全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Dec．２０１５,３５(６):８１２－８１６　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４０７００５
羊学荣,卢凤来,王磊,等．酶水解百分之五十罗汉果皂苷V方法学研究[J]．广西植物,２０１５,３５(６):８１２－８１６
YangXR,LuFL,WangL,etal．MethodologyofenzymichydrolysisoffiftypercentmogrosideV[J]．Guihaia,２０１５,３５(６):８１２－８１６
酶水解百分之五十罗汉果皂苷V方法学研究
羊学荣１,２,卢凤来２,王　磊２,陈　兵１,２,徐　风３,蔡少青３,李典鹏２∗
(１．广西中医药大学 药学院,南宁５３０００１;２．广西植物功能物质研究与利用重点实验室,
广西植物研究所,广西 桂林５４１００６;３．北京大学 药学院,北京１００１９１)
摘　要:罗汉果是我国常用的一种中药,用于治疗干咳、口腔溃疡及便秘等,罗汉果皂苷是罗汉果果实中的主
要药效物质,为一类葫芦烷三萜皂苷类化合物.由于个别罗汉果低糖皂苷在罗汉果中含量较低,因而难以对
这些皂苷有效地进一步进行代谢或药理等研究.该研究采用RPＧHPLC监测５０％罗汉果皂苷 V的水解过
程,并对其水解条件进行正交实验优化其组合,建立了酶水解５０％罗汉果皂苷V以获取罗汉果次级皂苷的方
法.结果表明:酶水解５０％罗汉果皂苷V获得罗汉果皂苷IIIE、III、IVE和赛门苷I等次级皂苷的最佳水解条
件是pH值为５．６的乙酸－乙酸钠缓冲体系,反应温度为５５℃,βＧ葡聚糖酶活性浓度为４０万U􀅰LＧ１,罗汉果
皂苷V的反应浓度为０．２g􀅰LＧ１,水解时间为１０h.经多次验证,该水解条件重现性好,可用于从５０％罗汉果
皂苷V中水解制备罗汉果皂苷IIIE、III、IVE和赛门苷I等罗汉果皂苷.该研究结果为进一步水解其他罗汉
果次级皂苷提供了依据.
关键词:酶水解;罗汉果皂苷IIIE;罗汉果皂苷III;罗汉果皂苷IVE;赛门苷I;方法学
中图分类号:Q９４６．５　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０６Ｇ０８１２Ｇ０５
Methodologyofenzymichydrolysisof
fiftypercentmogrosideV
YANGXueＧRong１,２,LUFengＧLai２,WANGLei２,CHENBing１,２,
XUFeng３,CAIShaoＧQing３,LIDianＧPeng２∗
(１．SchoolofPharmaceuticalSciences,GuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning５３０００１,China;
２．GuangxiKeyLaboratoryofFunctionalPhytochemicalsResearchandUtilization,GuangxiInstituteofBotany,
Guilin５４１００６,China;３．SchoolofPharmaceuticalSciences,PekingUniversity,Beijing１００１９１,China)
Abstract:LuoHanGuo,thedriedfruitsofSiraitiagrosvenori,isakindoftraditionalChinesemedicineandused
forthetreatmentofdrycough,sorethroat,andconstipationetc．Previouschemicalinvestigationsrevealedthatthe
majorvalidcompoundsofS．grosvenoriiweremogrosides,belongingtocucurbitaneＧtypetriterpenes．Duetothefact
thatsomemogrosidesarelowcontentinS．grosvenori,itishardtoachieveenoughamountofthesecompoundsto
furtherstudytheirmetabolismandpharmacologyetc．SoamethodologywasestablishedinthispapertoobtaineＧ
noughmogrosidesoflowcontent(suchasmogrosideIIIE,III,IVE,andsiamenosideI)byenzymichydrolysisof
５０％ mogrosideV．ThehydrolysiswasmonitoredbyRPＧHPLCandorthogonalexperimentswasappliedtooptimize
thereactionconditions．Theexperimentresultindicatedtheoptimalreactionconditionswere:inpH５．６aceticacidＧ
sodiumacetatebufersolution,reactiontemperaturewas５５℃,βＧdextranaseconcentrationwas４００kU􀅰LＧ１,reacＧ
收稿日期:２０１４Ｇ１０Ｇ０３　　修回日期:２０１５Ｇ０４Ｇ０６
基金项目:国家自然科学基金(８１１６０３９２,８１１６０５１８);国家科技支撑计划项目(２０１１BAI０１B０３);桂林市科学研究与技术开发项目(２０１２０１１８Ｇ６).
作者简介:羊学荣(１９９０Ｇ),男,海南儋州市人,硕士研究生,主要从事天然药物资源开发与利用研究,(EＧmail)yxrxl＠sina．cn.
∗通讯作者:李典鹏,博士,研究员,主要从事药物化学成分研究,(EＧmail)ldp＠gxib．cn.
tionconcentrationofmogrosideVwas０．２g􀅰LＧ１,reactiontimewas１０h．Ithadbeenverifiedthatthemethodwas
repeatable,whichcouldbeappliedtohydrolyze５０％ mogrosideVtoobtainmogrosideIIIE,III,IVE,andsiamenoＧ
sideI．ThisresultalsocouldbeaguideforhydrolyzingotherssecondaryＧmogrosides．
Keywords:enzymichydrolysis;mogrosideIIIE;mogrosideIII;mogrosideIVE;siamenosideI;methodology
　　中药罗汉果为葫芦科植物罗汉果(Siraitia
grosvenorii)的干燥果实,性凉、味甘,具有清热润
肺、利咽开音、滑肠通便等功效,适用于肺热燥咳、咽
痛失音、肠燥便秘等症(国家药典委员会,２０１０).罗
汉果的主要有效成分为罗汉果皂苷类(mogrosides)
化合物,具有降血糖、抗癌、抗氧化、辅助降血压等功
效.罗汉果皂苷类成分的苷元为葫芦烷型四环三萜
罗汉果醇(mogrol).目前,根据苷元上的糖基的连
接位置及数目的不同,在罗汉果生长的不同时期已
分离鉴定出罗汉果皂苷 V、IVE、III、IIIE、IIE和赛
门苷I等皂苷类化合物(李典鹏等,２０００).在这些
皂苷类化合物中,罗汉果皂苷V(mogrosideV)是成
熟果实的主要成分,罗汉果皂苷IIE是未成熟果实
中含量高的成分,它们均容易通过选择合适生长期
的果实从而进行大量的提取、分离和制备,但赛门苷
I、罗汉果皂苷IVE、罗汉果皂苷IIIE等次级苷在罗
汉果果实中的含量较低,难以从原料中大量获取以
满足代谢和药理等实验研究的需要.
本研究通过酶水解罗汉果皂苷 V的方法来获
取富含罗汉果次级皂苷的混合物,并通过制备高效
液相法从混合物中大量制备赛门苷I、罗汉果皂苷
IVE和皂苷IIIE等单体.目前见诸报道的皂苷类
化合物的水解方法主要有酸水解法(郭秀洁等,
２０１０)、碱水解法(季秀美等,２０１３)、酶水解法(金东
史等,２００１)等.此外,还有乙酰解法、过碘酸裂解法
和糖醛酸苷选择性水解反应等水解方法(吴立军等,
２００７).在这些水解方法中,除酶水解法外,其他方
法有的反应条件过于强烈,不易控制反应进度;有的
易导致苷元降解和糖异构化等副反应,因此都难于
获得高得率的次级苷.相比较而言,酶水解反应条
件温和,反应过程易调控,常被运用于水解获得次级
苷的工作.因而,本研究拟通过探索酶水解粗罗汉
果皂苷V的最佳反应条件,从而解决大量制备罗汉
果皂苷V的次级皂苷的问题.
１　材料与仪器
５０％罗汉果皂苷Ⅴ粉末(桂林莱茵生物科技股
份有限公司);βＧ葡聚糖酶(５０００U􀅰mgＧ１,上海源
叶生物有限公司,批号 YY１０５９８);罗汉果皂苷 V
(纯度＞９８％,成都曼斯特生物科技有限公司,批号
MUSTＧ１３０８２９０４),罗汉果皂苷IVE对照品(纯度
＞９８％,成都曼斯特生物科技有限公司,批号
MUSTＧ１３０２０２０８)、罗汉果皂苷III对照品(纯度＞
９８％,成都曼斯特生物科技有限公司,批号 MUSTＧ
１３０１０７０３)、罗汉果皂苷IIIE对照品(纯度＞９８％,
成都曼斯特生物科技有限公司,批号 MUSTＧ
１３０１０７０６)、赛门苷I对照品对照品(纯度＞９８％,成
都 曼 斯 特 生 物 科 技 有 限 公 司,批 号 MUSTＧ
１２０９２０６);恒温水浴锅(湖北远东数控仪器厂);高效
液相色谱仪LCＧ２０A(日本岛津公司,HPLCＧDADＧ
ELSD),BS１２４S型电子天平(赛多利斯北京科学有
限公司);分析纯甲醇、乙酸钠、乙酸等(北京化工
厂);色谱纯甲醇、乙腈(色谱纯,Fisher公司);MiliＧ
QIntegral３超纯水机(美国 Milipore公司).
２　色谱条件
分析柱为 ODSInertsil® ５μm４．６×２５０mm
C/N５０２０Ｇ０１７３２,柱温３５℃,流动相为A(纯水)、B
(乙腈),流速为１．００００mL􀅰minＧ１,检测波长为２０３
nm,进样量１０μL.梯度如表１.
表１　梯度洗脱程序
Table１　Procedureofthegradientelution
时间
Time(min) ０．０１ １０ ２０ ３５ ６０ ７０ ８０
梯度B
GradientB(％) １０ １８ ２８ ４５ ９０ １００ １００
３　溶液的制备
３．１罗汉果皂苷对照品溶液的配制
精密称取罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷IVE、罗汉
果皂苷III、罗汉果皂苷IIIE、赛门苷I对照品适量,
用色谱纯甲醇配制成１．０mg􀅰mLＧ１的溶液备用.
３．２乙酸Ｇ乙酸钠缓冲液
用电子天平称取３２．８１２g乙酸钠,用水溶解得
１L乙酸钠溶液,最后用乙酸水溶液调配至pH 为
３１８６期　　　　　　　　　　羊学荣等:酶水解百分之五十罗汉果皂苷V方法学研究
５．６,即得乙酸Ｇ乙酸钠缓冲液,备用.
３．３罗汉果皂苷V反应液
分别准确称取１０g５０％罗汉果皂苷V,加入１０
mL缓冲液润湿,再加入８００mL缓冲液,同时缓慢
加热直至粗罗汉果皂苷 V完全溶解,冷却至室温,
用缓冲液定容至１０００mL,配制成５g􀅰LＧ１的罗汉
果皂苷V反应液,在４℃下保存,２d内用完.
３．４罗汉果皂苷V反应产物供试液处理
取１mL反应前、后的罗汉果皂苷V反应液,加
入３倍量甲醇沉淀蛋白终止反应,并使用微孔滤膜
进行过滤,最后使用前面的色谱条件进行分析.
４　酶水解条件研究
４．１酶的最适活性浓度考察
酶因其具有饱和性,且在水中溶解度不是很高,
所以在水解反应中过多的酶会造成浪费,而过低则
无法满足反应需要.取３．３中的罗汉果皂苷V反应
液加５倍水配制得１g􀅰LＧ１罗汉果皂苷V反应液,
加进６个预先称量好,含有βＧ葡聚糖酶的１００mL
锥形瓶中,配制成２０万、４０万、６０万、８０万、１００万、
１２０万U􀅰LＧ１等不同酶活性浓度的１g􀅰LＧ１罗汉果
皂苷 V酶水解反应液,并在酶最佳活性的条件下
(丁鑫等,２００９),即在pH值为５．６的乙酸Ｇ乙酸钠缓
冲体系中,在５５℃进行反应,最后用３．４步骤中的
方法处理、检测不同酶活性浓度下反应８h后罗汉
果皂苷V的含量(％)(在２０３nm下按面积归一化
法进行计算,下同).以酶活性浓度为横坐标,以反
应底物罗汉果皂苷V的含量(％)为纵坐标,绘制曲
线(图１).从图１可见,随酶活性浓度增大,罗汉果
皂苷V的含量(％)一直下降,在６０万U􀅰LＧ１之前,
下降速度较快,大于６０万 U􀅰LＧ１后,βＧ葡聚糖酶的
活性浓度对罗汉果皂苷 V的含量影响不大.考虑
到水解酶的成本,可以基本判断该酶水解反应的最
佳酶活性浓度范围为２０万~６０万U􀅰LＧ１.
４．２罗汉果皂苷V的反应浓度考察
由于过大浓度的罗汉果皂苷 V会相互形成干
扰,不利于酶发挥水解作用,所以底物浓度是决定酶
解反应速度的重要因素.将３．３步骤中预先配制好
的罗汉果皂苷V溶液稀释成０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、
０．７g􀅰LＧ１等６个不同浓度各５０mL的实验组溶液,
每个实验组分别添加３万 UβＧ葡聚糖酶,使得酶活
性浓度均为６０万 U􀅰LＧ１的最适酶活性浓度,最后
图１　酶活性浓度对罗汉果皂苷V水解进程的影响
Fig．１　Efectsofenzymeconcentrationonenzymic
hydrolyisof５０％ mogrosideV
在５５℃下进行反应.反应６h后,最后用３．４步骤
中的方法处理、检测罗汉果皂苷V的含量(％).以
底物罗汉果皂苷V的反应浓度为横坐标,以反应结
束时罗汉果皂苷V的含量(％)为纵坐标,绘制曲线
(图２).从图２可见,从０．２~０．７g􀅰LＧ１,随着反应
底物罗汉果皂苷V浓度的增加,反应６h后罗汉果
皂苷V的含量(％)也逐渐增加,可知底物浓度越大
反应越不完全.但是,０．２~０．３g􀅰LＧ１之间的差异
并不大,由此基本确定罗汉果皂苷Ⅴ的较佳反应浓
度区间为０．２~０．３g􀅰LＧ１.
图２　起始反应浓度对罗汉果皂苷V水解进程的影响
Fig．２　EfectsofmogrosideVinitialconcentrationon
enzymichydrolyisof５０％ mogrosideV
４．３反应时间考察
选择０．３g􀅰LＧ１的罗汉果皂苷V反应浓度,酶
活性浓度为６０万 U􀅰LＧ１,溶液为pH 值５．６的乙
酸Ｇ乙酸钠缓冲液,在５５℃下进行反应,每过１h,用
３􀆰４步骤中的方法处理、测定反应体系中罗汉果皂
苷V的含量(％).图３显示,随着反应的进行,罗
４１８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
汉果皂苷V快速被水解,８h后,水解速度变缓慢,
到１０h时,罗汉果皂苷 V剩２％左右,水解基本完
成.考虑到时间成本问题,可以确定罗汉果皂苷V
的最佳酶水解时间为８~１０h.
图３　水解反应时间对罗汉果皂苷V水解进程的影响
Fig．３　Effectsofreactiontimeonenzymic
hydrolyisof５０％ mogrosideV
表２　因素水平表
Table２　Factorsandlevelsoforthogonalexperiment
水平
Level
因素Factor
酶活性浓度
Concentrationof
enzymeactivity
(万U􀅰LＧ１)
罗汉果
皂苷V浓度
Mogroside
Vinitial
concentration
(g􀅰LＧ１)
反应时间
Reaction
time
(h)
１ ２０ ０．２ ８
２ ４０ ０．３ ９
３ ６０ ０．４ １０
４．４正交设计
用正交试验法优选最佳的酶水解５０％罗汉果
皂苷V的工艺.根据单因素实验结果,选用影响水
解效果的三个主要因素,即βＧ葡聚糖酶活性浓度
(A)、罗汉果皂苷V反应浓度(B)、反应时间(C),按
正交表L９(３４)进行三因素三水平正交试验,共进行
９次,因素水平设计见表２,考察指标为罗汉果皂苷
V含量减少值(计算方法为罗汉果皂苷V的初始含
量５０％减去反应结束时罗汉果皂苷V的含量),用
３．４步骤中的方法处理、测定样品中罗汉果皂苷 V
含量(％),正交试验结果见表３,方差分析见表４.
通过比较各因素的极差(R)可以看出,影响
５０％罗汉果皂苷 V水解效果的因素顺序为罗汉果
皂苷 V 浓度(B)＞ 酶活性浓度(A)＞反应时间
(C).比较各水平的均值 K１、K２、K３,得出５０％罗
汉果皂苷V酶水解的最佳条件为在保证酶最佳活
性条件下,采用A２B１C３组合进行酶水解反应,即采
用pH值为５．６的乙酸Ｇ乙酸钠缓冲体系,５５℃恒温
反应,酶活性浓度为４０万U􀅰LＧ１,罗汉果皂苷V反
应浓度为０．２g􀅰LＧ１,水解１０h.
表３　L９(３４)正交试验结果
Table３　L９(３４)orthogonalexperimentresults
实验号
No． A B C
空
罗汉果皂苷V
含量减少值
Decreaseof
mogrosideV(％)
１ １ １ １ １ ４０．８９
２ １ ２ ２ ２ ４３．９２
３ １ ３ ３ ３ ３２．７１
４ ２ １ ２ ３ ４５．７８
５ ２ ２ ３ １ ４７．３３
６ ２ ３ １ ２ ３６．３１
７ ３ １ ３ ２ ４７．２３
８ ３ ２ １ ３ ４１．３９
９ ３ ３ ２ １ ３５．０３
均值K１
AverageK１
３９．１７３ ４４．６３３ ３９．５３０ ４１．０８３
均值K２
AverageK２
４３．１４０ ４４．２１３ ４１．５７７ ４２．４８７
均值K３
AverageK３
４１．２１７ ３４．６８３ ４２．４２３ ３９．９６０
极差R
Range
３．９６７ ９．９５０ ２．８９３ ２．５２７
表４　方差分析表
Table４　Analysisofvariancetable
方差来源
Sourcesof
variance
偏差
平方和
S２
自由度
Degreeof
freedom
F 检验
Ftest
单侧
临界值
F０．０５(２,２)
显著性
Significance
A酶活性浓度
AConcentration
ofenzymeactivity
２３．６０９ ２ ２．４５５ １９．０００
B底物浓度
BMogrosideV
initialconcentration
１９０．０００ ２ １９．７６１ １９．０００ ∗
C反应时间
CReactiontime
１３．２７７ ２ １．３８１ １９．０００
误差Error ９．６２ ２ ４．８２
　　由表４可知,在９５％的置信水平下,底物浓度
对水解效果有显著性影响,但酶活性浓度和反应时
间均无显著性影响.这可能与实验中设计的这两个
因素的三个考察水平之间的差异较小有关.
４．５酶水解方法的重复性考察
用上述研究所得的最优方法平行水解３份粗罗
汉果皂苷V样品,用３．４步骤中的方法处理、测定样
品中罗汉果皂苷 V含量(％),其平均值为１．７８％,
RSD为１．９３％.反应终止后,反应液中水解产物的
典型高效液相色谱图见图４,观察反应液前、后的化
合物峰的保留时间及峰面积变化大小,并采用罗汉
５１８６期　　　　　　　　　　羊学荣等:酶水解百分之五十罗汉果皂苷V方法学研究
图４　５０％罗汉果皂苷V酶水解前后的液相色谱图 (２０３nm)　(１)酶水解前,(２)酶水解后;
A．罗汉果皂苷V;B．赛门苷I;C．罗汉果皂苷IVE;D．罗汉果皂苷III;E．罗汉果皂苷IIIE.下同.
Fig．４　HPLCchromatogramsof５０％ mogrosideVdetectedunder２０３nmbeforeandafterenzymichydrolyis
　(１)Beforeenzymatichydrolysis,(２)Afterenzymatichydrolysis;A．MogrosideV;B．SiamenosideI;
C．MogrosideIVE;D．MogrosideIII;E．MogrosideIIIE．Thesamebelow．
图５　罗汉果皂苷V酶水解可能反应途径
Fig．５　ProposedenzymichydrolysisreactionpathwaysofmogrosideV
果皂苷对照品对比保留时间进行定性分析,确定水
解产物主要为赛门苷I(B)、罗汉果皂苷IVE(C)、罗
汉果皂苷III(D)、罗汉果皂苷IIIE(E)等.推测酶
水解反应途径如图５所示.
５　结论
通过对５０％罗汉果皂苷V酶水解条件的研究,
确定各因素对水解反应的影响,并通过正交设计实
验,确定酶水解５０％罗汉果皂苷V的最佳反应条件
是pH值为５．６的乙酸Ｇ乙酸钠缓冲体系,反应温度
５５℃,底物浓度为０．２g􀅰LＧ１,βＧ葡聚糖酶活性浓度
为４０万U􀅰LＧ１,水解１０h后罗汉果皂苷V含量为
１．７８％.以往文献采用酶水解或酸水解方法制备罗
汉果皂苷类化合物,通常仅得到１种皂苷,而采用本
文方法则可以同时制备得到４种次级皂苷,效率更
高.经过和罗汉果皂苷的对照品对比,可以确定通
过本水解方法主要得到罗汉果皂苷IIIE、罗汉果皂
苷IVE、赛门苷I、罗汉果皂苷III等次级皂苷.该
方法的重复性良好,可用于获取上述几种罗汉果次
级皂苷类成分,为相关的代谢和药理学研究提供物
质基础.
参考文献:
DingX(丁鑫),WangDP(王德培),XuTB(徐同宝),etal．
２００９．StudyonβＧglucanenzymeactivitydeterminationconditions
(下转第８９８页Continueonpage８９８)
６１８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷