全 文 ： Ｇｕｉｈａｉａ Ａｕｇ. ２０１６ꎬ ３６(８):８９７－９０５
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
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ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１６０１０２９
葛风伟ꎬ 曾卫军ꎬ 李艳红ꎬ 等. 小蓬 ＮｅＭＴ２基因的克隆及其植物表达载体的构建 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(８):８９７－９０５
ＧＥ ＦＷꎬ ＺＥＮＧ ＷＪꎬ ＬＩ ＹＨꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＮｅＭＴ２ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｕｍ [Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６
(８):８９７－９０５
小蓬 ＮｅＭＴ２基因的克隆及其植物表达载体的构建
葛风伟ꎬ 曾卫军ꎬ 李艳红ꎬ 赵惠新∗
( 新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室ꎬ 新疆师范大学 生命科学学院ꎬ 乌鲁木齐 ８３００５４ )
摘 要: 该研究利用 ＲＡＣＥ (Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ)技术从小蓬中成功分离编码金属硫蛋白(Ｍｅｔａｌ￣
ｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎꎬＭＴ)的 ｃＤＮＡ序列ꎬ命名为 ＮｅＭＴ２ꎬ在 ＧｅｎＢａｎｋ中登录号为 ＫＴ８３５２９０ꎮ 该基因全长 ５９０ ｂｐꎬ开放阅
读框为 ２３７ ｂｐꎬ编码 ７８个氨基酸ꎬ编码的氨基酸序列中含有 １４个半胱氨酸残基(ＣｙｓꎬＣ)ꎬ呈 Ｃ￣ＣꎬＣ￣Ｘ￣ＣꎬＣ￣Ｘ￣
Ｘ￣Ｃ排列ꎬ集中分布在肽链的 Ｎ端和 Ｃ端ꎬ基因编码蛋白的分子量为 ７.６０３ ６ ｋＤꎬ等电点为 ４.７１ꎮ 系统发育分
析表明ꎬ小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２与藜科的海蓬子(ＡＥＦ０１４９２)和盐穗木(ＡＨＩ６２９５３)同源性最高ꎬ其次是甜菜
(ＸＰ＿０１０６６７７０８.１)ꎮ 生物信息学分析表明ꎬ金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２ 无信号肽结构ꎬ属于非跨膜亲水性蛋白ꎻ疏水
性分析表明ꎬＮｅＭＴ２蛋白的 ３５~４５个氨基酸之间有较强的疏水性ꎬ其中第 ４１位 Ａｓｐ具最强的疏水性(１.４４４)ꎻ
结构预测分析该蛋白质二级结构的主要元件是无规则卷曲ꎮ 通过 ＲＴ￣ＰＣＲ 对 ＮｅＭＴ２ 基因的表达分析发现ꎬ
ＮｅＭＴ２基因在铜矿区和非铜矿区的小蓬叶片中均有表达ꎬ但该基因在铜矿区小蓬叶片的表达量明显高于非铜
矿区ꎮ 将小蓬 ＮｅＭＴ２基因定向克隆到植物表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００的 ３５Ｓ 启动子下游ꎬ构建该基因的植物超
表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００＋ＮｅＭＴ２ꎮ 该研究结果为进一步研究该基因的功能和小蓬响应重金属胁迫的分子机制
提供了一定基础ꎮ
关键词: 小蓬ꎬ ＮｅＭＴ２ꎬ ＲＡＣＥꎬ 序列分析ꎬ 植物表达载体
中图分类号: Ｑ７８６ 文献标识码: Ａ 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０８￣０８９７￣０９
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
ｏｆ ＮｅＭＴ２ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｕｍ
ＧＥ Ｆｅｎｇ￣Ｗｅｉꎬ ＺＥＮＧ Ｗｅｉ￣Ｊｕｎꎬ ＬＩ Ｙａｎ￣Ｈｏｎｇꎬ ＺＨＡＯ Ｈｕｉ￣Ｘｉｎ∗
( Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｕｒｕｍｑｉ ８３００５４ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｕｍ ｈａｓ ａ ｌｏｎｇ ｌｉｖｉｎｇ ｈｉｓｔｏｒｙ ａｔ Ａｌｅｔａｉ Ｃｏｐｐｅｒ Ｍｉｎｅ ｉｎ Ｘｉｎｊｉａｎｇ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｒｅ￣
ｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｔｒｅｓｓꎬ ａ ｎｅｗ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＲＡＣＥ (Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ) ｆｒｏｍ Ｎ. ｅｒｉｎａｃｅｕｍ. Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｎａｍｅｄ ａｓ
ＮｅＭＴ２ꎬ ａｎｄ ｉｔｓ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｗａｓ ＫＴ８３５２９０. Ｔｈｅ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ｇｅｎｅ ＮｅＭＴ２ ｗａｓ ５９０ ｂｐ ｉｎ ｆｕｌｌ
ｌｅｎｇｔｈꎬ ａｎｄ ｉｔ ｈａｄ ２３７ ｂｐ ＯＲＦ (ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ) ｗｈｉｃｈ ｅｎｃｏｄｅｄ ７８ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ. Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ １４ Ｃｙｓ ｒｅｓｉ￣
ｄｕｅｓꎬ ａｒｒａｎｇｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍ ｏｆ Ｃ￣Ｃꎬ Ｃ￣Ｘ￣Ｃ ａｎｄ Ｃ￣Ｘ￣Ｘ￣Ｃꎬ ｉｎ ｔｈｅ ７８ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅｓｅ Ｃｙｓ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｄｉｓｔｒｉｂ￣
ｕｔｅｄ ｉｎ Ｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｎｄ Ｃ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ. Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｅ ＮｅＭＴ２ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｗａｓ ７.６０３ ６ ｋＤ
ａｎｄ ｉｔｓ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｗａｓ ４.７１. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ
收稿日期: ２０１６￣０１￣１９ 修回日期: ２０１６￣０４￣２１
基金项目: 新疆维吾尔自治区自然科学基金(２０１３２１１Ａ０２４)[Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｉｎｊｉａｎｇ (２０１３２１１Ａ０２４)]ꎮ
作者简介: 葛风伟(１９７６￣)ꎬ女ꎬ江苏新沂人ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ从事植物逆境分子生物学研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｍａｓｔｅｒｇｆｗ＠ １６３.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 赵惠新ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ从事植物逆境分子生物学研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)９５４８４３４３７＠ ｑｑ.ｃｏｍꎮ
ｇｅｎｅ ＮｅＭＴ２ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｓ ｔｈｅ Ｓａｌｉｃｏｒｎｉａ ｂｒａｃｈｉａｔａ ( ＡＥＦ０１４９２) ａｎｄ ｔｈｅ Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｃａｓｐｉｃａ
(ＡＨＩ６２９５３)ꎬ ｓｅｃｏｎｄｌｙ ｔｈｅ Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ (ＸＰ ＿０１０６６７７０８.１)ꎬ ｂｕｔ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ
(ＸＰ＿０１０２５３１７１). Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ＮｅＭＴ２ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ
ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ. Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ
ｓｔｒｏｎｇ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｒｅｇｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ３５ ｔｏ ４５ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ４１ Ａｓｐ ｈａｄ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｙ
(１.４４４). Ｐｒｅｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ ｗａｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｉｔｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ. Ｅｘｐｒｅｓ￣
ｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＮｅＭＴ２ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮｅＭＴ２ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｂｏｔｈ ｉｎ Ｃｏｐｐｅｒ Ｍｉｎｅ ａｎｄ ｎｏｒ Ｃｏｐｐｅｒ Ｍｉｎｅ ｉｎ Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｕｍ ｌｅａｖｅｓꎬ ｂｕｔ ｔｈｅ ｆｏｒｍｅｒ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ
ｌａｔｔｅｒꎬ ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＮｅＭＴ２ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｏ ｔｈｅ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｓｔｒｅｓｓ. Ｔｈｅｎ ＮｅＭＴ２ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉ￣
ｎａｃｅｕｍ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｏｖｅｒ￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ ｉｎ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｐｌａｎｔ
ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００＋ＮｅＭＴ２ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ. Ｔｈｅｓｅ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ
ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＮｅＭＴ２ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｒｅｐｎｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｓｔｒｅｓｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｕｍꎬ ＮｅＭＴ２ꎬ ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓꎬ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
金属硫蛋白(ＭｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎꎬＭＴ)是一类广泛
存在于生物体内的低分子量(６ ０００ ~ ７ ０００ Ｄａ)蛋
白ꎬ富含半胱氨酸(ＣｙｓｔｉｎｅꎬＣｙｓ)ꎬ对多种金属有高度
亲和性ꎮ 植物金属硫蛋白在重金属离子解毒及金属
离子代谢 (常团结和朱祯ꎬ ２００２ａ)、活性氧清除
(Ａｋａｓｈｉ ｅｔ ａｌꎬ２００４)、转运和储存金属离子(Ｂｅｌｇｈｉｔｈ
ｅｔ ａｌꎬ ２０１６)、维持金属离子稳态(Ｈｅｇｅｌｕｎｄ ｅｔ ａｌꎬ
２０１２)等方面起到重要作用ꎮ 另外ꎬ该基因还参与
了植物的生长发育、胚胎发育、果实成熟、衰老和抗
逆反应等植物生理过程(常团结和朱祯ꎬ２００２ａꎬｂꎻ
Ｃｈａｒｂｏｎｎｅｌ￣Ｃａｍｐａａ ｅｔ ａｌꎬ ２０００)ꎮ 因此ꎬ对金属硫蛋
白基因 ＭＴ的研究将成为植物抗逆研究中的一个重
要方向(樊连梅等ꎬ２０１１)ꎮ 目前ꎬ已从 ＮＣＢＩ 数据库
中搜索到拟南芥等多种植物的金属硫蛋白基因ꎬ但
对其功能研究还知之甚少ꎮ 随着现代生物学技术的
日新月异ꎬ植物抗逆基因资源的开发及转基因育种
方面的研究ꎬ已成为植物逆境分子生物学的热点和
农业抗逆领域的重要课题(颜宏等ꎬ２００６)ꎮ
小蓬(Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｕｍ)是藜科小蓬属植
物ꎬ是重要的抗逆植物ꎮ 常生于戈壁、石质山坡ꎬ其
适应性极强ꎬ在我国仅分布于新疆(新疆植物志编
委会ꎬ１９９４)ꎮ 阿勒泰市是新疆重点有色金属开发
带ꎬ通过前期野外考察发现小蓬是阿勒泰富蕴县铜
矿区的优势物种之一ꎮ 目前对小蓬的研究多集中在
抗逆生理学方面ꎬ关于其抗逆的分子机制尤其是小
蓬金属硫蛋白基因 ＭＴ 的研究未见报道ꎮ 因此ꎬ本
研究以小蓬叶片为材料ꎬ通过 ＲＡＣＥ 技术从小蓬中
克隆得到金属硫蛋白基因 ＮｅＭＴ２ 的 ｃＤＮＡ 全长序
列ꎬ利用生物信息分析方法对 ＮｅＭＴ２ 基因编码的氨
基酸序列与组成、蛋白质理化性质、发育树进化分
析、跨膜区与信号肽、疏水性分析、蛋白质二级结构
进行预测ꎮ 通过 ＲＴ￣ＰＣＲ 技术分析了 ＮｅＭＴ２ 基因
的表达ꎬ以 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ 载体为基本载体构建了
该基因的表达载体ꎬ上述工作将为小蓬金属硫蛋白
基因 ＮｅＭＴ２功能的研究提供理论依据ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
１.１.１ 试验材料 利用大量采样法分别采集生长在
新疆阿勒泰富蕴县铜矿区 (４６° ４５. ４７７′ Ｎꎬ８９° ４１.
４３０′ Ｅ)和非铜矿区(距离铜矿区 ３.５ ｋｍ的国道)的
小蓬植株ꎬ选取株龄基本一致的小蓬顶端光合枝叶
片作为材料ꎮ 在小蓬生长旺盛的铜矿区选取 ３ 个 ５
ｍ × ５ ｍ的采集区样方ꎬ分别于每个样方的 ４ 个方
向各选 １个点ꎬ每个点选取 ５株共 ６０株小蓬进行样
品采集ꎮ 同时选取距铜矿区 ３.５ ｋｍ 处的非矿区采
集小蓬叶片ꎬ方法同矿区一致ꎮ 收集的叶片样品经
液氮处理后带回实验室ꎬ置于－７０ ℃冰箱中保存ꎬ提
取的总 ＲＮＡ用于 ＲＴ￣ＰＣＲ分析ꎮ
１.１.２ 试剂 菌株 Ｅ. ｃｏｌｉ ＤＨ５α由实验室保存ꎬ质粒
载体为 ｐＭＤ１８￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)ꎮ ＭＭＬＶ第一链
ｃＤＮＡ 反转录试剂盒等购自宝生物公司ꎬ ＴＲＩｚｏｌ、
ＤＮＡ凝胶回收试剂盒(ＡｘｙＧＥＮ)、ＰＣＲ 扩增试剂盒
均购自北京天根公司ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 总 ＲＮＡ 的提取与第一链 ｃＤＮＡ 合成 采用
ＴＲＩｚｏｌ法提取小蓬幼叶总 ＲＮＡꎮ 提取的总 ＲＮＡ 上
样于 １％琼脂糖凝胶中ꎬ检测 ＲＮＡ的完整性ꎮ 取 １１
μＬ的总 ＲＮＡ 为模板ꎬ依据 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ￣
８９８ 广 西 植 物 ３６卷
ＭＬＶ(ＲＮａｓｅＨ－)(ＴａＫａＲａ)反转录试剂盒进行 ｃＤＮＡ
第一链的合成ꎮ 合成的 ｃＤＮＡ 样品稀释 ５ ~ １０ 倍ꎬ
置于－２０ ℃冰箱中ꎬ用于后续的基因克隆实验ꎮ 设
计金属硫蛋白基因克隆引物(表 １)ꎬ送至华大基因
科技有限公司合成ꎮ
１.２.２ ＮｅＭＴ２基因的克隆与序列测定 根据本课题
组前期研究获得的金属硫蛋白基因部分序列
(ＫＴ８２１０８８ꎬ２２１ ｂｐ)ꎬ设计 ３′ＲＡＣＥ 上游引物 ＧＳＰ３′
１ 和 ＧＳＰ３′ ２(表 １)进行 ＮｅＭＴ２基因 ３′序列的克隆ꎮ
以上述反转录的 ｃＤＮＡ 第一链为模板ꎬ表 １ 相对应
的引物进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ ＧＳＰ３′ １ 为上游引物ꎬＡＰ１
为下游引物ꎬ进行第 １ 轮扩增ꎮ ＧＳＰ３′ ２ 为上游引
物ꎬＡＰ２ 为下游引物ꎬ进行第 ２ 轮扩增ꎮ 同样根据
ＮｅＭＴ２ 基因部分序列设计 ５′ ＲＡＣＥ 的下游引物
ＧＳＰ５′１ 和 ＧＳＰ５′２(表 １)进行 ＮｅＭＴ２基因 ５′序列的
克隆ꎮ 以 ＡＰ３为上游引物ꎬＧＳＰ５′１ 为下游引物ꎬ进
行第 １轮扩增反应ꎮ 以 ＡＰ４为上游引物ꎬＧＳＰ５′２为
下游引物进行第 ２轮扩增反应ꎮ
利用克隆获得 ＮｅＭＴ２的 ３′和 ５′的基因片段ꎬ拼
接得到 ＮｅＭＴ２基因的全长 ｃＤＮＡ序列ꎮ 用 ＮＣＢＩ 的
ＯＲＦ程序搜索 ＮｅＭＴ２ 的开放阅读框( ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅꎬＯＲＦ)ꎬ设计全长特异性引物 ＮｅＭＴ２￣Ｆ 和
ＮｅＭＴ２￣Ｒ(表 １)ꎬＰＣＲ 扩增 ＮｅＭＴ２ 基因的编码区ꎮ
扩增产物上样于 １.２％的琼脂糖凝胶检测片段大小ꎬ
根据凝胶回收试剂盒说明书进行片段回收与纯化ꎮ
取 ４.５ μＬ 纯化产物与 １ μＬ ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体连接ꎬ连
接产物转化大肠杆菌感受态细胞ꎬ以氨苄为筛选标
记在 ＬＢ固体培养基上 ３７ ℃过夜培养ꎬ之后进行蓝
白斑筛选重组子ꎮ 挑取单克隆菌落摇菌培养ꎬ进行
ＰＣＲ鉴定ꎬ菌液送华大基因科技有限公司测序ꎮ
１.２.３ ＮｅＭＴ２基因生物信息学分析 用 ＮＣＢＩ(ｈｔｔｐ: / /
ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ. ｇｏｖ / )的 ＢＬＡＳＴ 软件进行同源性
搜索ꎬ用 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ程序(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.
ｇｏｖ / ｇｏｒｆ / ｇｏｒｆ.ｈｔｍｌ)预测金属硫蛋白基因的开放阅读
框ꎻ用 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.
ｇｏｖ / Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ / ｃｄｄ / ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ)进行蛋白质保守区分
析ꎻ之后使用 ＣｌｕｓｔａｌＸ 软件进行氨基酸序列的多重
比对分析ꎻ采用 ＭＥＧＡ ５.０构建了系统进化树ꎻ利用
ＥｘＰＡＳｙ 的 ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔ￣
ｐａｒａｍ / )分析编码蛋白质的相对分子量、等电点、亲
水性分析等理化性质(Ｗａｌｋｅｒꎬ２００５)ꎻ用 ＥｘＰＡＳｙ 的
ＰｒｏｔＳｃａｌｅ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｐｒｏｔｓｃａｌｅ /
ｐｒｏｔｓｃａｌｅ.ｐｌ) 以默认算法 (Ｈｐｈｏｂ. / Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ)
表 １ 小蓬 ＮｅＭＴ２基因克隆引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｌｉｓｔ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ＮｅＭＴ２ ｇｅｎｅ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
核酸序列
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＧＳＰ３′ １ ＡＴＴＴＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＡＡＡＣＣＣＴ
ＧＳＰ３′ ２ ＣＡＴＣＡＴＣＧＴＡＧＡＣＧＧＴＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡ
ＧＳＰ５′ １ ＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＴ
ＧＳＰ５′ ２ ＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＡＧＧＧＴＴＴＧＡ
ＡＰ１ ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
ＡＰ２ ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
ＡＰ３ ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧＧＧ
ＡＰ４ ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ
ＮｅＭＴ２￣Ｆ ＡＴＧＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴ
ＮｅＭＴ２￣Ｒ ＴＣＡＣＴＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
进行疏水性分析(Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌꎬ１９８２)ꎻ利用 ＴＭＨＭＭ
Ｓｅｒｖｅｒ ｖ. ２. ０ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ / ＴＭ￣
ＨＭＭ / )和 ＴＭｐｒｅｄ Ｓｅｒｖｅｒ(ｈｔｔｐ: / / ｃｈ.ｅｍｂｎｅｔ.ｏｒｇ / ｓｏｆｔ￣
ｗａｒｅ / ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ. ｈｔｍｌ)进行金属硫蛋白跨膜区
预测ꎻ采用 ＳｉｇｎａｌＰ４.１(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖ￣
ｉｃｅｓ / ＳｉｇｎａｌＰ)对编码蛋白信号肽进行预测分析(Ｐｅ￣
ｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌꎬ２０１１)ꎻ用 ＳＯＰＭＡ 程序 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｎｐｓａ￣
ｐｒａｂｉ. ｉｂｃｐ. ｆｒ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ. ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ＿
ｓｏｐｍ.ｈｔｍｌ)预测 ＮｅＭＴ２ 蛋白的二级结构(Ｇｅｏｕｒｊｏｎ
＆ Ｄｅｌｅａｇｅꎬ１９９５)ꎮ
１.２.４ ＮｅＭＴ２基因 ＲＴ￣ＰＣＲ 表达分析 利用大量采
样法分别采集生长在新疆阿勒泰富蕴县铜矿区和非
铜矿区小蓬植株ꎬ采集小蓬顶端光合枝的叶片用
ＴＲＩｚｏｌ法提取总 ＲＮＡꎬ用酶标仪(Ｂｉｏ￣ｔｅｋ ＥＬｘ ８００)
测定 ＲＮＡ的浓度ꎮ 分别取矿区和非矿区的小蓬叶
片等量总 ＲＮＡꎬ依据 Ｍ￣ＭＬＶ 反转录试剂盒(ＴａＫａ￣
Ｒａ)进行 ｃＤＮＡ第一链的合成ꎮ 根据藜科植物 Ａｃｔｉｎ
基因序列设计一对引物 Ａｃｔｉｎ￣Ｆ: ５′￣ＧＴＧＧＴＣＧＴＡ￣
ＣＡＡＣＧＧＴＡＴＴＧＴＧ￣３′ꎬＡｃｔｉｎ￣Ｒ:５′￣ＧＡＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣ￣
ＣＡＧＡＣＡＣＴＧ￣３′ꎮ 以反转录的第一链 ｃＤＮＡ 为模
板ꎬ用上述合成的 Ａｃｔｉｎ 引物和 ＮｅＭＴ２ 基因特异性
引物同批异管进行 ＲＴ￣ＰＣＲ基因表达分析ꎮ
１.２.５ ＮｅＭＴ２基因真核表达载体的构建 用 ＢａｍＨ Ｉ
和 Ｐｓｔ Ｉ 双酶切含有 ＮｅＭＴ２ 基因的克隆载体
ｐＭＤ１８￣ＴꎬｐＣＡＭＢＩＡ１３００ 质粒同样进行双酶切ꎬ经
琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收及纯化ꎮ 将目的
基因与 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ 载体进行体外连接ꎬ构建
ＮｅＭＴ２ 基因的植物表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ ＋
９９８８期 葛风伟等: 小蓬 ＮｅＭＴ２基因的克隆及其植物表达载体的构建
ＮｅＭＴ２ꎮ 随后转化到大肠杆菌感受态细胞中ꎬ在含
Ｋａｎ的 ＬＢ固体培养基中培养 ꎮ 将转化出来的单菌
落通过摇菌ꎬ将经过菌液 ＰＣＲ鉴定的阳性菌液进行
质粒抽提ꎮ 将抽提的重组质粒分别使用 ＢａｍＨ Ｉ 和
Ｐｓｔ Ｉ进行双酶切ꎬ根据片段大小鉴定质粒的构建ꎮ
２ 结果与分析
２.１ ＲＮＡ质量检测
由图 １ 可见ꎬ２８Ｓ、１８Ｓ 和 ５Ｓ 条带整齐清晰ꎬ表
明所提总 ＲＮＡ 完整性较好ꎬ没有降解ꎻ紫外分光光
度检测 ＯＤ２６０ / ＯＤ２８０为 １.８ ~ ２.０ 之间ꎮ 提取的总
ＲＮＡ的纯度及完整性都较高ꎬ可用于下一步的反转
录分析ꎮ
图 １ ＲＮＡ凝胶电泳图
Ｆｉｇ. １ ＲＮＡ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
２.２ 小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２基因的克隆
由图 ２ 可知ꎬ通过 ＮＣＢＩ 数据库进行比对ꎬ
Ｂｌａｓｔｎ比对结果显示:其与藜科植物海蓬子 ＭＴ基因
(ＧｅｎＢａｎｋ 登录号:ＫＦ８７６１７８. １)序列的同源性为
８３％ꎬ与盐穗木 ＭＴ２ 基因 ( ＧｅｎＢａｎｋ 登录号:
ＪＦ７８０９１３.１)序列的同源性为 ８０％ꎮ 小蓬金属硫蛋
白基因与其它植物的金属硫蛋白基因的亲缘关系也
较近ꎬ序列同源性分析见表 ２ꎬ可推测其为 ＭＴ 家族
成员ꎮ 将克隆的基因命名为 ＮｅＭＴ２ꎬ并提交到 Ｇｅｎ￣
Ｂａｎｋ上ꎬ登录号为 ＫＴ８３５２９０ꎮ
克隆获得的 ＮｅＭＴ２基因全长 ５９０ ｂｐꎬ通过生物
信息学 ( ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ)分析其完整的开放阅读框
(ＯＲＦ)ꎮ 发现该基因包含一个 ２３７ ｂｐ 开放阅读框ꎬ
编码 ７８ 个氨基酸ꎬ其中 ５′非编码区 ２１１ ｂｐꎬ３′非编
码区 ４１２ ｂｐ(图 ３)ꎮ
２.３ 小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２理化性质预测及分析
ＥｘＰＡＳｙ ＰｒｏｔＰａｒａｍ预测表明ꎬ小蓬 ＮｅＭＴ２基因
表 ２ ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔｎ同源序列搜索
Ｆｉｇ. ２ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｅａｒｃｈ ｂｙ ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔｎ
金属硫蛋白基因
ＭＴ ｇｅｎｅ
登录号
Ａｃｃｅｓｓ Ｎｏ.
同源性
Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ
(％)
Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｃａｓｐｉｃａ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ
ｍＲＮＡꎬ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ
ＫＦ８７６１７８.１ ８３
Ｓａｌｉｃｏｒｎｉａ ｂｒａｃｈｉａｔａ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ
(ＭＴ￣２) ｍＲＮＡꎬ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ
ＪＦ７８０９１３.１ ８０
Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ￣
ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｐｅ ２
ＸＭ＿０１０６６９４０６.１ ８０
Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｍ ｍｅｔ￣
ａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ
ＡＦ０００９３５.１ ７８
Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃｒｕｅｎｔｕｓ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ
ｍＲＮＡ
ＡＦ２６８０２７.１ ７８
Ｌｉｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ｔｙｐｅ ２ ＥＦ１０３５７５.１ ７７
编码蛋白的分子式为 Ｃ３００Ｈ４７７Ｎ８９Ｏ１０８ Ｓ１７ꎬ理论分子
量为 ７.６０３６ ｋＤꎬ理论等电点为 ４.７１ꎻ预测该蛋白的
半衰期为 ３０ ｈ ꎬ不稳定参数为 ３０.７２ ꎬ预测其为稳定
蛋白(< ４０ 为稳定蛋白)ꎮ 相对含量较多的氨基酸
有 Ｇｌｙ (１５个ꎬ１９.２％)ꎬＣｙｓ (１４ 个ꎬ １７.９％)ꎬＡｌａ(８
个ꎬ１０.３％)ꎬＡｓｎ (６个ꎬ７.７％)ꎬＬｙｓ(５个ꎬ６.４％)ꎬＰｒｏ
(４ 个ꎬ５.１％)ꎬＳｅｒ(４ 个ꎬ５.１％)ꎬＴｈｒ(４ 个ꎬ５.１％)ꎬ
Ｇｌｕ ( ４ 个ꎬ ５. １％)ꎬ Ａｓｐ ( ３ 个ꎬ ３. ８％)ꎬ Ｉｌｅ ( ３ 个ꎬ
３.８％)ꎬＭｅｔ(３个ꎬ３.８％)ꎬＰｈｅ(２ 个ꎬ２.６％)和 Ｖａｌ(２
个ꎬ２. ６％)ꎻ相对含量较少的氨基酸有 Ｔｙｒ ( １ 个ꎬ
１.３％)ꎻＮｅＭＴ２ 蛋白不含有 ＰｙｌꎬＳｅｃꎬＡｒｇꎬＴｒｐꎬＬｅｕꎬ
Ｇｌｎ和 Ｈｉｓꎮ 亲水性平均数为－０.０２７ꎬ预测 ＮｅＭＴ２
蛋白为亲水性蛋白ꎮ
２.４ 小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２ 氨基酸序列比对和系
统进化树分析
２.４.１ 金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２ 氨基酸序列比对分析 根
据 Ｂｌａｓｔ搜索ꎬ筛选出与小蓬 ＮｅＭＴ２ 蛋白序列相似
度较高的 ７ 个植物金属硫蛋白的同源序列ꎬ采用
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ软件进行多重序列的比对分析(图 ４)ꎮ
发现小蓬 ＮｅＭＴ２ 蛋白的氨基酸序列同藜科海
蓬子 ( Ｓａｌｉｃｏｒｎｉａ ｂｒａｃｈｉａｔａ) 和盐穗木 ( Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ
ｃａｓｐｉｃａ)相似序列较高ꎮ ＮｅＭＴ２ 基因编码的氨基酸
序列共有 １４个 Ｃｙｓ残基ꎬ该残基主要集中在肽链的
Ｎ端和 Ｃ 端ꎮ Ｃｙｓ 残基以 Ｃ￣Ｃ 型ꎬＣ￣Ｘ￣Ｃ 型和 Ｃ￣Ｘ￣
Ｘ￣Ｃ型排列ꎬ其中 Ｃ￣Ｘ￣Ｃ 型在该氨基酸序列出现了
５次ꎮ 该氨基酸中部不含有 Ｃｙｓꎬ保守性很低ꎮ 可
见ꎬＣｙｓ残基的数目和位置在不同物种间都有很高
的保守性ꎮ 根据 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ 程序预测小蓬
ＮｅＭＴ２蛋白的保守序列ꎬ发现第 ２６~７７个氨基酸之
００９ 广 西 植 物 ３６卷
图 ２ 小蓬 ＮｅＭＴ２基因全长 ｃＤＮＡ及其推测的氨基酸序列 编码区用下划线标出(起始密码子 ＡＴＧꎬ终止密码子 ＴＧＡ)ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｔｏｔａｌ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＮｅＭＴ２ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｕｍ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｓ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ (ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ ｉｓ ＡＴＧꎬ ａｎｄ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ ｉｓ ＴＧＡ).
图 ３ ＮｅＭＴ２ ＰＣＲ产物扩增 Ｍ. 分子量标记 (ＤＬ ２ ０００)ꎻ
１. ３′ ＲＡＣＥ产物ꎻ ２. ５′ ＲＡＣＥ产物ꎻ ３. ＣＤＳ产物ꎮ
Ｆｉｇ. ３ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＮｅＭＴ２
Ｍ. Ｍａｒｋｅｒ (ＤＬ ２ ０００)ꎻ １. ３′ ＲＡＣＥ ｐｒｏｄｕｃｔꎻ
２. ５′ ＲＡＣＥ ｐｒｏｄｕｃｔꎻ ３. ＣＤＳ ｐｒｏｄｕｃｔ.
间的序列是 Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ－２的保守区ꎬ该区域具有
金属硫蛋白基因典型的结构域特征ꎬ从而确定
ＮｅＭＴ２基因为Ⅱ类金属硫蛋白基因(ＣｌａｓｓⅡ)(图 ５)ꎮ
２.４.２ 系统进化树分析 从 ＮＣＢＩ 上搜索了海蓬子、
盐穗木、蝇子草(Ｓｉｌｅｎｅ ｎｉｃｅｅｎｓｉｓ)、甜菜(Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒ￣
ｉｓ)、红树(Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｇｙｍｎｏｒｈｉｚａ)莲(Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆ￣
ｅｒａ)、苋菜(Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃｒｕｅｎｔｕｓ)棉花(Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒ￣
ｂｏｒｅｕｍ)、菠菜(Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ)、马黛茶( ＩＩｅｘ ｐａｒａ￣
ｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ)、 拟南芥 ( Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ )、 荠蓝
(Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ)和星星草(Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ)共
１３种植物的金属硫蛋白基因的氨基酸序列ꎬ用于系
统发育树的构建(图 ６)ꎮ 进化分析表明ꎬ藜科的海
蓬子(ＡＥＦ０１４９２)和盐穗木(ＡＨＩ６２９５３)来自同一个
进化分枝ꎬ而本研究所克隆 ＮｅＭＴ２ 基因所推测的氨
基酸序列与这二者的同源性最高ꎬ其次是甜菜(ＸＰ＿
０１０６６７７０８.１)ꎻ而与莲(ＸＰ ＿０１０２５３１７１)和马黛茶
(ＡＦＰ９３９６４)的亲缘关系最远ꎮ
２.５ 小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２跨膜结构、信号肽预测
及疏水性分析
蛋白质跨膜结构域预测表明ꎬＮｅＭＴ２ 蛋白的肽
链位于细胞膜外ꎬ说明该蛋白没有跨膜结构域ꎮ 利
用 ＳｉｇｎａｌＰ ４.１对 ＮｅＭＴ２蛋白信号肽进行预测分析ꎬ
发现该蛋白并不存在信号肽序列ꎮ 可见ꎬ小蓬
ＮｅＭＴ２蛋白属于非跨膜、非分泌型蛋白ꎮ
通过 Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ程序对蛋白质的疏水性预测(图
７)结果可知ꎬ小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２中部疏水性较
强ꎬ而两端则为亲水区ꎮ 由图可知ꎬ第 ６４ 位 Ｃｙｓ 的
亲水性最强ꎬ分值为－１.１７８(最低)ꎻ第 ４１ 位 Ａｓｐ 的
疏水性最强ꎬ分值为 １.４４４(最高)ꎮ
２.６ 小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２的二级结构预测分析
利用 ＳＯＰＭＡ程序预测小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２
的二级结构(图 ８)ꎮ 由图 ８可知ꎬ金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２
的二级结构包含 ６５.３８％的无规则卷曲、１６.６７％的
α￣螺旋、１１.５４％的延伸链、６.４１％的 β￣折叠ꎮ 可见ꎬ
无规则卷曲在该蛋白的二级结构中占有大多数ꎬ预
测其形成 α￣螺旋、β￣折叠的氨基酸很少ꎮ
２.７ ＮｅＭＴ２基因 ＲＴ￣ＰＣＲ表达分析
以小蓬肌动蛋白 Ａｃｔｉｎ基因为内参进行定量ꎬ通
过 ＲＴ￣ＰＣＲ 对 ＮｅＭＴ２ 基因在矿区和非矿区小蓬叶
片中的表达进行分析ꎮ 图 ９结果表明ꎬ ＮｅＭＴ２基因
１０９８期 葛风伟等: 小蓬 ＮｅＭＴ２基因的克隆及其植物表达载体的构建
图 ４ 小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２与 ７种植物 ＭＴ蛋白序列的比对
Ｆｉｇ. ４ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ＮｅＭＴ２ ｆｒｏｍ Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｕｍ ｗｉｔｈ ＭＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｓｅｖｅｎ ｐｌａｎｔｓ
图 ５ ＮｅＭＴ２氨基酸保守功能区
Ｆｉｇ. ５ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＮｅＭＴ２
在铜矿区和非铜矿区的小蓬叶片中均有表达ꎬ但该
基因在铜矿区小蓬叶片的表达量明显高于非铜矿区ꎮ
２.８ ＮｅＭＴ２基因真核表达载体的构建和鉴定
用 ＢａｍＨ Ｉ和 Ｐｓｔ Ｉ 双酶切克隆载体 ｐＭＤ１８￣Ｔ＋
ＮｅＭＴ２和 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ꎬ将 ＮｅＭＴ２ 片段和 ｐＣＡＭ￣
ＢＩＡ１３００载体片段用 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶连接ꎬ转化大
肠杆菌 ＤＨ５ａꎬ筛选的阳性克隆用酶切验证(图 １０)ꎮ
从图 １０(泳道 ３)可知ꎬ重组质粒用 ＢａｍＨ Ｉ 和 Ｐｓｔ Ｉ
双酶切获得一条约 ２３０ ｂｐ的条带ꎬ说明构建的植物
表达载体已成功将小蓬 ＮｅＭＴ２基因整合进去ꎮ
３ 讨论
通过前期野外考察ꎬ发现小蓬是阿勒泰富蕴县
铜矿区的优势物种ꎮ 目前ꎬ关于金属硫蛋白基因
ＭＴ的结构组成及特点、该基因在小蓬耐受重金属
胁迫过程中的作用等相关研究未见报道ꎮ
本研究采用 ＲＡＣＥ技术从小蓬叶片中克隆得到
金属硫蛋白基因 ＮｅＭＴ２ 的 ｃＤＮＡ 全长序列ꎮ 通常
依据氨基酸序列中 Ｃｙｓ 残基的排列方式对植物金属
硫蛋白基因进行分类(张艳等ꎬ２００７)ꎮ 根据 Ｃｏｂｂｅｔｔ
＆ Ｇｏｌｄｓｂｒｏｕｇｈ(２００２)的分类方法将小蓬金属硫蛋
白 ＮｅＭＴ２ 归为第Ⅱ类ꎮ Ⅱ类 ＭＴ 不存在信号肽序
列ꎬ无跨膜结构域ꎬ属于非分泌亲水性蛋白ꎻ其蛋白
质二级结构的主要元件是无规则卷曲(孟红恩等ꎬ
２０１４)ꎮ 对克隆得到的小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２ 进行
生物信息学分析表明ꎬＮｅＭＴ２ 蛋白二级结构的主要
成分是无规则卷曲ꎬ预测其二级结构中较少形成 α￣
螺旋和 β￣折叠的肽段ꎮ 张艳等(２００６)认为 ＭＴ 分
子中不含 α￣螺旋和 β￣折叠肽段ꎬ但存在一种很坚固
的构象ꎬ本研究的预测与该文献相符ꎮ 另外ꎬＮｅＭＴ２
蛋白中共含有 １４个 Ｃｙｓ残基ꎬ占该蛋白总氨基酸的
１７.９％ꎬ这些 Ｃｙｓ 残基主要分布在肽链的 Ｎ 端和 Ｃ
端ꎮ 本研究同源序列比对表明ꎬ不同来源的植物金
２０９ 广 西 植 物 ３６卷
图 ６ 小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２系统进化树分析
标尺在左下方ꎬＢｏｏｔｓｔａｐ ＝ １ ０００ꎮ
Ｆｉｇ. ６ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ＮｅＭＴ２
ｆｒｏｍ Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｕｍ Ｔｈｅ ｓｃａｌｅ ｗａｓ ａｔ ｔｈｅ ｂｏｔｔｏｍ￣ｌｅｆｔꎬ
ａｎｄ ｔｈｅ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ １ ０００ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ.
图 ７ 小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２疏水性分析
Ｆｉｇ. ７ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ
ＮｅＭＴ２ ｆｒｏｍ Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｕｍ
属硫蛋白两端序列的同源性很高ꎬ而中部同源性低ꎬ
Ｃｙｓ残基都集中分布在肽链的 Ｎ 端和 Ｃ 端ꎬ可见 Ｎ
端和 Ｃ端序列对金属硫蛋白的结构和功能的重要
性ꎮ 金属硫蛋白基因结构典型的特征是 Ｃｙｓ含量高
(Ｈａｍｅｒꎬ１９８６)ꎮ 该结构也是金属硫蛋白对重金属
胁迫应答的结构基础(刘瑜等ꎬ２０１１ꎻＬｉｕ ｅｔ ａｌꎬ２０１６)ꎮ
金属硫蛋白与生物体内的多种生理功能相关ꎬ
其最为主要的功能就是解除重金属离子的毒害作
用ꎬ提高植物的重金属耐性ꎮ 金属硫蛋白富含 Ｃｙｓ
残基ꎬ肽链中巯基(ＳＨ)含量高因而导致其对重金属
的亲和力高ꎬ该蛋白可以螯合 Ｃｕ、Ｚｎ、Ｐｂ 等 １８ 种重
金属ꎬ所以金属硫蛋白在解除重金属毒害方面起着
重要作用(赵之伟等ꎬ２０１３)ꎮ 龙葵的金属硫蛋白
ＭＴＳ基因家族已被证明涉及重金属铬、铜的解毒
(Ｆｉｄａｌｇｏ ｅｔ ａｌꎬ ２０１３ꎻＴｅｉｘｅｉｒａ ｅｔ ａｌꎬ ２０１３)ꎮ 植物金
属硫蛋白两端富含 Ｃｙｓ 的区域在中间区的帮助下相
互接近ꎬ与金属离子结合形成一个结构域( Ｊｏｒｄｉ ｅｔ
ａｌꎬ２００６ꎻ孟红恩等ꎬ２０１４)ꎮ 在植物对 Ｚｎ２＋和 Ｃｕ２＋的
解毒过程中ꎬ金属硫蛋白是通过巯基与金属离子结
合ꎬ从而降低重金属离子的毒性 ( Ｎａｔｈａｌｉｅ ｅｔ ａｌꎬ
２００１)ꎮ 但到目前为止ꎬ金属硫蛋白参与植物重金
属解毒的作用机理仍不十分清楚ꎮ
植物金属硫蛋白基因的表达具有可诱导性ꎮ 植
物金属硫蛋白基因的表达受金属离子、高盐、干旱、
低温、热激等不同环境因子的影响 (全先庆等ꎬ
２００６ꎻ张艳等ꎬ２００７)ꎮ 目前研究最多的是植物金属
硫蛋白基因对重金属的胁迫响应ꎮ Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ
(２０１２)研究发现ꎬ藜科植物海蓬子在高盐、高温和
干旱胁迫处理下ꎬ金属硫蛋白基因 ＳｂＭＴ￣２ 表达量
增加ꎻ而受冷胁迫处理后ꎬ该基因的表达量明显下
降ꎬ说明 ＳｂＭＴ￣２ 基因可能在提高海蓬子抵御逆境
方面发挥了重要作用ꎮ 转基因及基因敲除技术已广
泛用于金属硫蛋白的功能研究ꎬ结果证实金属硫蛋
白不但能降低重金属对植物的毒害ꎬ还能提高植物
的耐受性(Ｂｒｋｌｊａｃｉｃ ｅｔ ａｌꎬ２００４ꎻ赵之伟等ꎬ２０１３)ꎮ
Ｔｕｒｃｈｉ ｅｔ ａｌ ( ２０１２)发现ꎬ转入菜豌豆金属硫蛋白
ＭＴＡ１基因的白杨ꎬ对重金属锌和铜的抗性显著提
高ꎻ转金属硫蛋白 ＭＴ 基因的矮牵牛对铅的抗性及
吸收能力明显增强(李伟等ꎬ２００１)ꎻ转木豆 ＭＴ１ 基
因的拟南芥植株ꎬ对重金属 Ｃｕ２＋和 Ｃｄ２＋的抗性明显
提高( Ｓｅｋｈａｒ ｅｔ ａｌꎬ２０１１)ꎮ 在拟南芥中表达 ＭＴ４ａ
基因提高了铜胁迫下植物的金属耐性ꎬ使植物体中
铜的积累量增加 (Ｒｏｄｒíｇｕｅｚ￣Ｌｌｏｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌꎬ２０１０)ꎮ
植物金属硫蛋白既受重金属离子诱导又有重金属解
毒的作用ꎬ该蛋白可以作为一种重金属污染生物标
志物(陈春等ꎬ２００９)ꎮ
新疆阿勒泰富蕴县铜矿区和非铜矿区土壤重金
属 Ｃｕ含量分别为 ４ ０３５.６５和 １ １００.０９ ｍｇｋｇ￣１(前
期研究结果)ꎮ 本研究利用 ＲＴ￣ＰＣＲ 对小蓬 ＮｅＭＴ２
基因的表达进行分析ꎬ发现 ＮｅＭＴ２ 基因在铜矿区小
蓬叶片的表达量明显高于非铜矿区ꎮ 可见ꎬＮｅＭＴ２
基因的表达随着重金属 Ｃｕ 含量的不同表现出明显
３０９８期 葛风伟等: 小蓬 ＮｅＭＴ２基因的克隆及其植物表达载体的构建
图 ８ 小蓬金属硫蛋白 ＮｅＭＴ２的二级结构预测
Ｆｉｇ. ８ Ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｐｒｅｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ＮｅＭＴ２ ｆｒｏｍ Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ ｅｒｉｎａｃｅｕｍ
图 ９ 小蓬 ＮｅＭＴ２基因的 ＲＴ￣ＰＣＲ表达分析 Ｍ. 分子
量标记 ＤＬ ２ ０００ꎻ １. ＮｅＭＴ２基因(非铜矿区)ꎻ ２. ＮｅＭＴ２基因
(铜矿区)ꎻ ３. Ａｃｔｉｎ基因(非铜矿区)ꎻ ４. Ａｃｔｉｎ基因(铜矿区)ꎮ
Ｆｉｇ. ９ ＲＴ￣ＰＣＲ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＮｅＭＴ２ ｆｒｏｍ Ｎａｎｏｐｈｙｔｏｎ
ｅｒｉｎａｃｅｕｍ Ｍ. Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２ ０００ꎻ １. ＮｅＭＴ２ ｇｅｎｅ (ｎｏｒ￣ｍｉｎｉｎｇ ａｒｅａ)ꎻ
２. ＮｅＭＴ２ ｇｅｎｅ (ｍｉｎｉｎｇ ａｒｅａ)ꎻ ３. Ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ (ｎｏｒ￣ｍｉｎｉｎｇ
ａｒｅａ)ꎻ ４. Ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ (ｍｉｎｉｎｇ ａｒｅａ).
的变化ꎬ暗示该基因有可能参与小蓬对重金属 Ｃｕ
胁迫的应答过程ꎮ 鉴于此ꎬ该基因可作为培育抗重
金属转基因植物的优良基因ꎮ 当然ꎬ该基因参与小
蓬重金属胁迫应答的分子机理还有待于更深入的研
究ꎮ 小蓬金属硫蛋白基因 ＮｅＭＴ２ 的克隆与表达载
体的构建ꎬ将为进一步研究该基因的功能奠定基础ꎮ
参考文献:
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图 １０ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ中的载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００＋
ＮｅＭＴ２的酶切验证 Ｍ. ＤＮＡ分子量标记ꎻ １. ｐＣＡＭＢＩＡ１３００＋
ＮｅＭＴ２重组质粒ꎻ ２. ｐＣＡＭＢＩＡ１３００＋ＮｅＭＴ２重组质粒
ＢａｍＨ Ｉ单酶切产物ꎻ ３. ｐＣＡＭＢＩＡ１３００＋ＮｅＭＴ２
重组质粒 ＢａｍＨ Ｉ和 Ｐｓｔ Ｉ双酶切产物ꎮ
Ｆｉｇ. １０ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００＋
ＮｅＭＴ２ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ Ｍ. ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ １. Ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００＋ＮｅＭＴ２ꎻ ２. Ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００＋ＮｅＭＴ２ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ ＢａｍＨ Ｉꎻ ３. Ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００＋ＮｅＭＴ２
ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ＢａｍＨ Ｉ ａｎｄ Ｐｓｔ Ｉ.
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ｔｕｍ Ｍｏｅｎｃｈ) ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ￣ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ (ＭＴ３) ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
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