运动性和生物被膜形成外，还控制致病性和胞外酶的产生。
大肠杆菌的 CsrA (CsrAE. coli)是否具有 Xcc RsmA (RsmAXcc)的功能？为了回答这个问题，我们用大肠杆菌的
csrA 基因(csrAE. coli)互补 Xcc 的 rsmA 基因(rsmAXcc)的缺失突变体 DM2506。结果显示，csrAE. coli 能够互补
DM2506的所有表型，说明 CsrAE. coli具有 RsmAXcc的全部功能。更重要的是，我们发现，无论是 rsmAXcc突变体
还是野生型菌株，导入表达 CsrAE. coli的质粒后均导致其致胞外蛋白酶活性的严重下降，证明 CsrAE. coli具有抑
制 Xcc胞外蛋白酶活性的作用。进一步的实验证实，CsrAE. coli的 C末端第 53~61位氨基酸残基具有抑制 Xcc
胞外蛋白酶活性的功能。
关键词 十字花科黑腐病菌 Xcc,大肠杆菌,转录后调控蛋白 CsrA,胞外蛋白酶
The C-terminus of the Post-transcriptional Regulator CsrA from Escherichia
coli Inhibits the Extracellular Protease Activity of Xanthomonas campestris
pathovar campestris
Huang Minghui 1 Chen Chengxiao 1 Qin Zhenping 1 Tang Jiliang 1,2 Tang Dongjie 2 Chao Naixia 3*
1 College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530005; 2 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of
Subtropical Agro-bioresources, Nanning, 530005; 3 School of Preclinical Medicine, Guangxi Medical University, Nanning, 530021
* Corresponding author, hurry211625@163.com
DOI: 10.3969/gab.031.000341
Abstract CsrAs (also known as RsmA in some bacteria such as Xanthomonas campestris pathovar campestris
(Xcc); collectively known as CsrAs/RsmA) are a family of widely distributed and highly conserved RNA-binding
proteins in various bacterial species. It has been shown that CsrAs/RsmAs acting as post-transcriptional global
regulators play important roles in the regulation of various cellular processes including carbon metabolism, secon-
darymetabolism, cell motility, biofilm formation as well as the pathogenesis of plant and animal bacterial pathogens.
CsrAs/RsmAs have both common and different biological functions in different bacteria. In E. coli, the major role of
CsrA is controlling carbon metabolism, cell motility and biofilm formation, while in Xcc, in addition to roles
described above, RsmA also plays important roles in the regulation of extracellular emzyme activity and virulence. In
this study, we used the csrA gene ofE. coli (csrAE. coli) to complement the rsmA deletion mutant ofXcc (rsmAXcc) to find
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31071141)资助
out whether E. coli CsrA (CsrAE. coli) has the same functions as Xcc RsmA (RsmAXcc). Our results showed that csrAE. coli
can completely complement the phenotypes of rsmAXcc mutant, demonstrating that CsrAE. coli has the same function as
RsmAXcc. More interestingly, we found that introducing a plasmid expressing CsrAE. coli into either the wild type strain
or the rsmAXcc mutant resulted in great reduction in their extracellular protease activities, indicating that CsrAE. coli has
the ability to inhibit the extracellular protease activity of Xcc. Further experiments demonstrated that amino acid
residues at position 53 to 61 from the C-terminus end of E. coli CsrA have the inhibition function.
Keywords Xanthomonas campestris pathovar campestris (Xcc), Escherichia coli, Post-transcriptional regulator
CsrA, Extracellular protease
CsrA是碳存储调控子(carbon storage regulator)
的简称。由于在有些细菌，例如十字花科黒腐病菌
(Xanthomonas campestris pathovar campestris, 以下简
称 Xcc)，中 CsrA的同源蛋白能够抑制次生代谢，因
此也称为 RsmA ( repressor of secondary metaboli-
sm)，即次生代谢抑制子。CsrA于 1993年首先在大肠
杆菌(Escherichia coli)中被鉴定为碳源代谢调控子
(Romeo et al., 1993)。而 RsmA则是于 1995年首先在
胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp. caro-
tovora)被鉴定为次生代谢抑制子 (Chatterjee et al.,
1995)。其实 CsrA和 RsmA在氨基酸序列上高度一
致而在进化上是同源的，因此现在统称为 CsrA/Rs-
mA。CsrA/RsmA蛋白家族是一类在细菌中广泛分布
而且氨基酸序列非常保守的 RNA结合蛋白，它们
作为转录后调控因子，通过与靶标 mRNA的特异结
合从而抑制靶标 mRNA的翻译或改变其稳定性来
调控靶标基因的表达(Timmermans and van Melderen,
2010)。研究表明，CsrA/RsmA蛋白与 CsrB、CsrC (或
RsmB, RsmC)等 2~3 个小 RNA (small RNA)组成一
个 Csr/Rsm调控系统(Timmermans and van Melderen,
2010)。在一个 Csr/Rsm调控系统中，CsrA/RsmA蛋
白的作用是与靶标 mRNA 的特异结合从而控制靶
标基因的表达，而 CsrB/RsmB和 CsrC/RsmC小 RNA
的作用是与 CsrA/RsmA蛋白从而抑制 CsrA/RsmA
的活性(Romeo, 1998; Timmermans and van Melderen,
2010)。Csr/Rsm调控系统在细菌中广泛存在，但有意
思的是，尽管其中的 CsrA/RsmA蛋白氨基酸序列在
不同种属的细菌中是高度保守的，但小 RNA核苷酸
序列则是高度变异的(Heeb et al., 2002)。到目前为
止，人们已在许多细菌中鉴定了 CsrA/RsmA蛋白，
但只在其中几个菌中鉴定了相应的小 RNA。
功能研究结果显示，CsrA/RsmA作为转录后全
局调控系统参与了包括细胞碳代谢、次生代谢、运动
性、生物被膜形成以及动植物病原菌的致病过程等
许多细胞过程的调控(Timmermans and van Melderen,
2010)。值得注意的是，在不同的细菌中，CsrA/RsmA
的生物学功能既有很多共同之处但也存在不同的地
方。例如，大肠杆菌的 CsrA (CsrAE. coli)和 Xcc的 Rs-
mA (RsmAXcc)均有调控细胞碳代谢、运动性、生物膜
形成的共同功能，但 RsmAXcc还参与了致病和胞外酶
活性的调控(Romeo et al., 1993; Romeo, 1998; Sabnis
et al., 1995; Wei et al., 2001; Dubey et al., 2003; Chao
et al., 2008)。为了弄清 CsrAE. coli是否具有 RsmAXcc的
功能。在本研究中，我们用大肠杆菌的 csrA 基因
(csrAE. coli)去互补 Xcc的 rsmA基因(rsmAXcc)的缺失突
变体 DM2506 (Chao et al., 2008)，并对所得的互补菌
进行了表型分析。结果显示，csrAE. coli 能够互补
DM2506的所有表型，说明 CsrAE. coli具有 RsmAXcc的
功能。更重要的是，我们还发现 CsrAE. coli的 C末端第
53~61位氨基酸残基具有抑制 Xcc胞外蛋白酶活性
的功能。这些结果使人们对不同细菌的 CsrA/RsmA
的功能有了进一步的了解。
1结果与分析
1.1 RsmAXcc和 CsrAE. coli的氨基酸序列比较
几乎所有已完成基因组测序的细菌中都发现有
CsrA/RsmA的存在。CsrA/RsmA家族蛋白分子很小，
各成员通常由 60~72个氨基酸基组成。通过氨基酸
序列同源比较发现，来自不同细菌种属的 CsrA/Rs-
mA在氨基酸水平上有极高的保守性(Romeo, 1998;
Timmermans and van Melderen, 2010)。大肠杆菌的
CsrAE. coli是早被鉴定的 CsrA/RsmA家族蛋白分子，
由 61个氨基酸基组成(Romeo et al., 1993)。基因组测
序和注释结果显示，在十字花科黒腐病菌 8004菌株
(以下通称 Xcc8004)的基因组上存在一个 rsmA基因
rsmAXcc；rsmAXcc全长 210 bp，编码 70个氨基酸(Qian
et al., 2005)。氨基酸序列比较结果显示，RsmAXcc和
CsrAE. coli在氨基酸水平上全长有 69%的一致性，而且
RsmAXcc的第 1至第 52位氨基酸个与 CsrAE. coli的第
1至第 52位氨基酸高度保守(90%的一致性)，而两者
大肠杆菌转录后调控蛋白 CsrA的 C末端具有抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性的功能
C-terminus of CsrA from E. coli Inhibits the Extracellular Protease Activity of X. campestris pathovar campestris 342
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
第 53位以后的氨基酸则不保守，只有第 60位氨基
酸一致，其它位置的氨基酸均不一致(图 1)。
1.2 csrAE. coli能够互补 rsmAXcc突变体的所有表型
Romeo等人的研究表明，在大肠杆菌中，CsrA
抑制细胞的糖原合成、糖异生途径和生物被膜形成，
同时激活细胞的糖酵解、乙酸代谢以及运动能力
(Romeo et al., 1993; Romeo, 1998; Sabnis et al., 1995;
Wei et al., 2001; Dubey et al., 2003)。本实验室的研究
发现，在 Xcc中，rsmAXcc的缺失会导致一系列表型变
化，包括：(1)丧失在寄主上的致病力以及在非寄主上
引发 HR反应的能力；(2)丧失游动性；(3)降低胞外多
糖产量和胞外纤维素酶和淀粉酶的活性；(4)促进糖
原合成和生物被膜形成。这说明 RsmA在 Xcc中有
抑制细胞的糖原合成和生物被膜形成以激活细胞运
动能力和致病因子产生的功能(Chao et al., 2008)。由此
可见，CsrAE. coli和 RsmAXcc具有共同的生物学功能，
就是抑制细胞的糖原合成和生物被膜形成，以及激
活细胞运动能力。但和 CsrAE. coli不同的是，RsmAXcc
除了控制碳代谢、运动性和生物被膜形成外，还控制
致病性和胞外酶活性。基于两者氨基酸序列的高度
相似性，我们推测 CsrAE. coli可能也具有调控 Xcc致
病性和胞外酶活性的功能，只是这些功能在大肠杆
菌中没表现出来。为了证明这一推测，我们将 csrAE. coli
连同它的启动子一起克隆到广谱载体 pLAFR6 上
(Huynh et al., 1989)，获得表达 CsrAE. coli的重组质粒
pcsrAEc 并将其导入 rsmAXcc突变体 DM2506 中，获
异原互补菌株 DM2506/pcsrAEc (构建过程详见“材
料与方法”)。接着，我们检测了 DM2506/pcsrAEc的
HR反应、致病力、运动能力、生物被膜形成、胞外蛋
白酶活性、胞外淀粉酶活性、胞外纤维素酶活性以及
胞外多糖产量，同时和野生型菌株 Xcc8004、rsmAXcc
突变体 DM2506 以及 rsmAXcc突变体的自身互补菌
株 CDM2506的相关表型进行比较(图 2)。从图 2看
出，除胞外蛋白酶外，DM2506/pcsrAEc、CDM2506以
及 Xcc8004的表型相似(图 2)，说明和 rsmAXcc一样，
csrAE. coli也能将 rsmAXcc的表型恢复到野生型的水平，
证明 CsrAE. coli也具有调控 Xcc致病和胞外酶活性的
图 1 RsmAXcc (GenBank编号 AAY49556)与 CsrAE. coli (GenBank编号 NP_417176)的氨基酸序列比较
注:黑框内的是相同的氨基酸残基
Figure 1 Amino acid sequence comparison of RsmAXcc (GenBank accession number AAY49556) and CsrAE. coli (GenBank accession
number NP_417176)
Note: Black boxes denote identical amino acid residues
能力。值得注意的是，尽管 rsmAXcc突变体 DM2506
的胞外蛋白酶活性较强(和野生型没有明显差别)，但
DM2506/pcsrAEc的胞外蛋白酶活性却非常低(图 2)。
从图 2可以看到，CDM2506与野生型菌株的胞外蛋
白酶活性没有明显差异，说明 DM2506/pcsrAEc胞外
蛋白酶活性的降低并非由载体质粒 pLAFR6导致。
这些结果证明，CsrAE. coli具有抑制 rsmAXcc突变体的
胞外蛋白酶活性的能力。
1.3 CsrAE. coli强烈抑制 Xcc胞外蛋白酶的活性
从图 2 中的胞外蛋白酶活性检测结果可以看
到，CsrAE. coli 能够强烈抑制 rsmAXcc突变体 DM2506
的胞外蛋白酶活性。为了检测 CsrAE. coli是否也能够抑
制 Xcc野生型菌株 Xcc8004的胞外蛋白酶活性，我们
将表达 CsrAE. coli的重组质粒 pcsrAEc 导入 Xcc8004
中，获得可以表达 CsrAE. coli 的野生型菌株 WT/pc-
srAEc。胞外蛋白酶活性检测结果显示，和 DM2506/
pcsrAEc 相似，WT/pcsrAEc 的胞外蛋白酶活性也非
常低(图 3)。这一结果证明，CsrAE.coli确实具有抑制 Xcc
胞外蛋白酶活性的功能。
1.4 CsrAE. coli的 C-末端第 55~61位氨基酸残基是抑
制 Xcc蛋白酶活性的关键氨基酸残基
由于 Xcc8004和 CDM2506的胞外蛋白酶活性
是正常的(图 2)，说明 RsmAXcc没有抑制 Xcc胞外蛋
白酶活性的作用。但 CsrAE. coli则能强烈抑制 Xcc的
胞外蛋白酶活性(图 2)。RsmAXcc和 CsrAE. coli氨基酸
序列比对结果显示，RsmAXcc的第 1至第 52位氨基
酸个与 CsrAE. coli的第 1至第 52位氨基酸高度保守，
而从第 53位及以后的氨基酸则不保守(图 1)。因此
我们推测 CsrAE. coli抑制 Xcc胞外蛋白酶活性的功能
域可能存在于 CsrAE. coli的 C-末端第53~61位氨基
酸残基区域。为了验证这一假设，我们分别构建了表
达 RsmAXcc的第 53~70位氨基酸残基被 CsrAE. coli的
第 53~61位氨基酸残基取代的杂合 RsmAXcc蛋白的
质粒 pRsmA1-52+CsrA53-61和 CsrAE. coli的第 53~61
位氨基酸残基被 RsmAXcc的第 53~70位氨基酸残基
取代的杂合的 CsrAE. coli蛋白的质粒 pCsrA1-52+Rs-
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大肠杆菌转录后调控蛋白 CsrA的 C末端具有抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性的功能
C-terminus of CsrA from E. coli Inhibits the Extracellular Protease Activity of X. campestris pathovar campestris
mA53-70。然后分别将表达这两个杂合蛋白的质粒导
入 Xcc8004中，获得菌株WT/pRsmA1-52+CsrA53-61
和WT/pCsrA1-52+RsmA53-70并检测它们的胞外蛋
白酶活性。结果显示，菌株WT/pRsmA1-52+CsrA53-
61的胞外蛋白酶活性非常低，而WT/pCsrA1-52+Rs-
mA53-70的胞外蛋白酶活性很高，和野生型菌株没有
明显差别(图 3)，说明 RsmAXcc的第 53~70位氨基酸残
基被 CsrAE.coli的第 53~61位氨基酸残基取代后获得了
抑制 Xcc蛋白酶活性的能力，而 CsrAE. coli的第 53~61
位氨基酸残基被 RsmAXcc的第 53~70位氨基酸残基取
代后失去了抑制 Xcc蛋白酶活性的能力。这些结果充
分证明 CsrAE. coliC-末端第53~61位氨基酸残基具有
抑制 Xcc蛋白酶活性的能力，而第 1~52位氨基酸残基
没有抑制 Xcc蛋白酶活性的功能。
2讨论
CsrA/RsmA是细菌中一类非常重要的转录后全
局调控因子。尽管大肠杆菌与 Xcc的亲缘关系比较
远，但大肠杆菌的 CsrA (CsrAE. coli)与 Xcc 的 RsmA
(RsmAXcc)在氨基酸水平上高度保守。与氨基酸的保
守性相一致，CsrAE. coli 和 RsmAXcc 的功能也非常相
似，两者都有调控细胞碳代谢、运动性、生物膜形成
的共同功能。但值得注意的是，CsrAE. coli和 RsmAXcc
在各自的细胞中的生物学功能并非完全相同，在 Xcc
中，除了调控细胞碳代谢、运动性、生物膜形成外，
图 2 Xcc不同菌株的表型分析
注: A: 在非寄主植物辣椒 ECW-10R (Capsicum annuum cv.
ECW-10R)上的 HR 反应 ; B : 在寄主植物萝卜 (Raphanus
sativus L. var. radiculus Pers.)上的致病力; C:细胞运动能力; D:
生物被膜形成; E:胞外蛋白酶活性; F:胞外淀粉酶活性; G:胞
外纤维素酶活性; H:胞外多糖产生
Figure 2 Phenotype analyses of different Xcc strains
Note: A: HR on the non-host plant pepper ECW-10R (Capsicum
annuum cv. ECW-10R); B: Virulence on the host plant Chinese
radish (Raphanus sativus L. var. radiculus Pers.); C: Cell motility;
D: Biofilm formation; E: Activity of extracellular protease; F:
Activity of extracellular amylase; G: Activity of extracellular en-
doglucanase; H: Extracellular polysaccharide production
图 3 Xcc不同菌株的胞外蛋白酶活性
注: A: 8004; B: DM2506; C: DM2506/pcsrAEc; D: WT/pcsrAEc;
E:WT/pCsrA1-52+RsmA53-70; F:WT/pRsmA1-52+CsrA53-61
Figure 3 The extracellular protease activity of different Xcc
strains
Note: A: 8004; B:DM2506; C: DM2506/pcsrAEc; D:WT/pcsrAEc;
E:WT/pCsrA1-52+RsmA53-70; F:WT/pRsmA1-52+CsrA53-61
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基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
RsmAXcc还参与了致病和胞外酶活性的调控，而在大
肠杆菌中，CsrAE. coli并没有表现出这两项功能。那么，
究竟 CsrAE. coli是否也具有调控 Xcc致病和胞外酶活
性的功能？CsrAE. coli是否能代替 RsmAXcc在 Xcc中
的作用？因为实验已经证实，如果来自不同生物的两
个同源基因能够相互互补对方的突变体的表型，则
这两个基因的功能和作用机制是相似的。在本研究
中，我们通过用大肠杆菌的 csrA基因(csrAE. coli)去互
补 Xcc的 rsmA基因(rsmAXcc)的缺失突变体的异源互
补实验回答了这些问题。我们的实验结果除了证明
CsrAE. coli具有 RsmAXcc的所有功能外，还发现，CsrAE. coli
的 C- 末端第53~61 位氨基酸残基具有强烈抑制
Xcc蛋白酶活性的能力。由此可见，尽管 CsrAE. coli具
有 RsmAXcc 的功能，CsrAE. coli和 RsmAXcc的功能还
是有较大一定差异的。
CsrAE. coli能够完全互补 RsmAXcc突变体的表型，
除了说明 CsrAE. coli具有 RsmAXcc的这些功能外，还说
明 RsmAXcc可能与 CsrAE. coli有相似的调控机制。由于
CsrA/RsmA是通过与其靶标 mRNA结合来调控目
的基因的表达的，而 CsrA/RsmA的调控活性又受到
小 RNA的调控(Romeo, 1998; Timmermans and van
Melderen, 2010)。因此我们推测，CsrAE. coli能够识别
RsmAXcc在靶标 mRNA上结合的靶序列，而且 Rs-
mAXcc 和 CsrAE. coli 与小 RNA 结合的序列也是相似
的。目前，CsrAE. coli与靶标 mRNA以及小 RNA结合
的特异序列已经鉴定(5-RUACARGGAUGU-3 (R代
表嘌呤碱基)) (Dubey et al., 2005)但是目前 RsmAXcc
直接调控的基因以及与其结合的小 RNA还没有鉴定
出来。我们推测，RsmAXcc在靶标mRNA上结合的靶序
列可能是与 5-RUACARGGAUGU-3相似的序列。
尽管我们的实验结果已经清楚的证明，CsrAE. coli
的 C- 末端第53~61 位氨基酸残基具有强烈抑制
Xcc蛋白酶活性的能力，但其抑制 Xcc胞外蛋白酶
产生的机理还有待进一步研究。
3材料和方法
3.1本研究使用的细菌菌株和质粒以及细菌的培养
条件
表 1所列是本研究使用的质粒和菌株。
Xcc的培养：Xcc在液体丰富培养基 NYGB (蛋
白胨 5.0 g/L,酵母提取粉 3.0 g/L,甘油 20 g/L, pH 7.0)
中培养(28℃, 200转 /分摇床震荡培养)，或在固体丰
富培养基 NYGA (NYGB中添加 1.5%的琼脂粉)中培
养(28℃静置培养)。必要时加抗菌素利福平(终浓度:
50 g/mL)或 /和卡那霉素(终浓度: 25 g/mL)。
3.2质粒和菌株的构建
质粒 pcsrAEc、菌株 DM2506/pcsrAEc和WT/pc-
srAEc的构建：从 KEGG (http://www.genome.jp/dbge
t-bin/www_bget?eco+b2696)获取大肠杆菌 K-12 菌
株的 csrA基因(csrAE.. coli)的全序列(Blattner et al., 1997)，
并根据该序列设计引物 EcsrAF/EcsrR (cccgaattcct
tacctgcagcgttagccagt/cccaagcttcaacagaagaatggaggtctga,
下划线的斜体碱基为加上的 EcoRⅠ或 HindⅢ酶切
位点)，用于扩增。接着，以大肠杆菌总 DNA为模板，
以 EcsrAF/EcsrR 为引物进行 PCR 反应，扩增得到
csrAE. coli基因(包括 ATG上游的 300 bp和 TAA下游
的 200 bp)的 DNA片段(长度为 634 bp)。PCR产物测
序确证后，用 EcoRⅠ/HindⅢ双酶切，然后克隆到
pLAFR6上获得重组质粒 pcsrAEc。接着，通过三亲本接
合将 pcsrAEc分别导入 Xcc的 rsmA突变体 DM2506
和野生型菌株 Xcc8004中，得到 DM2506/pcsrAEc和
WT/pcsrAEc菌株。
质粒 pRsmA1-54 +CsrA55-61 和 pCsrA1-54 +
RsmA55-70、菌株 WT/pRsmA1-54 +CsrA55-61 和
WT/pCsrA1-54 +RsmA55-70 的 构 建 ： 首 先 以
Xcc8004的总 DNA为模板，分别以 2506PF1/EcterR
(cccgaattctgaacacttgtcctgccaagcc/cccaagcttttagtaactggac
tgctgggatttttcgcgctggatgcgctgatag, 下划线的斜体碱基
为加上的 EcoRⅠ或 HindⅢ酶切位点)或 ECSRF/Xc-
terR (cccgaattccttacctgcagcgttagccagt/cccaagctttcagtccg
aacaatcgtcgttgtgatgcgcaccggacgcaaccggctcgtcaccagcctg
gatacgctg, 下划线的斜体碱基为加上的 EcoRⅠ或
HindⅢ酶切位点)为引物进行 PCR扩增得到一个含
有启动子的编码 RsmAXcc 的第 1~52 个氨基酸与
CsrAE. coli的第 53~61位氨基酸残基融合的 RsmAXcc杂
合蛋白的的 DNA片段(长度为 331 bp)，以及一个含有
启动子的编码 CsrAE.coli的第 1~52个氨基酸与 RsmAXcc
的第 53~70位氨基酸残基融合的 CsrAE. coli杂合蛋白
的 DNA片段 (长度为 502 bp)。然后分别将这两个
DNA片段克隆到 pLAFR6的 EcoRⅠ/HindⅢ位点之
间，获得重组质粒 pRsmA1-52+CsrA53-61和 pCsrA1-
52+RsmA53-70。最后通过三亲本接合将 pRsmA1-
52+CsrA53-61和 pCsrA1-52+RsmA53-70分别导入
野生型菌株 Xcc8004 中，得到 WT/pRsmA1-52+
CsrA53-61和WT/pCsrA1-52+RsmA53-70菌株。
3.3胞外酶的检测
胞外蛋白酶检测：先将待测菌株划线接种于
345
大肠杆菌转录后调控蛋白 CsrA的 C末端具有抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性的功能
C-terminus of CsrA from E. coli Inhibits the Extracellular Protease Activity of X. campestris pathovar campestris
表 1本研究使用的细菌菌株和质粒
Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study
菌株
Strain
Xcc8004
DM2506
CDM2506
DM2506/pcsrAEc
WT/pcsrAEc
WT/pRsmA1-52+CsrA53-61
WT/pCsrA1-52+RsmA53-70
质粒
Plasmid
pLAFR6
pcsrAEc
pRsmA1-52+CsrA53-61
pCsrA1-52+RsmA53-70
特征
Relevant characteristics
Xcc野生型菌株;抗利福平(Rifr)
Xcc wild type strain; Rifampicin resistance (Rifr)
8004中基因 rsmAXcc (XC2506)缺失,抗卡那霉素(Rifr)
As 8004, but the rsmAXcc (XC2506) has been deleted, kanamy-
cin resistance (Rifr)
DM2506中含有质粒 pLrsmAXc,抗卡那霉素(Rifr)和四环素
(Tcr)
DM2506 containing the plasmid pLrsmAXc, kanamycin and
tetracycline resistance (Rifr, Tcr)
DM2506 中含有质粒 pcrsAEc, 抗卡那霉素(Rifr)和四环素
(Tcr)
DM2506 containing the plasmid pcrsAEc, kanamycin and te-
tracycline resistance (Rifr, Tcr)
8004中含有质粒 pcrsAEc,抗卡那霉素(Rifr)和四环素(Tcr)
8004 containing the plasmid pcrsAEc, kanamycin and tetracy-
cline resistance (Rifr, Tcr)
8004 中含有质粒 pRsmA1-52 +CsrA52-61, 抗卡那霉素
(Rifr)和四环素(Tcr)
8004 containing the plasmid pRsmA1-52+CsrA52-61, kanam-
ycin and tetracycline resistance (Rifr, Tcr)
8004 中含有质粒 pCsrA1-52 +RsmA53-70, 抗卡那霉素
(Rifr)和四环素(Tcr)
8004 containing the plasmid pCsrA1-52+RsmA53-70, kanam-
ycin and tetracycline resistance (Rifr, Tcr)
PK2 replicon; Mob+, Tra-; cos+,抗四环素(Tcr)
PK2 replicon; Mob+, Tra-; cos+, tetracycline resistance (Tcr)
pLAFR6中带有一个 E. coli的完整的野生型 csrA基因全序
列,抗四环素(Tcr)
pLAFR6 containing an entail E. coli csrA gene, tetracycline re-
sistance (Tcr)
pLAFR6 中带有一个编码 RsmAXcc 前 52 个氨基酸与
CsrAE. coli的第 53~61位氨基酸的融合蛋白的 DNA片段,抗
四环素(Tcr)
pLAFR6 containing an DNA fragment encoding a hybrid Rs-
mAXcc protein in which the 1st~52nd amino acid residues of Rs-
mAXcc is fused to the 53rd~61st amino acid residues of CsrAE. coli,
tetracycline resistance (Tcr)
pLAFR6 中带有一个编码 CsrAE. coli 前 52 个氨基酸与 Rs-
mAXcc的第 53~70位氨基酸的融合蛋白的 DNA片段
pLAFR6 containing an DNA fragment encoding a hybrid
CsrAE. coli protein in which the 1st~52nd amino acid residues of
CsrAE. coli is fused to the 53rd~70th amino acid residues of Rs-
mAXcc, tetracycline resistance (Tcr)
来源或参考文献
Source or reference
Daniels et al., 1984
Chao et al., 2008
Chao et al., 2008
本研究
This study
本研究
This study
本研究
This study
本研究
This study
Huynh et al., 1989
本研究
This study
本研究
This study
本研究
This study
346
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
NYGA固体培养基上活化，然后转接于 NYGB液体
培养基中，放在 28℃、200转 /分的摇床中培养过夜。
接着，取 1 mL过夜培养液至于 1.5 mL EP管中离心
沉淀菌体，再用 1 mL无菌水重悬菌体并用无菌水将
菌液浓度调为 OD600=0.2。用移液器吸取 2 μL待测菌
液接种于含 1%的脱脂乳的 NYGA平板上，28℃培养
48 h后观察和拍照。待测菌株的胞外蛋白酶活性有无
和高低与该菌落周围出现的透明圈的直径有无和大
小成正比。实验设 3个重复，以野生型菌株为对照。
胞外淀粉酶检测：浓度为 OD600=0.2的待测菌
液的准备如“胞外蛋白酶检测”所述。用移液器吸取
2μL待测菌液接种于含 0.1%可溶性淀粉的 NYGA平
板上，28℃培养 24 h后用 1:100的 I2/KI (0.08 mol/L
I2, 3.2 mol/L KI)溶液染色 10 min，然后用 70%的乙醇
脱色，然后观察和拍照。在紫黑色背景下，菌落生长处
及周围出现的无色透明圈的有无或直径大小代表待
测菌株胞外淀粉酶活性的有无和高低。实验设 3个重
复，以野生型菌株为对照。
胞外纤维素酶检测：浓度为 OD600=0.2 的待测菌
液的准备如“胞外蛋白酶检测”所述。用移液器吸取
2 μL待测菌液接种于含有 0.5% (w/v)的羧甲基纤维
素 (CMC)的 NYGA 平板上，28℃培养 24 h。再用
0.1%的刚果红(congo red)溶液 (20 mL/ 平板 )染色
30min；弃去染色液后蒸馏水漂洗两次，接着用 1mol/L
的 NaCl溶液(20 mL/平板)脱色 20 min，直至红色背
景脱色完全后观察并拍照记录。在红色背景下，菌落
生长处及周围出现的无色透明圈的有无或直径大小
代表待测菌株胞外纤维素酶活性的有无和高低。实
验设 3个重复，以野生型菌株为对照。
3.4胞外多糖检测
浓度为 OD600=0.2 的待测菌液的准备如“胞外蛋
白酶检测”所述。用移液器吸取 2 μL待测菌液接种
于含 2%的葡萄糖的 NYGA平板上，28℃培养 4 d后
观察并拍照。菌落大小、隆起和丰满程度代表待测菌
株胞外多糖产量高低。实验设 3个重复，以野生型菌
株为对照。
3.5致病性检测
寄主植物的种植：本研究采用满身红萝卜
(Raphanus sativus L. Var. radiculus Pers.)作为检测
Xcc致病性的寄主植物。将数粒萝卜种子播种于直径
为 10 cm的塑料营养钵中，置于温度为 25~30℃；光
照强度为 1 808 Lux的温室中，成苗后每钵保留 3株
幼苗。当小苗长到有 3~4片全展叶时(约 25 d左右)，
即可用于试验。
接种菌液的准备：将待测菌株在 NYGA培养基
划线接种活化后转接到 NYGB 培养基中，28℃、
200 r/min床培养 15 h，然后用 NYGB液体培养基将
菌液浓度调至 OD600=0.1。
剪叶接种：剪叶接种用剪刀需高压灭菌并烘干，
然后将刀口部分放入待接种的菌液中浸泡，使得刀
口部分沾满菌液，接着在距离叶尖 0.5 cm处，垂直于
主脉缓慢(停留 5 s)剪下叶尖。接种后的小苗先用塑
料薄膜覆盖保湿 24 h，然后在置于温度为 28℃，湿度
为 75%左右的环境中继续生长，10 d量取每张接种
叶片的病斑长度。实验设 3个重复，每个重复至少接
种 60张叶片，并使用统计分析软件对数据进行方差
分析及 t测验。
3.6过敏反应(HR)检测
辣椒的种植：本研究采用近等基因系辣椒品种
ECW-10R作为过敏反应供试植物。将辣椒 ECW-
10R种子播种于直径为 10 cm的塑料营养钵中，置于
温度为 25~30℃；光照强度为 1 808 Lux的温室中，成
苗后每钵保留 1株幼苗。当小苗长到有 5~6片全展
叶时即可用于试验。
待接种菌液的准备：将待测菌株在 NYGA培养
基划线接种活化后转接到 NYGB 培养基中，28℃、
200 r/min摇床培养过夜，然后取 1 mL过夜培养液至
于 1.5 mL EP管中离心沉淀菌体，再用 1 mL无菌水
重悬菌体并用无菌水将菌液浓度调为 OD600=0.1。
压渗接种：选取大小基本一致的辣椒全展叶作
为接种叶片并做好标记。将无菌 1 mL注射器去掉针
头，吸取 300 μL菌液，从叶片的背面轻轻将菌液压
入叶片细胞间隙内。一边压一边观察菌液在业内扩散
的水印，当水印扩展至直径 1 cm左右时即停止压渗。
接种后将辣椒苗放置在灯光下照射至少 6 h。24 h后
观察和拍照。实验设 3个重复。
3.7生物被膜形成检测
将待测菌株在 NYGA培养基划线接种活化后转
接到 NYGB 培养基中，28℃、200 r/min 摇床培养过
夜，然后将菌液按照 10%的比例转接至装有 5 mL
LB液体培养基的 25 mL指形瓶中，置于 28℃培养箱
中静置培养 5 d后观察和拍照。在液面和空气交界处
的管壁上聚集生产生长的菌体的有无和多少代表生
物被膜形成能力的强弱。实验设 3个重复。
3.8游动性检测
将待测菌株在 NYGA培养基划线接种活化后转
347
大肠杆菌转录后调控蛋白 CsrA的 C末端具有抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性的功能
C-terminus of CsrA from E. coli Inhibits the Extracellular Protease Activity of X. campestris pathovar campestris
接到 NYGB 培养基中，28℃、200 r/min 摇床培养过
夜，接着用 NYGB 培养基将过夜菌液 OD600 调为
0.5，取 5 μL 点在 0.3%琼脂糖的 NYGA 平板上，
28℃静置培养 3 d后观察和拍照。实验设 3个重复。
作者贡献
晁耐霞和唐东阶是本研究的实验设计者及负责
人；晁耐霞和黄明慧是实验研究的主要执行人；陈承
晓和覃振萍参与部分实验；唐纪良参与实验设计和
实验结果分析；晁耐霞和唐东阶完成数据分析、论文
写作及修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究所需经费获国家自然科学基金项目
(31071141)资助。
参考文献
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348