全 文 ：广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ　Ｊａｎ．２０１３，３３（１）：１１２－１１７　　　　　　　　　　 ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌ．ｇｘｚｗ．ｇｘｉｂ．ｃｎ
　
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１３．０１．０２０
时贞颂，于大永，彭倩，等．金花茶种子诱导人子宫颈癌ＨｅｌａＳ３细胞凋亡及其作用机理的研究［Ｊ］．广西植物，２０１３，３３（１）：１１２－１１７
Ｓｈｉ　ＺＳ，Ｙｕ　ＤＹ，Ｐｅｎｇ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈａｓｅｅｄｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ＨｅｌａＳ３ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ，
２０１３，３３（１）：１１２－１１７
金花茶种子诱导人子宫颈癌ＨｅｌａＳ３
细胞凋亡及其作用机理的研究
时贞颂，于大永，彭　倩，史丽颖＊，冯宝民，王永奇
（大连大学 药物研究所，大连１１６６２２）
摘　要：为探讨金花茶种子诱导人子宫颈癌 ＨｅｌａＳ３细胞凋亡的机制，以不同浓度金花茶种子乙醇提取物的
正丁醇萃取物处理人子宫颈癌 ＨｅｌａＳ３细胞后，分别采用流式细胞仪、Ｗｅｓｔｅｒｎ印记法等检测对细胞凋亡及
Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２、Ｂｉｄ等表达的影响。结果表明：金花茶种子乙醇提取物的正丁醇萃取物作用于人子宫颈癌 ＨｅｌａＳ３
细胞后，细胞凋亡增加，Ｂａｘ蛋白表达提高，Ｂｃｌ－２蛋白表达降低，Ｂｉｄ蛋白活性减弱，线粒体膜电位下降及
Ｃａｓｐａｓｅ－８，Ｃａｓｐａｓｅ－３活性增强。金花茶种子乙醇提取物的正丁醇萃取物为其重要的抗肿瘤活性有效部位，并
可能通过激活Ｂａｘ及Ｃａｓｐａｓｅ－３，Ｃａｓｐａｓｅ－８，抑制Ｂｃｌ－２和Ｂｉｄ来诱导 ＨｅｌａＳ３细胞凋亡。
关键词：金花茶；人子宫颈癌；ＨｅｌａＳ３细胞；细胞凋亡
中图分类号：Ｒ２８５．５　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１０００－３１４２（２０１３）０１－０１１２－０６
＊ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈａ
ｓｅｅｄｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ
ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ＨｅｌａＳ３ｃｅｌｓ
ＳＨＩ　Ｚｈｅｎ－Ｓｏｎｇ，ＹＵ　Ｄａ－Ｙｏｎｇ，ＰＥＮＧ　Ｑｉａｎ，ＳＨＩ　Ｌｉ－Ｙｉｎｇ＊，
ＦＥＮＧ　Ｂａｏ－Ｍｉｎ，ＷＡＮＧ　Ｙｏｎｇ－Ｑｉ
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍａｔｅｒｉａ　Ｍｅｄｉｃａ，Ｄａｌｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ　１１６６２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈａｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ＨｅｌａＳ３
ｃｅｌｓ．Ｈｕｍａｎ　ＨｅｌａＳ３ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢｕＯＨ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ＥｔＯＨ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ
Ｃ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈａａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ），ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢｕＯＨ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ＥｔＯＨ　ｅｘ－
ｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｃ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈａｏｎ　ｈｕｍａｎ　ＨｅｌａＳ３ｃｅｌｓ，ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ，ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｘ　ｗａｓ　ｅｎｈａｎｃｅｄ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｃｌ－２ａｎｄ　Ｂｉｄ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｍｅｍ－
ｂｒａｎｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＭＭＰ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ－８ａｎｄ　Ｃａｓｐａｓｅ－３ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅ　ＢｕＯＨ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ
ＥｔＯＨ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｃ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈａ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｅ　ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　ｆｒａｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｍｏｔｅｄ　ｈｕｍａｎ　ＨｅｌａＳ３ｃｅｌｓ
ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｐｏｓｓｉｂｌｙ　ｂｙ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　Ｂａｘ，ＭＭＰ，Ｃａｓｐａｓｅ－８ａｎｄ　Ｃａｓｐａｓｅ－３，ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　Ｂｃｌ－２ａｎｄ　Ｂｉｄ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈａ；ｈｕｍａｎ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ；ＨｅｌａＳ３ｃｅｌｓ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
＊ 收稿日期：２０１２－０８－２０　　修回日期：２０１２－１０－２５
基金项目：国家自然科学基金（８１００２６２１）
作者简介：时贞颂（１９８６－），女，山东泰安人，硕士研究生，主要从事天然产物的开发与研究工作，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｓｚｓ１９８６０２０２＠１６３．ｃｏｍ。
＊通讯作者：史丽颖，博士，副教授，主要从事天然活性物质研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｓｈｉｌｉｙｉｎｇ９９０７４＠１６３．ｃｏｍ。
　 　 金 花 茶 （Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈａ）系 山 茶 科
（Ｔｈｅａｃｅａｅ）山茶属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）金花茶组植物（ｓｅｃ－
ｔｉｏｎ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈａ　Ｃｈａｎｇ）。２０世纪６０年代在广西
“十万大山”首次发现黄花山茶，而震惊世界。并以
花瓣玉蕊、腊质金黄、高贵雅致而轰动世界花卉界。
国内将金花茶誉为“茶族皇后”、“植物界的大熊猫”，
国外则称之为“幻想中的黄色山茶”。被列为国家一
级重点保护植物（梁盛业等，２００５；韦霄等，２００６）。
金花茶不仅有较高的观赏价值，而且具有一定的药
用价值和营养价值。其叶和花为壮族民间用药，主
要用于咽喉炎、痢疾、高血压、便血、月经不调 （黄燮
才，１９９４；王永奇等，２００６）。我们在对山茶属植物抗
肿瘤活性的研究中发现，金花茶种子具有较强的抗
肿瘤作用，其中金花茶种子乙醇提取物的正丁醇萃
取物（ＣＣＥＢ）显示了较强的抑制人子宫颈癌 ＨｅｌａＳ３
细胞增殖的作用。因此本研究将进一步探讨金花茶
种子乙醇提取物的正丁醇萃取物诱导人子宫颈癌
ＨｅｌａＳ３细胞凋亡及其相关机制。
１　材料和方法
１．１金花茶种子的提取
金花茶种子采集于广西南宁，由广西林业科学
研究院高级工程师梁盛业鉴定。取金花茶种子１００
ｇ，粉碎后用９５％乙醇回流提取３次，每次３ｈ，合并
提取液，减压浓缩成浸膏，加适量水分散，依次用石
油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取液分别浓缩至
浸膏，得乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水溶部分，减
压浓缩并真空干燥后得到各部分的浸膏，取正丁醇
部分的浸膏用ＤＭＳＯ配成各浓度溶液备用。
１．２细胞培养
人子宫颈癌 ＨｅｌａＳ３细胞株从 Ｈｕｍａｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｂａｎｋ（日本人类科学基金会，东
京，日本）获得，培养于含有１０％热灭活小牛血清的
ＤＭＥＭ培养液中，３７℃，５％ＣＯ２，饱和湿度条件下
培养。选取对数生长期细胞进行实验。
１．３体外细胞增殖抑制实验
噻唑蓝比色法 （ＭＴＴ）检测细胞生长情况，
ＨｅｌａＳ３细胞分别种于９６孔培养板，每个孔细胞数
为５×１０３，培养于ＤＭＥＭ 培养液中，在３７℃，５％
ＣＯ２ 条件下培养２４ｈ。培养２４ｈ后，以ＰＢＳ冲洗
细胞，然后分别加入新的培养液和系列浓度的待测
样品。实验组设６个药物浓度组，每组药物的终浓
度分别为５、１０、２０、４０、８０、１６０μｇ／ｍＬ，对照组加入
同样浓度的二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），培养２４ｈ。培养
结束前４ｈ每孔加入２０μＬ　ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ），
离心弃上清，加入２００μＬ　ＤＭＳＯ充分溶解结晶物，
测定酶标仪５７０ｎｍ处吸光度值。因为吸光度值与
培养液中活细胞数成正比，所以通过吸光度值可以
计算细胞存活百分率。
１．４ＤＮＡ片断化检测
采用改良的Ｓｅｌｉｎｓ－Ｃｏｈｅｎ法进行ＤＮＡ片段化
分析（Ｓｅｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７；Ｈｏｐｃｉａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６；Ｙｕ　ｅｔ
ａｌ．，２００７），用细胞裂解液 （１０ ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ，１
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，ｐＨ７．５）裂解
细胞，离心（１３　０００ｇ，１０ｍｉｎ），分离上清液和沉淀。
将上清液和沉淀分别在４ ℃，１２．５％三氯乙酸
（ＴＣＡ）中进行沉淀，将上述沉淀分别用５％三氯乙
酸在９０℃水解２０ｍｉｎ后，用二苯胺试剂进行定量
分析。ＤＮＡ片段化率以每份样品上清液中 ＤＮＡ
的含量占总ＤＮＡ含量的百分比来计算。
１．５细胞凋亡流式细胞仪分析
流式细胞分析中采用碘化丙啶（ＰＩ）和异硫氰酸
荧光素（ＦＩＴＣ）标记的膜联蛋白 Ｖ（Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ）
（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）来检测早期凋亡
终点指示剂磷脂酰丝氨酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）的
表达（ｖａｎ　Ｈｅｅｒｄｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）。不同浓度的样品
处理细胞后，取完整的细胞在３７℃培养６ｈ，以４℃
ＰＢＳ冲洗后１　２００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ。离心后细胞
用Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＦＩＴＣ试剂盒带有的结合缓冲液稀释
至１０５ｃｅｌｓ／ｍＬ，加５μＬ　ＦＩＴＣ标记的 Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ
和５μＬ　ＰＩ至上述细胞悬浮液中，混匀。在４℃避
光培养１０ｍｉｎ后，用流式细胞仪（Ｅｐｉｃｓ　ＸＬ，Ｂｅｃｋ－
ｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）进行分析。
１．６线粒体膜电位检测
阳离子荧光染料四甲基罗丹明甲酯（ｔｅｔｒａｍ－
ｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ，ＴＭＲＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）对线粒体膜电位（Ｍｉｔｏｃｈｏｎ－
ｄｒｉａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＭＭＰ）产生响应而聚集在
线粒体中，当 ＭＭＰ下降而被释放。加入不同浓度
样品处理细胞，在３７℃培养６ｈ，收集细胞，ＰＢＳ冲
洗后１　２００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ。以１０ｎｍｏｌ／Ｌ 的
ＴＭＲＭ在１ｍＬ含１％小牛血清的ＰＢＳ中染色细胞
１５ｍｉｎ后，立即在流式细胞仪上以红色荧光（激发波
长４８８ｎｍ，发射波长５７５ｎｍ）进行测定（Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，
２００７，２００８）。ＭＭＰ降低０．１～１２个对数分数窗格的
３１１１期　　　　时贞颂等：金花茶种子诱导人子宫颈癌 ＨｅｌａＳ３细胞凋亡及其作用机理的研究
细胞被计数，以此计算 ＭＭＰ降低细胞的百分率。
１．７细胞内ｃａｓｐａｓｅ－３活性检测
Ｃａｓｐａｓｅ　８活性检测试剂盒是基于 Ｃａｓｐａｓｅ　８
可以催化底物 Ａｃ－ＩＥＴＤ－ｐＮＡ产生黄色的ｐＮＡ（ｐ－
ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ），从而可以通过测定吸光度来检测
Ｃａｓｐａｓｅ　８的活性。ｐＮＡ在４０５ｎｍ附近有强吸收。
收获细胞正常或凋亡细胞，ＰＢＳ洗涤，制备细胞裂
解液，加Ａｃ－ＩＥＴＤ－ｐＮＡ，３７℃反应１ｈ，荧光分光光
度计（Ｐｏｌａｒｓｔａｒ）分析荧光强度（激发光波长３８０
ｎｍ，发射光波长为 ４３０～４６０ｎｍ）（Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，
２００７）。
使用ＣａｓｐＧＬＯＷＴＭ活化Ｃａｓｐａｓｅ－３原位染色
试剂盒（ＭＢＬ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）检测细胞内ｃａｓｐａｓｅ－３
活性。以ＦＩＴＣ标记的ｃａｓｐａｓｅ－３抑制性底物多肽
ＤＥＶＤ（ＦＩＴＣ－ＤＥＶＤ－ＦＭＫ）作为原位（ｉｎ　ｓｉｔｕ）的
荧光标志（Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，２００７，２００８）。因为 ＦＩＴＣ－
ＤＥＶＤ－ＦＭＫ的细胞膜通透性很好，在凋亡细胞中
可与活化的ｃａｓｐａｓｅ－３不可逆的结合，结合后ＦＩＴＣ
所发射的荧光信号可用流式细胞术检测，其荧光量
反映活化ｃａｐａｓｅ－３的量。加入不同浓度样品处理
细胞，在３７℃培养６ｈ，收集细胞，然后将细胞溶液
（１×１０６　ｃｅｌｓ／ｍＬ）分装到样品管中，每３００μＬ细胞
溶液中加入１μＬ　ＦＩＴＣ－ＤＥＶＤ－ＦＭＫ，３７ ℃培养
０．５ｈ。在３　０００ｒ／ｍｉｎ离心细胞５ｍｉｎ，移去上清
液，将细胞重新分散在０．５ｍＬ的洗涤缓冲液后离
心。再重新将细胞分散在５００μＬ洗涤缓冲液中，在
流式细胞仪上用ＦＬ－１通道进行分析。
１．８Ｗｅｓｔｅｒｎ印记分析
收集细胞后以冷的ＰＢＳ冲洗，在每５０μＬ裂解
缓冲液（１ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，１％ Ｎｏｎｉ－
ｄｅｔ　Ｐ－４０（ｖ／ｖ），１％脱氧胆酸钠，０．０５％ＳＤＳ，１ｍｍｏｌ／
Ｌ苯甲基磺酰氟）中１０６ 个细胞的细胞密度下将细胞
裂解２０ｍｉｎ。超声后裂解液在４℃下１２　０００ｒ／ｍｉｎ
离心１０ｍｉｎ，用Ｂｉｏ－Ｒａｄ蛋白质双向电泳系统测定上
清液中所含蛋白。每份样品中取３０μＬ上述上清
液，加入５μＬ　ＳＤＳ上样缓冲液（６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－
ＨＣｌ，２０％ ＳＤＳ，５％ ２－巯基乙醇，１０％ 甘 氨酸，
０．００１％溴酚蓝）混匀，煮沸变性５ｍｉｎ，经 ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ电泳后转移至硝酸纤维素膜上。
分别使用特异性抗－Ｂｃｌ－２单克隆抗体、抗－Ｂａｘ
多克隆抗体、抗－Ｂｉｄ多克隆抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏ－
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ）和抗－β－ａｃｔｉｎ单克
隆抗体（Ｓｉｇｍａ）进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ印记分析来检测Ｂｃｌ－
２、Ｂａｘ、Ｂｉｄ和β－ａｃｔｉｎ的表达。以 ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄ－
ｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）标记兔抗小鼠ＩｇＧｓ作为二抗，在
ＥＣＬ 系 统 （Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｈｉｎｇｈａｍ－
ｓｈｉｒｅ，ＵＫ）中使Ｘ光胶片感光记录条带信号，采用
Ｖｉｌｂｅｒ　Ｌｏｕｒｍａｔ　Ｂｉｏ－Ｐｒｏｆｉｌｅ系统的ＢＩＯ－ＩＤ分析软
件测定条带光密度（Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，２００７，２００８）。
１．９统计分析
实验结果以均值±标准差表示，采用统计学ｔ
检验进行组间比较分析，Ｐ＜０．０５为差异有显著性。
所有的实验都重复３次。
２　结果与分析
２．１ＣＣＥＢ对ＨｅｌａＳ３细胞增殖的抑制作用
用浓度分别为５、１０、２０、４０、８０、１６０μｇ／ｍＬ的
金花茶种子乙醇提取物的正丁醇萃取物（ＣＣＥＢ）处
理ＨｅｌａＳ３细胞，采用 ＭＴＴ法检测不同浓度的样品
对 ＨｅｌａＳ３细胞增殖的影响。结果发现ＣＣＥＢ显示
了较强地抑制 ＨｅｌａＳ３细胞增殖的作用，其ＩＣ５０为
１０２．２０μｇ／ｍＬ，结果见图１。
图１　ＣＣＥＢ对 ＨｅｌａＳ３细胞增殖的影响
Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＣＣＥＢ　ｏｎ　ｃｅｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ｉｎ　ＨｅｌａＳ３ｃｅｌｓ
２．２ＣＣＥＢ诱导ＨｅｌａＳ３细胞凋亡的作用
为了考察 ＣＣＥＢ诱导 ＨｅｌａＳ３细胞凋亡的作
用，检测了ＣＣＥＢ对 ＨｅｌａＳ３细胞ＤＮＡ片段化的影
响。分别用 ９０、１２０、１５０μｇ／ｍＬ 的 ＣＣＥＢ 处理
ＨｅｌａＳ３细胞，测定ＤＮＡ片段化率，结果如图２所
示。和对照组相比各样品处理组 ＨｅｌａＳ３细胞的
ＤＮＡ片段化率均显著升高，且与剂量相关。
采用 Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＦＩＴＣ／ＰＩ双标记流式细胞术
检测细胞早期凋亡率。ＣＣＥＢ作用 ＨｅｌａＳ３细胞，在
浓度为１２０μｇ／ｍＬ时，ＨｅｌａＳ３细胞早期凋亡率增
４１１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
加到２０．６％，在浓度为１５０μｇ／ｍＬ时，ＨｅｌａＳ３细胞
早期 凋 亡 率 增 加 到 ３６．３％，结 果 见 图 ３：Ａ。
Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（Ｃａｓｐａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｚ－
ＶＡＤ－ＦＭＫ）是一种可以穿透细胞膜的泛 Ｃａｓｐａｓｅ
抑制剂（Ｃｅｌ　ｐｅｒｍｅａｂｌｅ　ｐａｎ　ｃａｓｐａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ），可以
抑制由Ｃａｓｐａｓｅ激活导致的细胞凋亡。从图３：Ｂ中
我们可以看到 Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂可以显著地抑制
ＣＣＥＢ引起的细胞早期凋亡，表明ＣＣＥＤ在 ＨｅｌａＳ３
细胞中引起的凋亡可能与Ｃａｓｐａｓｅ的激活有关。
图２　ＣＣＥＢ对 ＨｅｌａＳ３细胞ＤＮＡ片段化的影响
Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＣＣＥＢ　ｏｎ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｉｎ　ＨｅｌａＳ３ｃｅｌｓ
２．３ＣＣＥＢ对ｃａｓｐａｓｅ依赖性线粒体途径的影响
为考察 ＣＣＥＢ诱导 ＨｅｌａＳ３细胞凋亡是否与
ｃａｓｐａｓｅ依赖性线粒体途径相关，检测了ＣＣＥＢ对
ＨｅｌａＳ３细胞 ＭＭＰ和细胞内ｃａｓｐａｓｅ－８和ｃａｓｐａｓｅ－３
活性的影响。分别用９０、１２０、１５０μｇ／ｍＬ的ＣＣＥＢ
处理 ＨｅｌａＳ３细胞，ＴＭＲＭ 染色，在流式细胞仪上
测定，计算 ＭＭＰ降低细胞的百分率，结果见图４。
ＣＣＥＢ导致 ＨｅｌａＳ３细胞 ＭＭＰ下降，且下降程度与
剂量相关。在 ＣＣＥＢ 浓度为 １００μｇ／ｍＬ 时，有
４２．４％的细胞出现线粒体膜电位显著下降。然后分
别检测ＣＣＥＢ对 ＨｅｌａＳ３细胞ｃａｓｐａｓｅ－８和ｃａｓｐａｓｅ－
３活性的影响。浓度为 ９０、１２０、１５０μｇ／ｍＬ 的
ＣＣＥＢ作用于 ＨｅｌａＳ３细胞，分别导致ｃａｓｐａｓｅ－８和
ｃａｓｐａｓｅ－３活性显著增加，结果见图５和图６。上述
结果表明，ＣＣＥＢ诱导 ＨｅｌａＳ３细胞凋亡与ｃａｓｐａｓｅ
依赖性线粒体途径相关。
２．４ＣＣＥＢ对凋亡相关蛋白表达的影响
Ｂｃｌ－２家族蛋白包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，
在细胞凋亡过程中调控细胞色素ｃ、凋亡诱导因子的
释放。采用 Ｗｅｓｔｅｒｎ印记分析法检测 ＣＣＥＢ 对
图３　ＣＣＥＢ对 ＨｅｌａＳ３细胞凋亡的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＣＣＥＢ　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ＨｅｌａＳ３ｃｅｌｓ
图４　ＣＣＥＢ对 ＨｅｌａＳ３细胞 ＭＭＰ的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＣＣＥＢ　ｏｎ　ＭＭＰ　ｉｎ　ＨｅｌａＳ３ｃｅｌｓ
ＨｅｌａＳ３细胞凋亡相关蛋白表达的影响。与对照组相
比，不同浓度ＣＣＥＢ处理ＨｅｌａＳ３细胞２４ｈ后，Ｂａｘ蛋
白表达增加，Ｂｃｌ－２和Ｂｉｄ蛋白表达减少，结果如图７。
５１１１期　　　　时贞颂等：金花茶种子诱导人子宫颈癌 ＨｅｌａＳ３细胞凋亡及其作用机理的研究
图５　ＣＣＥＢ对 ＨｅｌａＳ３细胞内ｃａｓｐａｓｅ－８活性的影响
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＣＣＥＢ　ｏｎ　ｃａｓｐａｓｅ－８
ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ＨｅｌａＳ３ｃｅｌｓ
图６　ＣＣＥＢ对 ＨｅｌａＳ３细胞内ｃａｓｐａｓｅ－３活性的影响
Ｆｉｇ．６　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＣＣＥＢ　ｏｎ　ｃａｓｐａｓｅ－３
ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ＨｅｌａＳ３ｃｅｌｓ
３　结论与讨论
凋亡是细胞的程序化死亡。凋亡异常（相对减
弱）是肿瘤形成和发展的一个重要原因，通过各种途
径和方式诱导、增强肿瘤细胞的凋亡是抑制、杀伤肿
瘤细胞的重要方面。实验研究结果表明，ＣＣＥＢ具
有较强的抑制细胞增殖的作用，并能引起 ＨｅｌａＳ３
细胞ＤＮＡ片段化率增大和明显的细胞凋亡形态学
的改变，引起 ＨｅｌａＳ３细胞早期凋亡率显著增加，同
时随ＣＣＥＢ浓度的逐渐增加，ＨｅｌａＳ３细胞凋亡率逐
渐升高，呈现出一定的量效关系。
目前普遍认为哺乳动物细胞凋亡主要有两条途
径（Ｇｒｅｅｎ，２０００；Ｗａｎｇ，２００１）：①死亡受体途径：即
通过死亡配体与相应的位于细胞表面的死亡受体，
主要是 ＴＮＦＲ 家族受体（包括 ＴＮＦＲｌ、ＴＮＦＲ２、
Ｆａｓ、ＤＲ４和ＤＲ５等）结合，配体受体结合后死亡受
体细胞胞内段的死亡域吸引衔接蛋白（如ＦＡＤＤ、
ＴＲＡＤＤ）并募集Ｃａｓｐａｓｅ　８及１０的前体，产生有活
性的启动Ｃａｓｐａｓｅ，再激活Ｃａｓｐａｓｅ　３、６及７等效应
Ｃａｓｐａｓｅ，从而诱导细胞凋亡；②线粒体途径：各种凋
亡信号，如ＤＮＡ损伤、外来刺激、生长因子去除及
部分化疗药物可以诱导线粒体释放细胞色素Ｃ等
促凋亡多肽进入细胞质，与凋亡蛋白酶激活因子
（Ａｐａｆ－１）结合，募集Ｃａｓｐａｓｅ　９前体形成凋亡小体，
产生具有活性的Ｃａｓｐａｓｅ　９，再激活下游的Ｃａｓｐａｓｅ
３效应Ｃａｓｐａｓｅ诱导凋亡。研究结果显示，ＣＣＥＢ能
引起 ＨｅｌａＳ３细胞 ＭＭＰ下降、细胞内ｃａｓｐａｓｅ－８和
ｃａｓｐａｓｅ－３活性增高，另外Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂可以显著
地抑制ＣＣＥＢ引起的细胞早期凋亡，表明ＣＣＥＢ可
能通过死亡受体途径和线粒体途径引起 ＨｅｌａＳ３细
胞凋亡。
图７　ＣＣＥＢ对凋亡相关蛋白表达的影响
Ｆｉｇ．７　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＣＣＥＢ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
　　Ｂｃｌ－２家族蛋白是以Ｂｃｌ－２为代表的一组凋亡
调节蛋白，能够通过不同的分子机制对线粒体介导
的细胞凋亡发挥重要的调控作用。Ｂｃｌ－２基因蛋白
家族对于ＰＴ孔的开放和关闭起关键的调节作用，
促凋亡蛋白Ｂａｘ等可以通过与 ＡＮＴ或 ＶＤＡＣ的
结合介导ＰＴ 孔的开放，而抗凋亡类蛋白如Ｂｃｌ－２、
Ｂｃｌ－ｘＬ等则可通过与Ｂａｘ竞争性地与ＡＮＴ结合，
或者直接阻止Ｂａｘ与 ＡＮＴ、ＶＤＡＣ的结合来发挥
其抗凋亡效应（Ｈａｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）。有研究发现，
发生膜转位Ｂａｘ在线粒体膜上形成了由四聚体到
十聚体组成的低聚复合物，从而在线粒体外膜上形
成通道介导细胞色素Ｃ的释放，此复合物的形成可
被Ｂｃｌ－２抑制。由上可见，Ｂａｘ对于细胞色素Ｃ的
６１１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
释放起着关键的作用，在凋亡信号的刺激下Ｂａｘ可
从胞质转位到线粒体膜上，从而启动线粒体介导的
细胞凋亡。抗凋亡类Ｂｃｌ－２蛋白可以通过阻止促凋
亡蛋白在线粒体膜上形成低聚体来发挥其抗凋亡作
用（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ　ｅｔ　ａｌ．，２００１）。Ｂｉｄ属于促进凋亡的
（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）蛋 白。在 凋 亡 途 径 中，活 化 的
ｃａｓｐａｓｅ－８将胞质中的Ｂｉｄ剪切，形成活性分子ｔＢｉｄ
（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　Ｂｉｄ），ｔＢｉｄ进入线粒体，导致细胞色素ｃ
释放，使凋亡信号放大（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。在本研究
中，ＣＣＥＢ能促进ＨｅｌａＳ３细胞中Ｂａｘ蛋白表达增加
和Ｂｃｌ－２蛋白表达减少。同时ＣＣＥＢ能促进ＨｅｌａＳ３
细胞中Ｂｉｄ蛋白活化和细胞内ｃａｓｐａｓｅ－８活性增高。
这些结果进一步表明了ＣＣＥＢ能通过线粒体途径
引起 ＨｅｌａＳ３细胞凋亡。
参考文献：
梁盛业，陆敏珠．２００５．中国金花茶栽培与开发利用［Ｍ］．北
京：中国林业出版社：１
Ｇｒｅｅｎ　ＤＲ．２０００．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙｓ：ｐａｐｅｒ　ｗｒａｐｓ　ｓｔｏｎｅ　ｂｌｕｎｔｓ
ｓｃｉｓｓｏｒｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１０２：１－４
Ｈｕａｎｇ　ＹＣ（黄燮才）．１９９４．金花茶开发利用概况及前景预测［Ｊ］．
Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｉｎｆｏｒｍ　ＴＣＭ（中国中医药信息杂志），１（６）：１０－１１
Ｈｏｐｃｉａ　ＫＬ，ＭｃＣａｒｅｙ　ＹＬ，Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ　ＦＣ，ｅｔ　ａｌ．１９９６．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ＨＬ６０ｃｅｌｓ，ｏｘｙｇｅｎ　ｅｆｆｅｃｔ，ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅ－
ｔｗｅｅｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｉｍｅ
ｔｏ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｎ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｄｏｓｅ［Ｊ］．Ｒａｄｉａｔ　Ｒｅｓ，１４５：３１５－３２３
Ｈａｒｒｉｓ　ＭＨ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＣＢ．２０００．Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｃｌ－２ｆａｍｉｌｙ　ｉｎ
ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｕｔｅｒ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］．
Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ，７（１２）：１　１８２－１　１９１
Ｌｉ　Ｈ，Ｚｈｕ　Ｈ，Ｘｕ　ＣＪ，ｅｔ　ａｌ．１９９８．Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　ＢＩＤ　ｂｙ　ｃａｓｐａｓｅ　８
ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｆａｓ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ａｐｏｐ－
ｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，９４：４９１－５０１
Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ　Ｖ，Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ　Ｍ，Ｐｕｌｋｒａｂｅｋ　ＤＪ．２００１．Ｂｃｌ－２ｐｒｅｖｅｎｔｓ
Ｂａｘ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ［Ｊ］．Ｊ
Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２７６（２１）：１８　３６１－１８　３７４
Ｓｅｌｉｎｓ　ＫＳ，Ｃｏｈｅｎ　ＪＪ．１９８７．Ｇｅｎｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｇａｍｍａ－ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ
ｌｅａｄｓ　ｔｏ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，
１３９：３　１９９－３　２０６
ｖａｎ　Ｈｅｅｒｄｅ　ＷＬ，ｄｅ　Ｇｒｏｏｔ　ＰＧ，Ｒｅｕｔｅｌｉｎｇｓｐｅｒｇｅｒ　ＣＰ．１９９５．Ｔｈｅ
ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ［Ｊ］．
Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔ，７３：１７２－１７９
Ｗｅｉ　Ｘ（韦霄），Ｊｉａｎｇ　ＳＹ（蒋水元），Ｊｉａｎｇ　ＹＳ（蒋运生），ｅｔ　ａｌ．２００６．
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｎｉｔｉｄｓｓｉａｍ，ａ　Ｒａｒｅ　ａｎｄ　Ｅｎｄａｎ－
ｇｅｒｅｄ　Ｐｌａｎｔ（珍稀濒危植物金花茶研究进展）［Ｊ］．Ｊ　Ｆｕｊｉａｎ
Ｆｏｒｅ　Ｓｃｉ　Ｔｅｃｈｎｏｌ（福建林业科技），３３（３）：１６９－１７３
Ｗａｎｇ　ＹＱ（王永奇），Ｗｕ　ＸＪ（吴小娟），Ｌｉ　ＨＢ（李红冰），ｅｔ　ａｌ．２００６．
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　Ｃａｍｅｌｌｉａｏｎ　ｔｈｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｒｕｇｓ（药用山茶属植物的研
究）［Ｊ］．Ｊ　Ｄａｌｉａｎ　Ｕｎｉｖ（大连大学学报），２７（４）：４７－５８
Ｗａｎｇ　Ｘ．２００１．Ｔｈｅ　ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　ｉｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，１５：２　９２２－２　９３３
Ｙｕ　ＤＹ，Ｍａｔｓｕｙａ　Ｙ，Ｚｈａｏ　ＱＬ，ｅｔ　ａｌ．２００７．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｙｐｅｒ－
ｔｈｅｒｍｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ａ　ｎｅｗ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ　ｆｕｒａｎ－
ｆｕｓｅｄ　ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，１２（８）：１　５２３－１　５３２
Ｙｕ　ＤＹ，Ｍａｔｓｕｙａ　Ｙ，Ｚｈａｏ　ＱＬ，ｅｔ　ａｌ．２００８．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｙ－
ｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ａ　ｎｅｗ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ
ｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏａｌｋｅｎｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，１３（３）：
檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹檹
４４８－４６１
（上接第５１页Ｃｏｎｔｉｎｕｅ　ｆｒｏｍ　ｐａｇｅ　５１）
济核算体系，但不能因此忽视森林生态系统服务功能
及其价值。
参考文献：
广西壮族自治区林业勘测设计院．２００５．广西壮族自治区森林
资源连续清查第七次复查报告［Ｒ］
广西壮族自治区林业勘测设计院．２００８．广西壮族自治区重点
公益林资源与生态状况监测报告［Ｒ］
王兵，德永军，杨锋伟，等．２００７ｂ．暖温带森林生态系统定位观
测指标体系（ＬＹ／Ｔ　１６８９－２００７）［Ｓ］．北京：中国标准出版社
王兵，郭泉水，杨锋伟，等．２００４．森林生态系统定位观测指标体
系（ＬＹ／Ｔ　１６０６－２００３）［Ｓ］．北京：中国标准出版社
王兵，李意德，李少宁，等．２００７ａ．热带森林生态系统定位观测
指标体系（ＬＹ／Ｔ　１６８７－２００７）［Ｓ］．北京：中国标准出版社
王兵，杨锋伟，郭浩，等．２００８．森林生态系统服务功能评估规范
（ＬＹ／Ｔ　１７２１－２００８）［Ｓ］．北京：中国标准出版社
张永明．２００８．云南轿子山自然保护区森林生态系统服务功能
及其价值初步研究［Ｊ］．林业建设，（５）：２０－２４
Ｂｏｌｕｎｄ　Ｐ，Ｈｕｎｈａｍｍａｒ　Ｓ．１９９９Ｅ．ｃｏｓｙｓｔｅｍ　ｓｅｒｖｉｃｅｓ　ｉｎ　ｕｒｂａｎ　ａｒｅａｓ
［Ｊ］．Ｅｃｏｌ　Ｅｃｏｎ，２９：２９３－３０１
Ｃｏｓｔａｎｚａ　Ｒ．１９９７．Ｔｈｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｏｒｌｄ’ｓ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ　ｓｅｒｖｉｃｅｓ
ａｎｄ　ｎａｔｕｒａｌ　ｃａｐｉｔａｌ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，３８７（１５）：２５３－２６０
Ｄａｌｙ　ＧＣ．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ’ｓ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ：Ｓｏｃｉｅｔａｌ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｎａｔｕｒａｌ
Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ［Ｍ］．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ：Ｉｓｌａｎｄ　Ｐｒｅｓｓ
Ｌｉ　ＳＮ（李少宁），Ｗａｎｇ　Ｂ（王兵），Ｇｕｏ　Ｈ（郭浩），ｅｔ　ａｌ．２００７．Ａｓ－
ｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｆｏｒｅｓｔ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ　ｓｅｒｖｉｃｅｓ　ｖａｌｕｅ　ｉｎ　Ｄａｇａｎｇｓｈａｎ（大岗
山森林生态系统服务功能及其价值评估）［Ｊ］．Ｓｃｉ　Ｓｏｉｌ　＆
Ｗａｔｅｒ　Ｃｏｎｓ（中国水土保持科学），５（６）：５８－６４
Ｗａｎｇ　Ｂ（王兵），Ｌｉ　ＳＮ（李少宁），Ｇｕｏ　Ｈ（郭浩）．２００７．Ｔｈｅ　ａｓ－
ｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｆｏｒｅｓｔ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ　ｓｅｒｖｉｃｅｓ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｐｒｏｖ－
ｉｎｃｅ（江西省森林生态系统服务功能及其价值评估研究）［Ｊ］．
Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｓｃｉ（江西科学），２５（５）：５５３－５５９，５８７
Ｗａｎｇ　Ｂ（王兵），Ｗｅｉ　ＪＳ（魏江生），Ｈｕ　Ｗ（胡文）．２００９．Ｔｈｅ　ａｓ－
ｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｆｏｒｅｓｔ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ　ｓｅｒｖｉｃｅｓ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｑｉａｎｄｏｎｇｎａｎ
ｏｆ　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（贵州省黔东南州森林生态系统服务功能
评估）［Ｊ］．Ｊ　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖ：Ｎａｔ　Ｓｃｉ　Ｅｄｉｔ（贵州大学学报·自
然科学版），２６（５）：４２－４７，５２
Ｚｈａｎｇ　ＬＱ（张乐勤），Ｆａｎｇ　ＹＹ（方宇嫒），Ｘｕ　Ｙ（许杨），ｅｔ　ａｌ．
２０１１．Ｓｅｒｖｉｃｅ　ｖａｌｕｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｏｒｅｓｔ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ
Ｃｈｉｚｈｏｕ（池州森林生态系统服务价值评估与分析）［Ｊ］．
Ｇｕｉｈａｉａ（广西植物），３１（４）：４６３－４６８
７１１１期　　　　时贞颂等：金花茶种子诱导人子宫颈癌 ＨｅｌａＳ３细胞凋亡及其作用机理的研究