全 文 ：工 艺 技 术 食品工业科技
Vol.29, No.01, 2008
2008年第 01期　 225　
酶法水解蚕蛹蛋白制备免疫活性肽
工 艺 的 研 究
杨安树 1, 2 ,陈红兵 1, 2, ＊ ,郑功源1, 2 ,范青生1 , 2
(1南昌大学中德联合研究院 ,江西南昌 330047;
2.南昌大学食品科学教育部重点实验室 ,江西南昌 330047)
摘　要:利用复合酶水解蚕蛹蛋白制备小分子多肽 ,通过正交实验得到水解工艺的优化组合为:木 -Fla复合酶 ,酶用
量为 0.5%,底物含量为 4%(1∶25),酶解 pH为 7.0,反应温度为 60℃,酶解时间为 3h,在此条件下水解 ,小分子多肽得
率为 32.16%,同时建立了毛细管凝胶电泳测定蚕蛹多肽分子的检测方法 。碳粒廓清实验表明:蚕蛹蛋白酶水解液中
小分子多肽可增强小鼠网状内皮系统吞噬功能 。
关键词:酶水解 ,蚕蛹蛋白 ,免疫活性肽
Studyonpreparationconditionsofimmuno-activepeptidesfrom
silkwormpupaproteinbyenzymehydrolysis
YANGAn-shu1, 2 , CHENHong-bing1 , 2, ＊ , ZHENGGong-yuan1 , 2 , FANQing-sheng1, 2
(1.Jiangxi-OAIJointResearchInstitute, NanchangUniversity, Nanchang330047 , China;
2.KeyLaboratoryofFoodScienceofMinistryofEducation, NanchangUniversity, Nanchang330047 , China)
Abstract:Thelowmolecularpeptideswerepreparedfromsilkworm pupaproteinbyhydrolysiswithcompound
enzyme.Theresultsoforthogonaltestshowedthattheoptimumhydrolysisconditionswas:theblendofproteolytic
enzymeswaspapainandflavourzyme, theratioofenzymetosubstrate(E/S)was0.5 %(w/w), thesubstrate
concentrationwas4.0 % (w/v), thehydrolyzingreactionoccursat60℃ andpH7.0 for3h.Theyieldoflow
molecularpeptideswas32.16% undertheconditions.Carbonclearancetestshowedthelowmolecularpeptides
preparationfromsilkwormpupaproteincouldstrengthentheabilityofmacrophagephagocytosis.
Keywords:enzymehydrolysis;silkwormpupaprotein;immuno-activepeptides
中图分类号:TS201.2+1　　　　文献标识码:B　　　　文 章编 号:1002-0306(2008)01-0225-03
收稿日期:2007-06-20　＊通讯联系人
作者简介:杨安树(1972-),男 , 助理研究员 ,主要从事食品科学与纳
米技术方面的研究。
　　蚕蛹是蚕丝业的主要副产物 ,不仅来源丰富 ,而
且具有较高的营养价值 。据报道 ,干蛹中蛋白质达
40%左右 ,含有 18种氨基酸 ,配比均衡 ,且人体必需
氨基酸含量丰富 ,其生物效价与酪蛋白和大豆蛋白
相当 [ 1 ～ 4] ,是一种优质蛋白质资源 ,急待开发和利用 。
但长期以来 ,国内生产的蚕蛹蛋白制品主要为蚕蛹
蛋白粉 ,其水溶性差 ,且异味物质及色素的脱除不彻
底 ,特别是经水溶胀后 ,异味和色泽更为严重 ,不容
易被大部分消费者接受。目前 , 蚕蛹大多作为鱼 、
鸡 、鸭 、猪等饲料 ,利用价值很低 ,亟待进行深加工处
理 。水解蚕蛹蛋白制备低分子多肽或氨基酸系列产
品是开发蚕蛹资源最有效的途径之一 ,这些多肽或
氨基酸具有多种生理功能 。水解蚕蛹蛋白有酸水
解 、酶水解和碱水解等方法 [ 5] ,其中酶水解反应条件
温和 ,对蛋白质的水解有较一定的专属性 ,但目前国
内的蛋白酶极大多数采用动物蛋白酶单酶水解工
艺 ,反应条件严格 ,且水解率不高。因此 ,本实验探
讨复合酶水解蚕蛹蛋白制备免疫活性多肽工艺研
究 ,为提高蚕蛹资源的开发和增加附加值提供
依据 。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
蚕蛹　江西省永新县茧丝绸有限责任公司;胰
酶(2万 U/g)、中性蛋白酶 AS1398(10万 U/g)　无
锡酶制剂厂;精制木瓜蛋白酶(60万 U/g)　广州远
天酶制剂公司;复合蛋白酶 (27万 U/g)、Protamex
(1.5AU/g)、Flavourzyme(1000LAPU/g)Novozyme;多
肽分子量标准品 (分子量为 2.512 ～ 16.946kDa)　
Pharmacia公司。
超级恒温水浴锅　上海衡平仪器仪表厂;高速
冷冻离心机　Backman公司;夹心式垂直板电泳槽 、
DYY-Ⅲ-5型稳压稳流电泳仪　北京六一仪器厂;毛
细管电泳仪　美国贝克曼库尔特有限公司;超滤离
心管　德国赛多利斯公司。
DOI :10.13386/j.issn1002-0306.2008.01.004
食品工业科技 工 艺 技 术
　　ScienceandTechnologyofFoodIndustry
226　 　2008年第 01期
1.2　实验方法
1.2.1　蚕蛹脱脂处理 　称取一定量蚕蛹粉 ,用石油
醚(30～ 60℃)提取 6h,反复 3次 ,合并提取液用旋转
蒸发仪浓缩 ,得油脂 ,抽提后的固体物料经 80℃干燥
数小时 ,得脱脂蚕蛹粉 。
1.2.2　蛋白质的测定　凯氏定氮法 , GB5009.5-85。
1.2.3　蚕蛹蛋白酶水解 [ 6] 　称取一定量的脱脂蚕蛹
粉 ,加蒸馏水至一定的重量 /体积比 ,一定温度恒温
0.5h使脱脂蚕蛹粉充分溶胀后 ,进行匀浆处理。用
1mol/L的 NaOH或 1mol/L的 HCl溶液调 pH至蛋白
酶的最适作用 pH,加入一定量的蛋白酶 ,开始水解 ,
并不断地滴入一定浓度的 NaOH或 HCl维持溶液的
pH恒定 。记录水解时间和所加入的 NaOH或 HCl
溶液的体积 ,反应至设定时间后 ,煮沸 10min,酶灭
活 、冷却后 ,调溶液 pH至 7.0, 8000r/min离心分离
15min,取上清液 。沉淀用适量蒸馏水洗涤一次 ,
8000r/min离心分离 ,合并上清液 ,并记录体积 。凯
氏定氮测定中性水解液中蛋白质的含量 ,计算蛋白
质得率 。
蛋白质得率(%)=水解溶液中蛋白质总量(g)脱脂蚕蛹粉的量(g)
×100%
1.2.4　毛细管凝胶电泳分析蚕蛹蛋白酶水解液中多
肽　利用毛细管十二烷基磺酸钠(SDS)凝胶电泳分
离蛋白质样品时 ,蛋白质与 SDS以 1∶1.4的比例结合
带上负电后 ,结合物按分子量大小分离 ,分子量小的
先出峰 ,分子量大的后出峰 。标品由 OrangeG和七种
蛋白质组成 ,包括:α-乳白蛋白 、CarbonicAnhydrase、
卵白蛋白 、牛血清白蛋白 、磷酸化酶 B、β-牛乳糖 、肌
浆球蛋白 , 电泳条件经实验优化 , 确定为:柱温为
20℃,分离电压为 25kV,进样压力为 20psi,进样时间
为 30s,所得图谱为标品的电泳图谱(见图 1)。整个
电泳图谱按分子量大小分为 9段区域。毛细管凝胶
电泳分离标品时 ,蛋白质分子量的对数值应与其相
对保留时间的倒数(1/RMT)成线性关系 ,本方法建
立的回归方程为:y=-5.6609x+7.0761, R2 =
0.9954 ,说明线性关系好 ,方法可靠。
图 1　标品毛细管凝胶电泳图谱
在同一条件下 ,蚕蛹蛋白酶水解液经毛细管凝
胶电泳后 ,所得的电泳图谱与上述标品的电泳图谱
进行叠加 ,在 9个区域内进行峰面积积分 ,通过峰面
积可计算不同分子量范围多肽占水解溶液中蛋白质
的百分率 。小分子多肽得率 =蛋白质得率 ×小分子
多肽百分率
1.2.5　SDS-PAGE电泳分析　采用不连体系 SDS-
PAGE电泳 ,浓缩胶浓度为 5%,分离胶浓度为 20%,
恒流电泳后 , 经考马斯亮蓝 R250染色 、醋酸脱色。
标准蛋白分子量范围为 2.51～ 16.9kDa之间的 7种
多肽 。
1.2.6　碳粒廓清实验 [ 7] 　取小鼠 30只 ,雌雄各半 ,随
机分 3组 ,每组 10只:对照组 、蛋白水解液低剂量组
(简称低剂量组)和蛋白水解液高剂量组(简称高剂
量组)。对照组每只小鼠以生理盐水 0.2mL灌胃;
低 、高剂量组分别以蛋白水解液 10mL/kg、20mL/kg
灌胃 。每日灌胃 1次 ,连续 10d。最后一次给药后
24h,尾静脉注射 1∶7印度墨汁 0.1mL/10g。注射后 ,
5、15min于眼静脉窦取血 20μL,置于含 Na2 CO3溶液
2mL的小试管内 。实验结束处死小鼠 ,称肝 、脾重
量。含血的标本于 630nm波长比色 。按下式计算吞
噬指数 K及吞噬系数(校正吞噬系数)α:
K=lgC1 -lgC2T2 -T1 　α=
W
WLS
3 K
式中 C为血中碳粒浓度 , T为时间 , W为体重 ,
WLS为肝脾合重。
2　结果与讨论
2.1　单一酶水解蚕蛹蛋白的研究
选用几种单酶 ,在其最适宜的作用条件下 [ 8 ] ,分
别对蚕蛹蛋白进行水解。近年来 ,研究发现食物蛋
白质酶解产物中的一些短肽具有广泛的生理调节功
能 [9 ～ 11 ] 。因此 , 本研究以分子量小于 2.87kDa(即
OrangeG的分子量)的多肽在水解液的百分含量来评
价各单酶水解蚕蛹蛋白的效果 ,结果见表 1。
表 1　单酶对蚕蛹蛋白酶水解的影响
酶的种类 水解条件温度(℃) pH
小分子多肽
百分率(%)
胰酶 45 8.2 8.17
精制木瓜蛋白酶 65 7.0 25.62
复合蛋白酶 40 7.0 11.89
Protamex 55 7.0 14.85
中性蛋白酶 AS1398 60 7.0 11.73
Flavourzyme 55 7.3 24.04
　　由表 1可知:精制木瓜蛋白酶水解效果最好 ,其
次为 Flavourzyme。不同蛋白酶对原料中蛋白的水解
部位也有差异 ,因此 ,根据表 1中数据设计下面复合
酶水解工艺。
2.2　复合酶水解工艺的研究
酶水解方案的设计:几种单酶复合使用(其比例
为 1∶1∶1),并以酶的组合 、酶用量 、底物浓度 、pH、水
解温度 、时间为影响因素 ,设计 6因素 5水平的正交
实验 ,以蛋白质得率和小分子多肽得率为评价指标 ,
实验设计如表 2 ,结果表略 。
由实验结果极差分析可看出:对小分子多肽得
率影响最大的是酶解温度 ,其次是 pH、酶解时间 、底
物浓度和酶的组合 ,最小为酶用量 。最优的实验组
合为 A5B2C5D2 E4F3 ,即使用木-Fla复合酶 ,酶用量为
0.5%,底物浓度为 1∶25, 水解 pH为 7.0, 温度为
60℃,酶解时间 3h。
由于不同的酶对蛋白质的酶切位点不一样 ,不
同复合酶对蚕蛹蛋白水解后多肽分子量大小不一 ,
所得的低分子多肽得率不一样 ,其中木-Fla复合酶
工 艺 技 术 食品工业科技
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表 2　酶水解因素及水平
水平 因素A酶的组合 B酶用量(%) C底物浓度＊ DpH E温度(℃) F时间(h)
1 胰-木-Fla 0.1 1∶5 6.5 45 1
2 1398-木-Fla 0.5 1∶10 7.0 50 2
3 复-木-Fla 1.0 1∶15 7.5 55 3
4 Pro-木-Fla 1.5 1∶20 8.0 60 4
5 木-Fla 2.0 1∶25 8.5 65 5
注:＊底物浓度为脱脂蚕蛹干粉与水的固液比 , 上述酶名称为简写。
得率为最高 ,其次是 Pro-木-Fla,再次是复-木-Fla、
胰-木-Fla,最低是 1398-木-Fla。
酶用量对蚕蛹蛋白水解的小分子多肽得率影响
不大 ,从经济角度考虑 ,酶用量为 0.5%时最合适 。
底物浓度为 1∶25时 ,小分子多肽得率最高 ,因为
底物浓度太大 ,太粘稠 ,不利于蚕蛹蛋白的酶水解。
水解 pH为 7.0时 ,小分子多肽得率最高 ,水解时
pH太高或太低 ,蛋白酶的活性受影响;另一方面 ,由于
pH7.0远离蚕蛹蛋白的等电点 ,使其易受蛋白酶作用。
水解温度由 45℃升高 60℃时 ,小分子多肽得率
增加;而当温度继续上升时 ,小分子多肽得率呈现下
降趋势 ,这可能是由于温度过高导致部分蛋白酶
失活。
随酶解时间的延长 ,小分子多肽得率迅速升高 , 3h
后 ,小分子多肽得率变化不明显。这是因为随着水解
的进行 ,蛋白质底物逐渐减少 ,酶解速度降低 ,水解时
间过长 ,酶易失活和污染 ,导致催化水解能力下降 ,另
外水解产物的积累反过来可能对酶本身也会有抑制作
用 ,因此酶解速度起始快 ,后面逐渐减慢。
2.3　正交优化组合实验酶解测定
以优化实验组合 A5B2C5D2E4F3 为水解条件 ,酶
解后蛋白质得率为 57.24%, 小分子多肽得率
为 32.16%。
以小分子量标准蛋白为 Marker,对蚕蛹蛋白酶
水解物进行 SDS-PAGE电泳 ,小分子多肽电泳与一
般高分子蛋白电泳相比 ,所需的凝胶浓度高 ,电泳时
间较长 。电泳图谱如图 2,可看出蚕蛹蛋白酶水解液
电泳图谱为一连续的条带 ,水解产物绝大部分分子
量低于 10.7kDa。
图 2　SDS-PAGE电泳图谱
(泳道 1:小分子标准蛋白;泳道 2:蚕蛹蛋白酶水解液)
2.4　蚕蛹蛋白酶水解液对小鼠免疫系统的影响
以优化后的水解工艺制备水解产物 ,利用截留
分子量为 3kDa的超滤装置对水解液进行超滤 ,滤液
用于小鼠免疫动物实验 ,实验结果见表 3。
由表 3可看出:高剂量组(20mL/kg)蚕蛹蛋白酶
水解液对小鼠网状内皮系统吞噬功能影响不明显;
低剂量组(10mL/kg)蚕蛹蛋白酶水解液可增强小鼠
网状内皮系统吞噬功能 ,与对照组相比 ,其差异有显
著性(P<0.05)。
表 3　各组碳粒廓清校正吞噬系数(α)比较
组别 例数 α值
正常组 10 4.25±0.42
高剂量组 10 4.41±1.01
低剂量组 10 5.24±1.10＊
注:＊表示 P<0.05与对照组相比。
3　结论
通过对正交实验数据分析 ,酶水解蚕蛹蛋白优
化工艺组合为:木-Fla复合酶 ,酶用量为 0.5%,底物
浓度为 1∶25,酶解 pH为 7.0,温度为 60℃,酶解时间
为 3h。蚕蛹蛋白酶水解液经 SDS-PAGE电泳图谱为
一连续的条带 , 水解产物绝大部分分子量低于
10.7kDa。低剂量组(10mL/kg)蚕蛹蛋白酶水解液可
增强小鼠网状内皮系统吞噬功能 ,本品对非特异性
免疫有增强作用。
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