全 文 ：　 Ｇｕｉｈａｉａ　 Ｆｅｂ. ２０１６ꎬ ３６(２):２１６－２２３
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
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ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１５０６０２３
齐小琼ꎬ葛亚飞ꎬ李大卫. 水蕨血红蛋白基因的分子克隆和序列分析[Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(２):２１６－２２３
ＱＩ ＸＱꎬＧＥ ＹＦꎬＬｉ ＤＷ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｃｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓ ｔｈａｌｉｃｔｒｏｉｄｅｓ[Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(２):２１６－２２３
水蕨血红蛋白基因的分子克隆和序列分析
齐小琼１ꎬ 葛亚飞１ꎬ 李大卫２∗
( １. 湖北第二师范学院 化学与生命科学学院 /植物抗癌活性物质提纯与应用湖北省重点实验室ꎬ 武汉 ４３０２０５ꎻ
２. 中国科学院武汉植物园 植物种质创新与特色农业重点实验室ꎬ 武汉 ４３００７４ )
摘　 要: 植物血红蛋白(Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ)是一类由珠蛋白(Ｇｌｏｂｉｎ)和血红素(Ｆｅｒｒｏｈｅｍｅ)组成的结合蛋白ꎬ在植物
中广泛分布ꎬ迄今已在苔藓植物、裸子植物和被子植物中克隆到血红蛋白基因序列ꎬ但在蕨类植物中相关研究
还未见报道ꎮ 该研究采用热不对称交错 ＰＣＲ(ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ)方法克隆了水蕨血红蛋白基因的全长序列ꎮ 该基因
的序列总长为 ９４９ ｂｐꎬ包含 ４个外显子和 ３个内含子ꎬ编码 １８９个氨基酸ꎮ 预测的蛋白质(命名为 ＣｔＨｂ)的分
子量为 ２１.１４ ｋＤａꎬ等电点(ｐＩ)为 ７.８１ꎮ 三维结构模拟表明 ＣｔＨｂ 具有植物血红蛋白典型的三级结构:即含有
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ和 Ｈ螺旋ꎬ形成了 ３￣ｏｎ￣３的“三明治”结构ꎮ 和水稻血红蛋白的三级结构相比ꎬＣｔＨｂ的大部分
结构(包括具有远端和近端组氨酸定位的 Ｅ螺旋和 Ｆ螺旋的位置等)同水稻的结构极为相似ꎮ 两者的不同之
处主要表现在:(１)ＣｔＨｂ 含有较长的 Ｎ￣端区域ꎻ(２)两者 ＣＤ￣ｌｏｏｐ的折叠方式不同ꎻ(３)两者螺旋 Ｂ 和螺旋 Ｃ
的连接方式不同ꎬＣｔＨｂ是通过卷曲连接的ꎬ而水稻中借助的是螺旋ꎮ 结构进化分析揭示了植物血红蛋白从非
共生到共生进化过程中的一些关键改变ꎬ这些改变可能有助于非共生血红蛋白向共生血红蛋白结构的转变ꎬ
特别是有助于豆血红蛋白共生功能的实现ꎮ
关键词: 植物血红蛋白ꎬ 序列分析ꎬ 三级结构模拟ꎬ 结构进化ꎬ 水蕨
中图分类号: Ｑ９４３.２ꎬ Ｑ７５　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０２￣０２１６￣０８
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ
ｇｅｎｅ ｉｎ Ｃｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓ ｔｈａｌｉｃｔｒｏｉｄｅｓ
ＱＩ Ｘｉａｏ￣Ｑｉｏｎｇ１ꎬ ＧＥ Ｙａ￣Ｆｅｉ１ꎬ ＬＩ Ｄａ￣Ｗｅｉ２∗
( １. Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ / Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐｌａｎｔ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓꎬ Ｗｕｈａｎ ４３０２０５ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ
Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｗｕｈａｎ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７４ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｐｌａｎｔｓꎬ ｌｉｋｅ ｈｕｍａｎｓꎬ ｃｏｎｔａｉｎ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ (Ｈｂｓ)ꎬ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｓｉｓｔ ｍｏｓｔｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔｓ (ｔｈｅ “ｇｌｏｂｉｎ”
ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ) ａｎｄ ｈｅｍｅ ｇｒｏｕｐｓ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ Ｈｂｓ ａｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓꎬ ａｎｄ ｂｙ ｃｏｍ￣
ｐａｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓꎬ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓꎬ ｉｔ ｉｓ ｅｖｉｄｅｎｔ ｔｈａｔ ｔｈｒｅｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｈｂ ｅｘｉｓｔ ｉｎ
ｐｌａｎｔｓ: ｓｙｍｂｉｏｔｉｃꎬ ｎｏｎ￣ｓｙｍｂｉｏｔｉｃꎬ ａｎｄ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｈｂｓ. Ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓꎬ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｈｂ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉ￣
ｆｉｅｄ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｂｒｙｏｐｈｙｔｅｓꎬ ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍｓ ａｎｄ ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓꎬ ｂｕｔ ｎｏ ｓｔｕｄｙ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｎｓ ｕｎｔｉｌ
收稿日期: ２０１５￣０６￣２４ 　 　 修回日期:２０１５￣１２￣０４
基金项目: 国家自然科学基金(３１２０１２４２ꎬＣ１３０４０５)ꎻ湖北省科学研究计划项目(Ｑ２０１４３００４)ꎻ湖北省自然科学基金(２０１５ＣＦＢ５０８)ꎻ植物抗癌活
性物质提纯与应用湖北省重点实验室开放课题 (ＨＬＰＡＩ ２０１４００４) [ Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (３１２０１２４２ꎬ
Ｃ１３０４０５)ꎻ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ (Ｑ２０１４３００４)ꎻ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
(２０１５ＣＦＢ５０８)ꎻ Ｏｐｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ(ＨＬＰＡＩ ２０１４００４)]ꎮ
作者简介: 齐小琼(１９８１￣)ꎬ女ꎬ山东昌邑人ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ主要从事进化遗传学研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)１０８８１６５６４＠ ｑｑ.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 李大卫ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事果树遗传育种方向ꎬ(Ｅ－ｍａｉｌ)ｄａｖｉｄ.ｌｅｅ１９８３＠ １６３.ｃｏｍꎮ
ｎｏｗ. Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙꎬ ａ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ Ｈｂ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｃｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓ ｔｈａｌｉｃｔｒｏｉｄｅｓ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ Ｔｈｅｒｍａｌ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｉｎｔｅｒ￣
ｌａｃｅｄ (ＴＡＩＬ) ＰＣＲꎬ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｂｙ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ９４９
ｂｐ ｌｏｎｇꎬ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ４ ｅｘｏｎｓ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ ｂｙ ３ ｉｎｔｒｏｎｓ. Ｔｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ (ｎａｍｅｄ ＣｔＨｂ) ｗｉｔｈ １８９ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ
ｈａｄ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ (ＰＩ) ｏｆ ７.８１ ａｎｄ ａ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ２１.１４ ｋＤａ. Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃ￣
ｔｕｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＣｔＨｂ ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ｔｙｐｉｃａｌ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｓ ｐｌａｎｔ Ｈｂｓ (ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｈｅｌｉｃｅｓ Ａꎬ Ｂꎬ Ｃꎬ Ｅꎬ Ｆꎬ Ｇ ａｎｄ
Ｈꎬ ｔｈｅｓｅ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｆｏｒｍｓ ａ “ｓａｎｄｗｉｃｈ” ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ３￣ｏｎ￣３). Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣｔＨｂ ｗｉｔｈ ｒｉｃｅ ｎａｔｉｖｅ
ＮｓＨｂ１ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣｔＨｂ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗａｓ ｑｕｉｔｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｒｉｃｅ ＮｓＨｂ１ꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｅｌｉｃｅｓ
Ｅ ａｎｄ Ｆꎬ ｗｈｅｒｅ ｄｉｓｔａｌ ａｎｄ ｐｒｏｘｉｍａｌ Ｈｉｓ ｗｅｒｅ ｌｏｃａｔｅｄꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ:
(１)Ｔｈｅ Ｎ￣ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｒｅｇｉｏｎ ｗａｓ ｌｏｎｇｅｒ ｉｎ ＣｔＨｂ ｔｈａｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ＮｓＨｂ１ꎻ (２)Ｔｈｅ ＣＤ￣ｌｏｏｐ ｆｏｌｄｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙꎻ (３)Ｈｅｌｉｃｅｓ ｔｏ
ｃｏｉｌｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｎｅｃｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｈｅｌｉｃｅｓ Ｂ ａｎｄ Ｃ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ. Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｍａｊｏｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ
ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｌａｎｔ Ｈｂｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ. Ｓｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｈｅｌｐｆｕｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｎｏｎｓｙｍｂｉｏｔ￣
ｉｃ Ｈｂ ｔｏ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ Ｈｂ ａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ Ｈｂ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｐｌａｎｔ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎꎬ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇꎬ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎꎬ Ｃｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓ ｔｈａｌｉｃ￣
ｔｒｏｉｄｅｓ
　 　 植物血红蛋白(Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ)是一类由珠蛋白
(Ｇｌｏｂｉｎ)和血红素(Ｆｅｒｒｏｈｅｍｅ)组成的结合蛋白ꎬ广
泛存在于植物界ꎬ在植物固氮及抵御胁迫中具有重
要作用ꎮ 随着研究的不断深入ꎬ根据血红蛋白的序
列、表达方式以及配体结合性质把植物中的血红蛋
白 分 为 三 类: 共 生 的 血 红 蛋 白 ( Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ
ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎꎬｓＨｂ)、非共生的血红蛋白(Ｎｏｎｓｙｍｂｉｏｔｉｃ
ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎꎬＮｓＨｂ)和截短的血红蛋白(Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｈｅ￣
ｍｏｇｌｏｂｉｎꎬｔＨｂ)ꎮ 共生的血红蛋白主要存在于豆类
和一些非豆类植物(主要是放线菌结瘤植物和榆科
植物某些属)固氮根瘤菌侵染的根瘤细胞中ꎮ 非共
生的血红蛋白比共生的血红蛋白分布更广泛ꎬ不仅
存在于含有共生血红蛋白的植物中ꎬ而且也存在于
其他植物中ꎻ并可在多种器官中表达ꎬ如正常生长条
件和胁迫条件下植物的根、茎、叶、花和种子中(Ａｎ￣
ｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌꎬ１９９６ꎻ Ｌｉｒａ￣Ｒｕａｎ ｅｔ ａｌꎬ２００１ꎻ Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌꎬ
２００４ꎻ Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌꎬ１９９４ꎻ Ｔｒｅｖａｓｋｉｓ ｅｔ ａｌꎬ１９９７)ꎮ 截
短的血红蛋白首先在原核生物、原生动物和真核藻
类中发现ꎬ后来在一些植物中也发现了该蛋白
(Ｗａｔｔｓ ｅｔ ａｌꎬ ２００１)ꎮ 其序列比其他血红蛋白短
(Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌꎬ２０００)ꎬ三维结构是由 α￣螺旋通过 ２￣ｏｎ￣
２的方式排列而成ꎬ不同于 ３￣ｏｎ￣３ 标准的血红蛋白
折叠ꎮ 通过系统发育分析表明ꎬ植物中的 ｔＨｂ 与
ｓＨｂ、ＮｓＨｂ 形成了不同的谱系(Ｌｉｎｅａｇｅｓ)ꎬｔＨｂ 是通
过基因水平转移从细菌中获得(Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ ｅｔ ａｌꎬ
２００６)ꎬ具体的功能还不是很清楚ꎮ
血红蛋白基因在植物中普遍存在ꎬ就目前积累
的数据来看ꎬ大部分序列来自于被子植物ꎬ在裸子植
物和苔藓植物中有几条代表序列ꎬ但蕨类和石松类
植物中尚未见有相关报道ꎬ不完全的序列数据影响
了该基因家族的分子进化研究ꎮ 本研究通过分子克
隆手段获得蕨类植物水蕨的血红蛋白基因的完整编
码区序列ꎬ并进行生物信息学分析、三级结构模拟及
进化分析ꎬ试图阐明该基因在序列组成、基因结构、
三级结构等方面的特征ꎬ并推断其可能的功能ꎻ通过
与其他分类群中的血红蛋白基因进行比较分析ꎬ探
讨其在不同分类群中较独特的进化样式ꎮ
１　 材料与方法
１.１ 植物材料
蕨类植物水蕨的健康幼嫩叶片采自中国科学院
武汉植物园ꎮ
１.２ 主要分子生物学试剂
普通 Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、高保真 ＬＡ Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ
等试剂购自 ＴａＫａＲａꎻＤＮＡ 凝胶纯化回收试剂盒购
于 Ａｘｙｇｅｎ生物技术有限公司ꎮ
１.３ 试验方法
１.３.１ 水蕨血红蛋白基因部分片段的扩增　 分别用
拟南芥 ( Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ) ＡＨＢ１ 和 ＡＨＢ２ 基因
(登录号:ＡＡＤ２６９４９ꎬＡＡＢ８２７７０)的蛋白序列作为查
询序列ꎬ通过对数据库中已报道的蕨类序列进行相
似性搜索ꎬ在 Ｃｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓ ｒｉｃｈａｒｄｉｉ 中得到一条同目
标序 列 相 似 性 较 高 的 ＥＳＴ 序 列 ( 登 录 号:
ＢＱ０８７２６２)ꎮ 根据这条序列设计一对特异引物ꎬ进
行 ＰＣＲ扩增ꎮ 引物序列为 Ｆ￣ｃｅｒａ:５′￣ＴＣＡＣＣＧＡＧＣ￣
ＡＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡＴ￣３′ꎻ Ｒ￣ｃｅｒａ: ５′￣ＴＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＡ￣
ＣＣＴＧＡＣＧＡ￣３′ꎮ
７１２２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 齐小琼等: 水蕨血红蛋白基因的分子克隆和序列分析
ＰＣＲ反应体系为 ２０ μＬꎬ引物各 ４０ ｐｍｏｌꎬｄＮＴＰ
各 １ ｐｍｏｌꎬ１０×ＰＣＲ 反应缓冲液 ２.０ μＬꎬＴａｑ 酶 ０.２
μＬ(５ Ｕ / μＬ)ꎮ 反应条件为 ９５ ℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ接着
９４ ℃变性 ５０ ｓꎬ５３ ℃退火 ５０ ｓꎬ７２ ℃延伸 ６０ ｓꎬ共
３６个循环ꎻ最后 ７２ ℃延伸 ８ ｍｉｎꎮ
１.３.２ 水蕨血红蛋白基因 ３′侧翼序列的扩增　 以提
取的总 ＤＮＡ 为模板ꎬ用 ３ 个巢式单引物进行 ３ 轮
ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ扩增ꎬ引物序列为 ３′ＴＡＩＬ￣１:５′￣ＴＣＴＴＡＡＴ￣
ＧＴＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＡ￣３′ꎻ ３′ ＴＡＩＬ￣２: ５′￣ＣＴＴＴＧＡＧ￣
ＣＡＧＣＡＣＡＧＧＡＡＴＧＧＴＣＴＣ￣３′ꎻ ３′ ＴＡＩＬ￣３: ５′￣ＣＧＧＴＧ￣
ＴＡＧＴＧＧＡＴＧＡＧＣＡＴＴＡＴＧＡＧ￣３′ꎮ
ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ的反应体系为 ５０ μｌꎬ简并引物 ＡＤ
(５′￣ＴＣ(Ｇ / Ｃ) ＴＩＣＧＮＡＣＩＴ(Ａ / Ｔ) ＧＧＡ￣３′) ( Ｌｉｕ ａｎｄ
Ｗｈｉｔｔｉｅｒꎬ１９９５ )ꎮ 各成分及用量如下: ＬＡ ｂｕｆｆｅｒ
(Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ)５.０ μＬꎻｄＮＴＰ Ｍｉｘ(２.５ ｍｍｏｌ / Ｌ)８.０ μＬꎻ
ＡＤ 引物(２０ μｍｏｌ / Ｌ) ５. ０ μＬꎻ基因特异性引物(５
μｍｏｌ / Ｌ)２.０ μＬꎻＬＡ Ｔａｑ 酶(５ Ｕ / μＬ) ０.５ μＬꎻＤＮＡ
(５０ ｎｇ / μＬ)５.０ μＬꎻＨ２Ｏ ２４.５ μＬꎮ
第一轮反应引物采用 ３′ＴＡＩＬ￣１ 和 ＡＤꎬ条件为
９４ ℃预变性 １ ｍｉｎꎬ９８ ℃预变性 １ ｍｉｎꎻ接着 ９４ ℃变
性 ３０ ｓꎬ６５ ℃退火 １ ｍｉｎꎬ７２ ℃延伸 ２ ｍｉｎꎬ共 ５个循
环ꎻ紧接着 ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ２５ ℃退火 ３ ｍｉｎꎬ在 ３ ｍｉｎ
内攀升到 ７２ ℃ꎬ７２ ℃延伸 ２ ｍｉｎꎬ进行一个循环ꎻ接
着 ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ６５ ℃退火 １ ｍｉｎꎬ７２ ℃延伸 ２
ｍｉｎꎬ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ６５ ℃退火 １ ｍｉｎꎬ７２ ℃延伸 ２
ｍｉｎꎬ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ４４ ℃退火 １ ｍｉｎꎬ７２ ℃延伸 ２
ｍｉｎꎬ共 １５ 个循环ꎻ最后 ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ ＴＡＩＬ￣
ＰＣＲ第二轮反应引物采用 ３′ＴＡＩＬ￣２ 和 ＡＤꎬ将第一
轮反应产物稀释 ５０ 倍ꎬ取 １ μＬ 作为第二轮反应的
模板ꎬ其它成分与第一轮反应相同ꎮ 反应条件为 ９４
℃预变性 １ ｍｉｎꎻ接着 ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ６５ ℃退火
１ ｍｉｎꎬ７２ ℃延伸 ２ ｍｉｎꎬ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ６５ ℃退火
１ ｍｉｎꎬ７２ ℃延伸 ２ ｍｉｎꎬ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ４４ ℃退火
１ ｍｉｎꎬ７２ ℃延伸 ２ ｍｉｎꎬ共 １５ 个循环ꎻ最后 ７２ ℃延
伸 １０ ｍｉｎꎮ 第三轮反应引物采用 ３′ＴＡＩＬ￣３ 和 ＡＤꎬ
将第二轮反应产物稀释 ５０ 倍ꎬ取 １ μＬ 作为第三轮
反应的模板ꎬ其它成分与第二轮反应相同ꎮ 反应条
件也同第二轮相同ꎮ
１.３.３ 产物回收、连接、转化、克隆、测序　 扩增片段
凝胶回收采用凝胶回收试剂盒ꎬ参照说明书进行ꎻ产
物连接采用 ＴａＫａＲａ公司 ｐＭＤ１９￣Ｔ ｓｉｍｐｌｅ Ｖｅｃｔｏｒꎬ参
考说明书ꎬ反应体系稍作优化ꎮ 大肠杆菌感受态细
胞制备采用 ＣａＣｌ２法ꎬ将目的基因通过热激法转化
到大肠杆菌感受态细胞中ꎬ阳性克隆采用蓝白斑筛
选方法并进一步采用 ＰＣＲ 方法ꎬ扩增产物长度与目
的片段相当者为阳性克隆ꎮ 每个目的片段ꎬ随机选
取至少 ３个阳性克隆ꎬ送华大基因测序ꎮ 序列测定
采用 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３０ ＤＮＡ测序仪用 ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉ￣
ｎａｔｏｒ Ｋｉｔ(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)进行双向克隆测序ꎮ
１.４ 数据分析
采用 ＢｉｏＥｄｉｔ 软件(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｍｂｉｏ. ｎｃｓｕ. ｅｄｕ /
ＢｉｏＥｄｉｔ / ｂｉｏｅｄｉｔ. ｈｔｍｌ ) ( Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ)对克隆测序得到的片段进行拼接ꎮ 采用
ＦＧＥＮＥＳＨ 和 ＮＣＢＩ ( ｈｔｔｐ: / / ｌｉｎｕｘ１. ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ. ｃｏｍ /
ｂｅｒｒｙ.ｐｈｔｍｌ)的 ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ 进行开放阅读框确定ꎮ
运用 ＤＮＡｓｔａｒ 软件推测氨基酸序列ꎬ分析蛋白质的
分子量、等电点和氨基酸组成ꎮ 使用 ＳｉｇｎａｌＰ ３. ０
Ｓｅｒｖｅｒ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ / ＳｉｇｎａｌＰ / )分
析蛋白 Ｎ￣端氨基酸序列ꎬ根据 ＳｉｇｎａｌＰ 分析得到的
Ｃｍａｘ值( ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｓｃｏｒｅ)、Ｓｍｅａｎ( ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ
ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｃｏｒｅ)和 ＨＭＭ 值(Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ)判
别信号肽序列ꎬ确定是否存在信号肽ꎮ 使用 ＴａｒｇｅｔＰ
Ｓｅｒｖｅｒ ｖ１. ０１ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ / Ｔａｒ￣
ｇｅｔＰ / )确定分泌蛋白的分泌途径和亚细胞定位ꎮ 蛋
白质保守结构功能域用 ＰＲＯＳＩＴＥ、ＳＭＡＲＴ 软件和
ＰＦＡＭ 数据库( ｈｔｔｐ: / / ｐｆａｍ. ｗｕｓｔｌ. ｅｄｕ / )进行预测ꎮ
多条序列的一致性分析用 Ｂｉｏｅｄｉｔ 软件 ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉ￣
ｄｅｎｔｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ 进行ꎮ 使用在线软件 ＳＯＰＭＡ 预测蛋
白二级结构并计算各种二级结构所占的百分比ꎮ 将
推导的氨基酸序列提交瑞士生物信息研究所的
Ｓｗｉｓｓ￣ｍｏｄｅｌ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｉｓｂ￣ｓｉｂ. ｃｈ / ) (Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌꎬ
２００６ꎻ Ｓｃｈｗｅｄｅ ｅｔ ａｌꎬ２００３)ꎬ基于同源建模的原理ꎬ
用水稻的 ＮｓＨｂ１ 作为模板(ＰＤＢ ｃｏｄｅ: １Ｄ８ＵＡ)进
行水蕨血红蛋白三级结构的预测ꎮ 预测结果用 Ｐｙ￣
ＭＯＬ软件展示和编辑ꎮ
运用 Ｂｌａｓｔ 工具( ｈｔｔｐ / / ｂｌａｓｔ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ /
Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)ꎬ以水蕨血红蛋白作为查询序列ꎬ进行序
列相似性搜索ꎬ并选取相似性较高的序列用 ＭＥＧＡ６
软件(Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌꎬ２０１３)中的邻接算法进行进化树
的构建ꎬ其中多重序列比对采取 Ｃｌｕｓｔａｌｘ软件进行ꎮ
２　 结果与分析
２.１ 水蕨血红蛋白基因的克隆
以水蕨的总 ＤＮＡ 为模板ꎬ用一对特异引物(Ｆ￣
ｃｅｒａ和 Ｒ￣ｃｅｒａ)扩增得到一段约 ８２０ ｂｐ 的片段(图
８１２ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
１:ａ)ꎮ 经过分析ꎬ该序列的 ５′端是完整的ꎬ因此只
需通过染色体步移技术获得 ３′侧翼序列ꎮ 基于获
得的序列片段ꎬ进一步设计了一组巢式引物通过
ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ来获得 ３′侧翼序列ꎮ 在 ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ 的第
二轮和第三轮分别获得了几条清晰的条带ꎬ根据巢
式引物设计的相对位置ꎬ选取这两轮反应的产物大
小相差大约 １００ ｂｐ的条带(图 １:ｂ)作为目的条带ꎮ
将第三轮的目的条带回收、克隆测序ꎬ经分析ꎬ得到
的序列含有同已知序列完全一致的重叠区ꎮ 将上述
实验获得的序列拼接最终得到水蕨血红蛋白基因的
完整编码区序列ꎮ
将得到的序列同 Ｃ. ｒｉｃｈａｒｄｉｉ 的 ＥＳＴ(登录号:
ＢＱ０８７２６２)序列进行比对ꎬ发现本研究获得的序列
比数据库中的序列多了三段区域ꎬ其它部分都完全
匹配ꎬ推测这三部分是基因的内含子区域ꎮ 由此获
知该基因含有 ４个外显子ꎬ３ 个内含子ꎬ这与其他植
物血红蛋白的基因结构相同ꎮ 说明血红蛋白基因的
外显子￣内含子结构在植物进化中是保守的ꎮ
２.２ 全长基因序列及编码蛋白的基本性质分析
对已获得的克隆基因进行分析研究后ꎬ 得到水
图 １　 特异 ＰＣＲ(ａ)、ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ(ｂ)琼脂糖电泳检测　
Ｍ.２０００ ｂｐ 分子量标记ꎻ ａ １. 特异引物 Ｆ￣ｃｅｒａ和 Ｒ￣ｃｅｒａ扩增得到
的大约 ８２０ ｂｐ的产物ꎻ ｂ ＩＩ. 引物 ３′ＴＡＩＬ￣２通过 ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ第二
轮反应得到的条带ꎻ ｂ ＩＩＩ. 引物 ３′ＴＡＩＬ￣３通过 ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ第三轮
反应得到的条带ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ(ａ)ꎬ
ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ(ｂ)ｐｒｏｄｕｃｔｓ　 Ｍ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒ (ＤＬ２０００)ꎻ
ａ １. Ａｂｏｕｔ ８２０ ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒ Ｆ￣
ｃｅｒａ ａｎｄ Ｒ￣ｃｅｒａꎻ ｂ ＩＩ. Ｓｅｖｅｒａｌ ｂａｎｄｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｏｆ ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒ ３′ＴＡＩＬ￣２ꎻ ｂ ＩＩＩ. Ｔｗｏ ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ
ｔｈｅ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒ ３′ＴＡＩＬ￣３.
表 １　 序列一致性分析
Ｔａｂｌｅ １　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆｙ
序列名称
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｎａｍｅ
棉花
Ｎｓ１
Ｃｏｔｔｏｎ
Ｎｓ１
拟南芥
Ｎｓ１
ＡＨＢ１
大麦
Ｎｓ１
Ｂａｒｌｅｙ
Ｎｓ１
玉米
Ｎｓ１
Ｍａｉｚｅ
Ｎｓ１
水稻
Ｎｓ１
Ｒｉｃｅ
Ｎｓ１
苜蓿
Ｌｂ
Ａｌｆａｌｆａ
Ｌｂ
百脉根
Ｌｂ
Ｌｏｔｕｓ
Ｌｂ
大豆
Ｌｂ
Ｓｏｙｂｅａｎ
Ｌｂ
羽扇豆
Ｌｂ１
Ｌｕｐｉｎｕｓ
Ｌｂ１
拟南芥
Ｎｓ２
ＡＨＢ２
棉花
Ｎｓ２
Ｃｏｔｔｏｎ
Ｎｓ２
小立碗藓
Ｐｈｙｓ￣
ｃｏｍｉ￣
ｔｒｅｌｌａ
角齿藓
Ｃｅｒａ￣
ｔｏｄｏｎ
石松
Ｓｅｌａｇ￣
ｉｎｅｌｌａｅ
拟南芥 Ｎｓ１ ＡＨＢ１ ０.７６２
大麦 Ｎｓ１ Ｂａｒｌｅｙ Ｎｓ１ ０.７０９ ０.６７４
玉米 Ｎｓ１ Ｍａｉｚｅ Ｎｓ１ ０.７０２ ０.６６８ ０.８２４
水稻 Ｎｓ１ Ｒｉｃｅ Ｎｓ１ ０.６５０ ０.６４４ ０.７７７ ０.７８９
苜蓿 Ｌｂ Ａｌｆａｌｆａ Ｌｂ ０.４１７ ０.４３１ ０.３７０ ０.３８１ ０.４０３
百脉根 Ｌｂ Ｌｏｔｕｓ Ｌｂ ０.３９２ ０.３９３ ０.３６４ ０.３６９ ０.３８５ ０.７１９
大豆 Ｌｂ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｌｂ ０.３９０ ０.３７８ ０.３４５ ０.３３９ ０.３６７ ０.６２８ ０.６５５
羽扇豆 Ｌｂ１ Ｌｕｐｉｎｕｓ Ｌｂ ０.４１４ ０.４０３ ０.３８８ ０.４００ ０.４０９ ０.５４１ ０.５６１ ０.５３８
拟南芥 Ｎｓ２ ＡＨＢ２ ０.４８７ ０.５００ ０.４９７ ０.４７６ ０.５０８ ０.５１８ ０.４７４ ０.４８１ ０.５３１
棉花 Ｎｓ２ Ｃｏｔｔｏｎ Ｎｓ２ ０.５２７ ０.５２７ ０.５１８ ０.５０２ ０.５１１ ０.５２２ ０.５２２ ０.４６２ ０.５５０ ０.７２２
小立碗藓 Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ０.４５０ ０.４１１ ０.４０１ ０.４１２ ０.４１７ ０.３１６ ０.３２２ ０.２９２ ０.３４８ ０.３６６ ０.４０８
角齿藓 Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ ０.４５５ ０.４３２ ０.４１６ ０.４２７ ０.４３８ ０.３２５ ０.３２５ ０.３０１ ０.３４６ ０.３８１ ０.４１３ ０.８２８
石松 Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａｅ ０.４００ ０.３７３ ０.３９７ ０.３９７ ０.３９７ ０.２７３ ０.２６８ ０.２５２ ０.３１５ ０.３５７ ０.３６１ ０.４１０ ０.３８９
水蕨 Ｃｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓ ０.３７３ ０.３６５ ０.３４３ ０.３７５ ０.３８０ ０.２６９ ０.２５９ ０.２４３ ０.２８５ ０.３４２ ０.３２９ ０.３０７ ０.３０３ ０.３４１
　 注: ＡＨＢ１和 ＡＨＢ２分别代表拟南芥非共生血红蛋白 １和 ２ꎻ Ｎｓ１代表非共生血红蛋白 １ꎻ Ｌｂ代表豆血红蛋白(共生血红蛋白)ꎮ
　 Ｎｏｔｅ: ＡＨＢ１ ａｎｄ ＡＨＢ２ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｎｏｎｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ １ ａｎｄ ２ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｎｓ１ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｎｏｎｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ￣１(ＮｓＨｂ￣１)ꎻ ｗｈｉｌｅ Ｌｂ
ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｌｅｇｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ(ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ) .
蕨血红蛋白(命名为 ＣｔＨｂ)基因序列全长(图 ２)为
９４９ ｂｐꎬ该基因包括 ４个外显子和 ３ 个内含子ꎬ编码
１８９个氨基酸ꎮ 氨基酸组成中含量最高的为丙氨酸
(Ａｌａꎬ１１. ６ )ꎬ其次缬氨酸 ( Ｖａｌꎬ９. ０ )、丝氨酸
(Ｓｅｒꎬ８.５ )、亮氨酸( Ｌｅｕꎬ７. ９ )和赖氨酸( Ｌｙｓꎬ
７.９ )ꎮ 碱性氨基酸(ＡｒｇꎬＬｙｓ) ２４ 个ꎬ强酸性氨基
酸(ＡｓｐꎬＧｌｕ)２３ 个ꎬ疏水氨基酸(ＡｌａꎬＩｌｅꎬＬｅｕꎬＰｈｅꎬ
ＴｒｐꎬＶａｌ)７１个ꎬ 不带电荷的极性氨基酸(Ａｓｎꎬ Ｃｙｓꎬ
９１２２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 齐小琼等: 水蕨血红蛋白基因的分子克隆和序列分析
图 ２　 水蕨血红蛋白基因的核酸序列和推导的氨基酸序列　 推导的氨基酸序列标注在开放阅读框下面ꎬ小写字母示内含子部分ꎮ
Ｆｉｇ. ２　 Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｃｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓ ｔｈａｌｉｃｔｒｏｉｄｅｓ　 Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｓ ｓｈｏｗｎ ｂｅｌｏｗ ｉｔｓ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｎｓ ａｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ.
ＧｌｎꎬＳｅｒꎬＴｈｒꎬＴｙｒ) ４１ 个ꎮ 预测的蛋白质分子量为
２１.１４ ｋＤａꎬ理论等电点(ｐＩ)为 ７.８１ꎮ
２.３ 蛋白质的信号肽预测及亚细胞定位分析
采用 ＳｉｇｎａｌＰ 对该蛋白序列及其他分类群的代
表序列(包括苔藓植物 ２ 条(Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ 和
Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ)、石松类 １ 条(Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａｅ ｍｏｅｌ￣
ｌｅｎｄｏｒｆｉｉ)和被子植物 １１条(具体的物种和序列名称
见表 １)进行在线搜索ꎬ发现这些蛋白存在信号肽的
概率都极低ꎬ不存在信号肽酶切位点ꎬ说明这些血红
蛋白很可能为非分泌蛋白ꎮ 进一步分析这些蛋白的
亚细胞定位ꎬ发现大部分蛋白是细胞质蛋白ꎬ只有小
立碗藓和江南卷柏的血红蛋白具有较高分值的叶绿
体定位信号ꎬ可能会定位于叶绿体中ꎮ
２.４ 序列一致性分析
表 １ 给出的是 １５ 条植物血红蛋白序列两两之
间的一致性指数ꎬ其中包括 ２条苔藓植物序列(Ｐｈｙ￣
ｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ 和 Ｃｅｒａｔｏｒｄｏｎ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ)ꎬ１ 条石松
类植物序列(Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａｅ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｉｉ)ꎬ１ 条蕨类植
物序列(Ｃｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓ ｔｈａｌｉｃｔｒｏｉｄｅｓ)及 １１ 条被子植物
序列ꎮ 本研究发现 ＣｔＨｂ与被子植物 ＮｓＨｂ１ 的序列
一致性偏高ꎬ与豆科植物 ｓＨｂ 的序列一致性偏低ꎬ
说明 ＣｔＨｂ属于 ＮｓＨｂ１ꎻ同时比较 ＣｔＨｂ 和其他分类
群 ＮｓＨｂ的一致性发现ꎬ与古老的苔藓、石松类植物
的 ＮｓＨｂ序列相比ꎬＣｔＨｂ 在进化上更类似于被子植
物 ＮｓＨｂꎮ
２.５ 水蕨血红蛋白高级结构预测
在二级结构预测中ꎬＣｔＨｂ 主要由 ６１.３８ 的 α￣
螺旋ꎬ ６. ３５ 的延伸片层ꎬ ５. ８２ 的 β￣转角和
２６􀆰 ４６ 无规卷曲组成ꎮ 其中 α￣螺旋和卷曲是 ＣｔＨｂ
二级结构的主要构成成分ꎮ
了解水蕨血红蛋白的结构性质对于阐明植物血
红蛋白的进化多样性及其在植物中发挥的作用都有
０２２ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
图 ３　 ａ. 预测的 ＣｔＨｂ三级结构ꎻ ｂ. 选取的 ＣｔＨｂ血红素口袋中的氨基酸三级结构　 每个螺旋分别用字母 ＡꎬＢꎬＣꎬＥꎬＦ和Ｈ表示ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 ａ. Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＣｔＨｂꎻ ｂ. Ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｈｅｍｅ ｐｏｃｋｅｔ ｏｆ ＣｔＨｂ　 Ｈｅｌｉｃｅｓ (ｉｎ￣
ｃｌｕｄｉｎｇ ｔｏ ｐｒｅｈｅｌｉｘ Ａ) ａｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｅｔｔｅｒｓ ＡꎬＢꎬＣꎬＥꎬＦ ａｎｄ Ｈ.
图 ４　 Ａ. ＣｔＨｂ(灰色表示)和水稻 ＮｓＨｂ１(黑色表示)三级结构比对图ꎻ Ｂ. 选取在 ＣｔＨｂ(灰色表示)和水稻 ＮｓＨｂ１(黑
色表示)血红素口袋中的氨基酸位点的三级结构比对图　 每个螺旋分别用 ＡꎬＢꎬＣꎬＥꎬＦ和 Ｈ表示ꎬ其中(ａ)为正面ꎬ(ｂ)为背面ꎮ
Ｆｉｇ. ４　 Ａ. Ｏｖｅｒｌａｙ ｏｆ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＣｔＨｂ(ｇｒａｙ) ａｎｄ ｎａｔｉｖｅ ｒｉｃｅ ＮｓＨｂ１(ｂｌａｃｋ) ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓꎻ Ｂ. Ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃ￣
ｔｕｒｅ ｏｖｅｒｌａｙ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｈｅｍｅ ｐｏｃｋｅｔ ｏｆ ＣｔＨｂ(ｇｒａｙ) ａｎｄ ｎａｔｉｖｅ ｒｉｃｅ ＮｓＨｂ１(ｂｌａｃｋ)　 Ｈｅｌｉｃｅｓ(ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｏ ｐｒｅｈｅｌｉｘ Ａ) ａｒｅ
ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｅｔｔｅｒｓ ＡꎬＢꎬＣꎬＥꎬＦ ａｎｄ Ｈ. (ａ) ｉｓ ａ ｆｒｏｎｔ ｖｉｅｗꎬｗｈｉｌｅ (ｂ) ｉｓ ａ ｂａｃｋ ｖｉｅｗ.
着重要的意义ꎮ 通过计算机模拟可以从模板预测出
高质量的蛋白质三级结构ꎬ通过预测出的结构可以
考察血红蛋白的进化模式ꎬ在结构和功能方面理解
进化问题ꎮ 由于 ＣｔＨｂ和水稻 ＮｓＨｂ１具有接近 ５０
的相似性ꎬ所以可以用水稻 ＮｓＨｂ１(１Ｄ８ＵＡ)作为预
测 ＣｔＨｂ三级结构的模板ꎮ
图 ３给出了 ＣｔＨｂ 三维结构模拟结果ꎮ 图中显
示ꎬＣｔＨｂ具有植物血红蛋白典型的三级结构模式ꎬ
即含有 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ 和 Ｈ 螺旋ꎬ形成了 ３￣ｏｎ￣３的
“三明治”结构ꎮ 将 ＣｔＨｂ和水稻 ＮｓＨｂ１的三级结构
进行 ｏｖｅｒｌａｙ比较ꎬ结果如图 ４:Ａ 所示:预测得到的
ＣｔＨｂ三级结构具有典型球蛋白的折叠方式ꎬ它的大
部分结构(包括具有远端和近端组氨酸定位的 Ｅ 和
Ｆ螺旋的位置等)同水稻的结构非常相似ꎻ不同之处
主要表现在:(１)ＣｔＨｂ含有较长的 Ｎ￣端区域ꎻ(２)两
者 ＣＤ￣ｌｏｏｐ的折叠方式不同ꎻ(３)两者螺旋 Ｂ和螺旋
Ｃ的连接方式不同ꎬＣｔＨｂ 是通过卷曲连接的ꎬ而水
稻 ＮｓＨｂ１借助的是螺旋ꎮ
在比对图 ５中ꎬ发现苔藓植物、石松类和蕨类植
物 ＮｓＨｂ中都含有一段延长的 Ｎ￣端序列ꎬＲｏｓｓ ｅｔ ａｌ
(２００２)在苔藓植物 ＮｓＨｂ中检测到了类似于前导肽
的蛋白位点ꎬ推测植物 ＮｓＨｂ 的祖先可能是定位于
１２２２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 齐小琼等: 水蕨血红蛋白基因的分子克隆和序列分析
图 ５　 植物血红蛋白的多序列比对　 序列的保守性通过 ＥＳＰｒｉｐｔ化学等价策略进行可视化ꎬ设置相似性阈值来强调严格保守的位置ꎻ
不变残基添加黑色背景ꎬ理化性质相同的残基用灰色矩形框标注ꎻ 预测的 ＣｔＨｂ二级结构元件标注在序列比对的最上面ꎮ
Ｆｉｇ. ５　 Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ　 Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｓ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＥＳＰｒｉｐｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅꎬ
ｗｉｔｈ ａ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｅｔ ｔｏ ｅｍｐｈａｓｉｚｅ ｓｔｒｉｃｔｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓꎻ Ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｒｅ ｂｏｘｅｄ ｉｎ ｂｌａｃｋꎬ ｐｈｙｓｉｃｏ￣ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｒｅ
ｂｏｘｅｄ ｉｎ ｇｒａｙꎻ Ｔｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＣｔＨｂ ｉｓ ｓｈｏｗｎ ａｂｏｖｅ ｔｈｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ.
细胞器中的ꎬ这同软件预测的小立碗藓 ＮｓＨｂ 的亚
细胞定位结果一致ꎮ 推测这段延长的 Ｎ￣端氨基酸
可能有助于蛋白的转运(Ｇａｒｒｏｃｈｏ￣ｖｉｌｌｅｇａｓ ＆ Ａｒｒｅ￣
ｄｏｎｄｏ￣ｐｅｔｅｒꎬ２００８)ꎮ 在 ＣｔＨｂ 中ꎬＡ 螺旋之前存在较
长的一段序列ꎬ可能与苔藓植物延长的 Ｎ￣端氨基酸
有着相似的作用ꎬ即与蛋白的转运有关ꎬ但信号肽和
亚细胞定位预测都没有支持这一推断ꎮ 这可能与采
用的生物信息学的预测方法有关ꎬ需要进一步的实
验证据来证明ꎮ 如果这些都被验证是正确的ꎬ那么
从进化的角度讲ꎬＮｓＨｂ可能从细胞器的蛋白进化成
了细胞质的蛋白(Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌꎬ２００２)ꎮ
本研究也检测了参与配基结合的一些重要位点
的氨基酸组成和相对位置(图 ４:Ｂ)ꎬ结果表明近端
组氨酸(Ｈｉｓ)ꎬ 远端组氨酸ꎬ 螺旋 Ｂ 第 １０ 位的苯丙
氨酸 ( Ｐｈｅ)ꎬ ＣＤ￣ｌｏｏｐ 第 １ 位的苯丙氨酸及 １７２ /
１５０的酪氨酸(Ｔｙｒ)在水蕨和水稻ＮｓＨｂ１中都非常一
２２２ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
致ꎬ位置完全吻合ꎮ 这表明 ＣｔＨｂ 具有水稻 ＮｓＨｂ１
类似的配基结合动力学性质ꎬ即具有很低的 Ｏ２解离
常数ꎬ很高的 Ｏ２亲和力ꎮ
４.６ 血红蛋白的序列和结构进化
通过将 ＣｔＨｂ与其他分类群的代表序列比较发
现(图 ５ ): ＣｔＨｂ 包含非常保守的近端组氨酸
(Ｈ９５)ꎬ远端组氨酸(Ｈ１３０)和位于 Ｂ 螺旋第 １０ 位
的苯丙氨酸(Ｆ６２)ꎻ同时也发现ꎬ在 ＣＤ￣ｌｏｏｐ 的第 １
位上只有苔藓植物是酪氨酸(Ｔｙｒ)而其他物种都是
苯丙氨酸(Ｐｈｅ)ꎮ 这说明 ＣＤ１在非共生血红蛋白的
祖先序列中是被酪氨酸占据的ꎬ而在进化过程中被
苯丙氨酸所取代ꎮ
图 ６不同物种 ＧＧＰＰＳ 蛋白序列的同源比较
采用Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ算法ꎬ在ＭＥＧＡ６软件平台上构
图 ６　 不同物种的系统进化树
Ｆｉｇ. ６　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
图 ７　 角齿藓、水蕨、水稻非共生血红蛋白和大豆豆血红蛋白三级结构和表面电荷分布比较　 带有正电荷和负电荷的氨基酸
分别用蓝色和红色表示ꎻ 小立碗藓的三级结构坐标数据(ＩＤ ｎｕｍｂｅｒ:ＰＭ００７５０１３)从蛋白质模型数据库(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｅｌ Ｄａｔａｂａｓｅ) (ｈｔｔｐ: / / ｍｉ.
ｃａｓｐｕｒ.ｉｔ / ＰＭＤＢ / )下载ꎬ水稻和大豆的三级结构坐标数据(ＩＤ ｎｕｍｂｅｒｓ:１Ｄ８Ｕ和 １ＢＩＮ)从 ＲＣＳＢ蛋白质数据库(ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ)下载ꎮ
Ｆｉｇ. ７　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｎｏｎｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｆｒｏｍ Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓꎬＣｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓ ｔｈａｌｉｃｔｒｏｉｄｅｓꎬｎａｔｉｖｅ ｒｉｃｅ
ＮｓＨｂ１ ａｎｄ ｓｏｙｂｅａｎ Ｌｂａ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈａｒｇｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　 Ｂｌｕｅ ａｎｄ ｒｅｄ ｃｏｌｏｒｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ
ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ｆｏｒ ｎｏｎｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｆｒｏｍ Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｅｌ Ｄａｔａｂａｓｅ (ｈｔｔｐ: / /
ｍｉ.ｃａｓｐｕｒ.ｉｔ / ＰＭＤＢ / )ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ＩＤ ｎｕｍｂｅｒ ＰＭ００７５０１３. Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ＮｓＨｂ１ ａｎｄ ｓｏｙｂｅａｎ Ｌｂａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＩＤ ｎｕｍｂｅｒｓ １Ｄ８Ｕ ａｎｄ １ＢＩＮꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
建了植物血红蛋白的分子系统进化树(图 ６)ꎮ 根据
序列的差异分为两大分支—非共生血红蛋白 １
(Ｎｓ１)、古老的血红蛋白(Ｎｓ)组成的分支和非共生
血红蛋白 ２(Ｎｓ２)、共生血红蛋白( ｓＨｂ)组成的分
支ꎻＣｔＨｂ 位于非共生血红蛋白 １ 的基部ꎬ说明其可
能是非共生血红蛋白 １ 的共同祖先ꎬ并且其进化地
位比古老的苔藓植物血红蛋白稍微高等一点ꎬ这跟
物种的进化关系是吻合的ꎮ
本研究也比较了角齿藓、水蕨、水稻非共生血红
蛋白及大豆的豆血红蛋白三维结构的差异ꎬ揭示了
植物血红蛋白从非共生到共生进化过程中的一些关
键改变(图 ７)ꎮ 这些改变包括:(１)血红素辅基从
六配位体(Ｈｅｘａｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ)到五配位体(Ｐｅｎｔａｃｏｏｒｄｉ￣
ｎａｔｅ)的转变(Ｇｏｐａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ ｅｔ ａｌꎬ２００８)ꎻ(２)
ＣＤ￣ｌｏｏｐꎬＮ￣端和 Ｃ￣端区域长度的缩短ꎻ(３)蛋白结
构更加紧凑ꎬ形成球状结构ꎮ 这些改变可能有助于
非共生血红蛋白向共生血红蛋白结构的转变ꎬ 特别
是有助于豆血红蛋白共生功能的实现(Ｇｏｐａｌａｓｕｂｒａ￣
ｍａｎｉａｍ ｅｔ ａｌꎬ２００８)ꎮ
(下转第 １６１页 Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｏｎ ｐａｇｅ １６１ )
３２２２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 齐小琼等: 水蕨血红蛋白基因的分子克隆和序列分析